吳 佳，陳 朗，姜 濤，黃國(guó)明，李 倬，李耀東，張 麗，劉麗霞

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖的重要疾病，對(duì)奶牛生產(chǎn)造成巨大的危害和經(jīng)濟(jì)損失，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者已對(duì)其防治進(jìn)行了深入研究，研發(fā)了大量的診斷方法、治療藥物(如抗生素、中草藥及其制劑)、新型飼料添加劑、疫苗和基因工程產(chǎn)品等。從分子遺傳育種的角度進(jìn)行乳房炎的抗病育種已成為一種新型的疾病防治手段[1]，研究表明，集落刺激因子3(CSF3)在乳腺炎易感奶牛群體中高表達(dá)，表明該基因可作為奶牛乳腺炎抗性研究候選基因群[2]。

CSF3是一種具有抗炎作用的保護(hù)性細(xì)胞因子，被認(rèn)為是中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，對(duì)于清除細(xì)菌病原體以及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)至關(guān)重要[3]。魏玉好[4]指出，CSF3與乳腺上皮細(xì)胞(MECs)炎癥免疫密切相關(guān)，CSF3基因具有特異性受體，在成熟中性粒細(xì)胞中高度表達(dá)。細(xì)菌感染期間宿主防御炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度與CSF3受體(CSF3R，或CD114/G-CSFR)信號(hào)有直接關(guān)系[5]。Hollmén等[6]確定了G-CSF在調(diào)節(jié)人和小鼠腫瘤中抗炎單核細(xì)胞和TAM表型中的重要作用，表現(xiàn)為侵襲性乳腺癌分泌大量的G-CSF，通過(guò)將TGF-α分泌增強(qiáng)的抗炎表型轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤，浸潤(rùn)的單核細(xì)胞，以促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。CSF3基因中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)可能對(duì)CSF3蛋白功能具有有害作用，而且在dbFNP數(shù)據(jù)庫(kù)中CSF3基因的所有SNP中有18.9%存在于編碼區(qū)(CDS)中[7]。對(duì)CSF3基因研究有助于進(jìn)一步分析SNP位點(diǎn)與奶牛疾病的關(guān)聯(lián)性，探討該基因?qū)δ膛＜膊〉恼{(diào)控作用。

本研究通過(guò)采用DNA池和直接測(cè)序法對(duì)奶牛CSF3基因遺傳多態(tài)性進(jìn)行快速篩查，確定了CSF3基因的SNP位點(diǎn)，估算了各SNP的等位基因頻率，并對(duì)該基因的特性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，為奶牛乳房炎相關(guān)分子標(biāo)記篩選提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 奶牛血樣采集及基因組DNA提取

奶牛的血樣采自寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司，以隨機(jī)抽樣的方法對(duì)303頭奶牛進(jìn)行尾靜脈采集全血10 mL，采用常規(guī)苯酚-氯仿法提取基因組DNA，所提取的DNA以0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，并利用紫外分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行純度測(cè)定。

1.2 CSF3基因的引物設(shè)計(jì)及合成

參照NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中奶牛的CSF3基因序列(NCBI登錄號(hào)：NM_174028.1)，利用NCBI上的Primer-BLAST在線工具軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。將CSF3基因上分成3段擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為363、469、671 bp。引物由天津金唯智生物公司合成，引物信息見(jiàn)表1。

1.3 混合池的構(gòu)建與PCR擴(kuò)增

選取300個(gè)奶牛為DNA樣品，將奶牛DNA樣品濃度均調(diào)整為100 ng·μL-1，每50個(gè)樣品各取1 μL構(gòu)建一個(gè)DNA混合池，以混合池DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：PCR反應(yīng)總體積20 μL，2×PowerTaqPCR Master Mix 11 μL，混合DNA 0.8 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，滅菌超純水補(bǔ)至20 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火60 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，特異性好的擴(kuò)增產(chǎn)物保存于-20 ℃冰箱備用。

