柯義強(qiáng)，郭鵬輝，馬洪鑫，楊許花，高丹丹，*，劉湘君，馬忠仁，丁功濤

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124； 2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730030)

蘭州百合屬球根作物，為多年生單子葉草本植物，是全國(guó)唯一能夠食用的甜百合[1]。蘭州百合色澤潔白如玉、味道甜美、個(gè)頭大、纖維含量低[2-4]，富含秋水仙堿、礦物質(zhì)、微量元素和氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分，具有清熱解毒、潤(rùn)肺美容、止咳化痰、止痛止血、抗癌和增強(qiáng)人體免疫力等作用[5-7]。近年來，隨著其市場(chǎng)需求和種植面積增加，蘭州百合相關(guān)產(chǎn)品的加工也初具規(guī)模。但由于傳統(tǒng)育種存在耗時(shí)長(zhǎng)、耗費(fèi)勞動(dòng)力、受限當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件和地理位置等缺點(diǎn)，使得其不能在短時(shí)間內(nèi)大批量生產(chǎn)，這已成為制約蘭州百合相關(guān)產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的瓶頸[8]。與傳統(tǒng)繁殖方法相比，植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以突破外界環(huán)境與傳統(tǒng)繁殖難生根、年齡效應(yīng)等限制因素[9-10]，能夠保持品種的優(yōu)良特性、縮短育種周期、降低生產(chǎn)成本、提高成活率，滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大批量、高標(biāo)準(zhǔn)的種苗生產(chǎn)要求[11-12]。

本研究以蘭州百合為研究對(duì)象，研究基礎(chǔ)培養(yǎng)基、不同消毒劑與消毒時(shí)間、增殖與生根階段激素種類和濃度對(duì)蘭州百合組培快繁體系建立的影響，探索最適合蘭州百合的消毒方法，以及愈傷組織誘導(dǎo)、發(fā)芽、生根的最佳激素配比，以期為蘭州百合組培苗的工廠化發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

市售蘭州百合，購(gòu)于蘭州市城關(guān)區(qū)榆中街市場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基：MS和1/2 MS培養(yǎng)基。根據(jù)需要添加不同種類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，其中MS培養(yǎng)基中蔗糖為30 g·L-1，1/2 MS培養(yǎng)基中蔗糖為50 g·L-1，2種培養(yǎng)基中各添加瓊脂15 g·L-1，pH為5.8～6.0，培養(yǎng)基在121 ℃滅菌30 min備用。

1.2.2 外植體消毒

取蘭州百合新鮮外植體自來水流水沖洗30 min，再加入洗滌劑沖洗20 min，將外植體切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，置于超凈工作臺(tái)中。采用L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(試驗(yàn)因子與測(cè)試水平見表1)，研究3種不同消毒劑[75%乙醇、次氯酸鈉溶液(有效氯濃度2%)、0.1% HgCl2溶液]相互組合處理對(duì)外植體存活率的影響。所有組合處理過的外植體均接種于含MS培養(yǎng)基的三角瓶中，每個(gè)組合10瓶，每瓶外植體3個(gè)，7 d轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)接3次，于28 d后統(tǒng)計(jì)外植體存活率。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)與叢芽發(fā)生

取存活的外植體分別置于添加不同濃度梯度NAA、6-BA和2，4-D的MS培養(yǎng)基上，室溫下培養(yǎng)。試驗(yàn)采用L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(試驗(yàn)因子與測(cè)試水平見表2)，優(yōu)化激素添加種類和水平。以不加任何激素的MS培養(yǎng)基為對(duì)照組。試驗(yàn)共設(shè)置9個(gè)組合，每個(gè)組合10瓶，每瓶外植體3個(gè)，于28 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率和發(fā)芽率。