表1CSF3基因引物信息

Table 1 Primer information ofCSF3 gene

位置Location引物序列Primer sequence (5′→3′)退火溫度Annealing temperature/℃預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度Expected amplified fragment length/bpP1F: CTGGTCCCTGACAGAACCCR:GCTGGCCTCCCTCACTCA60363P2F:GCTCCTGGGTCCTTCCTTTCR:ACCCTCATGGCGTCTCTAGT60469P3F:TTAAGGGCAGAACTGAGCTGGR:TTGGGAGACTTCCCGATGCT60671

外顯子1和外顯子2為P1，外顯子3和外顯子4為P2，外顯子5為P3。

Exon 1 and exon 2 were P1， exon 3 and exon 4 were P2， and exon 5 was P3.

1.4 序列測(cè)定與分析

挑選效果良好的樣品送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行純化后雙向測(cè)序，利用Editseq和MEGA6.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)拼接，篩選CSF3基因SNP位點(diǎn)。

1.5 等位基因頻率估算

利用MWSnap軟件的度量尺工具對(duì)CSF3基因測(cè)序峰圖中各SNP位點(diǎn)的峰高進(jìn)行測(cè)量記錄，并估算等位基因頻率[8]

HAB=VA(VB)/(VA+VB)。

SNP位點(diǎn)中A或者B等位基因的頻率由HAB表示，等位基因在SNP位點(diǎn)中的峰圖峰高用VA或VB表示。

1.6 生物信息學(xué)分析軟件

奶牛CSF3基因相關(guān)生物信息學(xué)分析軟件如下[9]：mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuiteRNAfold.cgi?tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg；ORF區(qū)開(kāi)放閱讀框，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html；蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析，http://web.expasy.org/protparam/；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html；蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，http://swissmodel.expasy.org/和PyMOL軟件；編碼蛋白質(zhì)信號(hào)肽跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)，http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛CSF3基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

將CSF3基因分3段進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，引物特異性良好，3段目的基因片段大小符合要求。

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列測(cè)定比對(duì)

奶牛CSF3基因與NCBI中的該基因序列(NM_174028.1)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖2、圖3所示,奶牛CSF3基因共有3個(gè)SNP位點(diǎn)，均位于外顯子2上，分別為T(mén)66C、C67A、C118A，全部為錯(cuò)義突變，分別導(dǎo)致絲氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)變?yōu)榻M氨酸(His)[10]。

M，DL 2000 marker；1，外顯子1和外顯子2PCR產(chǎn)物；2，外顯子3和外顯子4PCR產(chǎn)物；3，外顯子5 PCR產(chǎn)物。M， DL 2000 marker; 1， Exon 1 and exon 2 PCR products; 2， Exon 3 and exon 4 PCR products; 3， Exon 5 PCR product.圖1 奶牛CSF3基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)Fig.1 Detection of PCR amplification products of CSF3 gene in dairy cow

圖2 奶牛CSF3基因擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)Fig.2 SNP locus found in sequencing of cow CSF3 gene amplification products

圖3 奶牛CSF3基因突變位點(diǎn)示意圖Fig.3 Schematic diagram of CSF3 gene mutation site in dairy cow

2.3 奶牛CSF3基因SNP位點(diǎn)基因頻率

用MWSnap軟件的測(cè)量尺對(duì)該基因各位點(diǎn)峰圖峰高進(jìn)行測(cè)量，根據(jù)估算公式計(jì)算出各等位基因頻率。經(jīng)計(jì)算得，C67A、C118A位點(diǎn)中等位基因C均為優(yōu)勢(shì)等位基因，在T66C中的T等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因(表2)。

2.4 奶牛CSF3基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

在NCBI中對(duì)奶牛CSF3基因(登錄號(hào)NM_174028.1)突變前后預(yù)測(cè)對(duì)比結(jié)果如圖4所示，C118A的自由能略有增加，為-591.50 kcal·mol-1，而T66C、C67A的自由能略有降低，分別為-592.70、-593.40 kcal·mol-1，使mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性發(fā)生了變化，在一定程度上影響蛋白質(zhì)的翻譯[11]。

2.5 奶牛CSF3基因序列的開(kāi)放閱讀框

表2 奶牛CSF3基因SNP位點(diǎn)基因頻率

Table 2CSF3 gene SNP locus gene frequency

SNPs所處位置Location等位基因頻率Allele frequencyT66C外顯子2 Exon 2T(0.79)C(0.21)C67A外顯子2 Exon 2C(0.78)A(0.22)C118A外顯子2 Exon 2C(0.67)A(0.33)

野生型為奶牛CSF3基因突變前預(yù)測(cè)結(jié)果圖。Wild type is the predicted result of CSF3 gene mutation in dairy cows.圖4 奶牛CSF3基因各個(gè)位點(diǎn)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Secondary structure of mRNA in various sites of CSF3 gene in dairy cow

開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)是DNA上的一段堿基序列，有完整的起始密碼子和終止密碼子序列，因而編碼一個(gè)蛋白[7]。分析結(jié)果顯示，有588 bp的完整開(kāi)放閱讀框，5′端起始密碼子是ATG，3′端終止密碼子是TGA，編碼195個(gè)氨基酸。

圖5 奶牛CSF3基因ORF區(qū)開(kāi)放閱讀框分析Fig.5 Analysis of open reading frame of ORF region of dairy cow CSF3 gene

2.6 奶牛CSF3基因編碼氨基酸理化性質(zhì)分析

運(yùn)用Expasy服務(wù)器上的protparam程序預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6所示，奶牛CSF3基因編碼195個(gè)氨基酸，21種氨基酸中亮氨酸(Leu)數(shù)目最多，占整個(gè)氨基酸組成的20.5%，負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為15，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為13，其分子式為C962H1538N262O271S10，相對(duì)分子質(zhì)量為21 430.99 ku，半衰期為30 h，脂肪指數(shù)為109.18，親水性的平均值為0.156，基因編碼產(chǎn)物不穩(wěn)定指數(shù)為62.42，大于40，顯示該基因編碼產(chǎn)物不穩(wěn)定[12]。

2.7 奶牛CSF3基因編碼蛋白質(zhì)信號(hào)肽跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)

奶牛CSF3基因編碼產(chǎn)物C值為0.034 8，Y值為0.458 8，S值為0.965 2，其切割位點(diǎn)于20～21位的氨基酸之間，基本可以斷定CSF3基因編碼產(chǎn)物存在信號(hào)肽(圖7)。

2.8 奶牛CSF3基因編碼蛋白質(zhì)親/疏水性分析

利用Expasy服務(wù)器上的Protscale程序預(yù)測(cè)奶牛CSF3基因編碼蛋白質(zhì)的疏水性，其中第10位異亮氨酸(Ile)疏水性最強(qiáng)(+ 4.500)；第2位的精氨酸(Arg)親水性最強(qiáng)(-4.500)。在整條氨基酸肽鏈中，最大值為2.300，最小值為-1.322，平均親疏水性分值為-0.99，表現(xiàn)為親水性(圖8)。因此，可推斷CSF3基因編碼的蛋白質(zhì)是一種可溶性蛋白[13]。

2.9 奶牛CSF3基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

奶牛CSF3基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖9所示，其中α-螺旋(h)占48.72%，β-折疊(e)占11.79%，無(wú)規(guī)則卷曲(c)占39.49%，編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中，h和c占主導(dǎo)地位。

圖6 奶牛CSF3基因編碼蛋白質(zhì)氨基酸組成Fig.6 Amino acid composition of protein encoded by CSF3 gene in dairy cow

圖7 奶牛CSF3基因編碼蛋白質(zhì)信號(hào)肽跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction of transmembrane region of protein signal peptide encoded by dairy cow CSF3 gene

圖8 奶牛CSF3基因編碼氨基酸序列親/疏水性預(yù)測(cè)Fig.8 Prediction of amino acid sequence affinity/hydrophobicity of dairy cow CSF3 gene

運(yùn)用SWISS MODEL進(jìn)行建模得以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖10)，其組分有3種，主要成分為h和c，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致[9]。

3 討論

CSF3基因在哺乳動(dòng)物上具有較豐富的多態(tài)性，對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析可以提供物種的遺傳多樣性信息，對(duì)動(dòng)物種質(zhì)資源的保護(hù)和利用具有重要的生物學(xué)意義。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于人、雞、小鼠等動(dòng)物CSF3基因的研究已有報(bào)道[14-16]，張?zhí)斓萚17]發(fā)現(xiàn)GM-CSF3對(duì)化療期間乳腺癌患者BCR-CDR3受體庫(kù)有影響。趙淑清等[18]研究表明，CSF3是體內(nèi)非常重要的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能夠調(diào)節(jié)粒系細(xì)胞的增殖、分化與存活，誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫耐受，可以抑制急性移植物抗宿主病的發(fā)生。張燦[16]發(fā)現(xiàn)，小鼠GM-CSF3基因與GenBank中的序列相比存在點(diǎn)變異，α-螺旋在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的占比在50%以上，有1～2個(gè)糖基化位點(diǎn)。本研究表明，CSF3基因中有3個(gè)SNP位點(diǎn)，全部為錯(cuò)義突變，突變位點(diǎn)使mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而在某種程度上影響基因編碼產(chǎn)物[19-20]。

h，α-螺旋；e，β-折疊；c，無(wú)規(guī)則卷曲。h， α-helix; e， β-sheet; c， Random coli.圖9 奶牛CSF3基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.9 Prediction results of secondary structure of protein encoded by CSF3 gene in dairy cow

圖10 奶牛CSF3基因編碼蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.10 Dairy cow CSF3 gene encoding protein tertiary structure prediction results

蛋白質(zhì)是生物功能的主要載體，而氨基酸是蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子。氨基酸的內(nèi)在性質(zhì)在一定程度上影響著蛋白質(zhì)的功能?；蛲蛔兾稽c(diǎn)可能通過(guò)影響編碼氨基酸序列，間接影響相關(guān)蛋白質(zhì)的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的相關(guān)調(diào)控功能[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，在CSF3基因的CDS區(qū)篩選到3個(gè)SNP突變位點(diǎn)，并且全部為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致兩個(gè)氨基酸發(fā)生突變。核苷酸的改變直接影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而結(jié)構(gòu)進(jìn)一步影響蛋白質(zhì)的功能。奶牛CSF3蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲占主導(dǎo)地位，而且占比高達(dá)48.72%和39.49%，奶牛CSF3編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)為混合型，奶牛CSF3蛋白是以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主的混合型蛋白，可能會(huì)對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性造成一定影響[22]。奶牛CSF3蛋白由195個(gè)氨基酸折疊而成，是不穩(wěn)定指數(shù)(Ⅱ)大于40的不穩(wěn)定蛋白，同時(shí)該蛋白的平均親疏水性分值為-0.99，判定奶牛CSF3蛋白質(zhì)是可溶性蛋白。一般情況下，蛋白質(zhì)半衰期越長(zhǎng)則穩(wěn)定性越高，奶牛CSF3編碼產(chǎn)物的半衰期較長(zhǎng)為30 h，卻是不穩(wěn)定蛋白，可能與基因編碼區(qū)的突變位點(diǎn)存在某種關(guān)系[21]。因此，本研究利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)奶牛CSF3基因編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)及序列特征進(jìn)行分析，可為今后深入研究奶牛CSF3的基因功能及乳腺炎的有效防控提供參考資料。