1.2.4 不定芽生根

將高2～3 cm，具有3～4片葉的不定芽切下，分別接種到含有不同濃度梯度的NAA、6-BA和活性炭的1/2 MS培養(yǎng)基上，室溫培養(yǎng)，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)(試驗(yàn)因子與測(cè)試水平見表3)，以生根率為指標(biāo)，優(yōu)化植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑添加種類和添加量，以不含任何激素的1/2 MS培養(yǎng)基為對(duì)照組。試驗(yàn)共設(shè)17個(gè)組合，每個(gè)組合10瓶，每瓶3個(gè)外植體，于28 d后統(tǒng)計(jì)生根率。

表1 外植體滅菌的因素與水平

Table 1 Factors and levels for explant sterilization

水平Levels因素FactorsA(75%乙醇75% ethanol)/sB(次氯酸鈉NaClO)/minC(氯化汞HgCl2)/min110103220155330207

表2 愈傷組織誘導(dǎo)與叢芽發(fā)生影響因子和水平

Table 2 Factors and levels for callus induction and clustered shoots induction mg·L-1

水平Levels因素FactorsA(α-萘乙酸NAA)B(6-芐氨基嘌呤6-BA)C(2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D)10.310.120.530.230.750.3

表3 不定芽生根的影響因子與水平

Table 3 Factors and levels for rooting mg·L-1

水平Levels因素FactorsA(α-萘乙酸NAA)B(6-芐氨基腺嘌呤6-BA)C(活性炭Activated carbon)10.31120.53230.753

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS 20.0進(jìn)行方差分析，Design-Expert. V8.0.6.1進(jìn)行響應(yīng)面處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體滅菌

如表4和表5所示，3個(gè)因素對(duì)外植體存活率影響大小依次為75%乙醇>次氯酸鈉>HgCl2，對(duì)照組R值大于HgCl2，小于75%乙醇和次氯酸鈉，說明75%乙醇和次氯酸鈉對(duì)外植體存活率影響顯著。表6顯著性分析也表明，75%乙醇和次氯酸鈉在蘭州百合外植體的滅菌、保證外植體存活方面具有極顯著影響(P<0.01)，而HgCl2的影響較小(P>0.01)。結(jié)果表明，采用75%乙醇和次氯酸鈉溶液消毒外植體是防治污染、保證外植體存活的關(guān)鍵因素。通過以上分析可以看出，防止外植體污染，提高存活率的最佳組合為A2B1，即75%乙醇滅菌20 s+次氯酸鈉溶液浸泡10 min，外植體存活率可達(dá)96.30%。

表4 外植體滅菌存活率正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

Table 4 Orthogonal experiment design and result of explant sterilization survival rate

培養(yǎng)基Medium試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Experiment designABCD存活率Survival rate/%1111117.30±3.09212229.60±2.12313336.30±0.814213296.30±0.815221379.30±7.076232169.60±0.817312384.30±0.818323181.00±2.059331270.00±2.44

表5 極差分析結(jié)果

Table 5 Result of range analysis

因素Factorsk1/%k2/%k3/%R/%最優(yōu)水平Optimal levelA(75%乙醇11.0681.7378.4370.66275% Ethanol)B(次氯酸鈉65.9756.6348.6317.331NaClO)C(氯化汞HgCl2)55.9758.6356.632.662D(對(duì)照Control)55.5354.5061.206.70

2.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)與叢芽發(fā)生的影響

表7為愈傷組織誘導(dǎo)與叢芽發(fā)生正交試驗(yàn)結(jié)果。由表8的R值可以看出，NAA(29.68)和6-BA(18.58)為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的最主要影響因子，其次是2，4-D(5.9)，3個(gè)因素的極差值都大于對(duì)照組(4.42)。由k值可以看出，因素A(NAA)的最優(yōu)水平為A1，因素B(6-BA)的最優(yōu)水平為B2。方差分析(表9)表明NAA和6-BA對(duì)誘導(dǎo)蘭州百合外植體愈傷組織分化有極顯著影響(P<0.01)，2，4-D的影響較小(P>0.01)。同時(shí)NAA和6-BA的平方和遠(yuǎn)大于2，4-D，且大于對(duì)照組，說明誘導(dǎo)外植體愈傷組織分化的最佳激素組合為A1B2，所以愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方為MS+0.3 mg·L-1NAA+3 mg·L-16-BA，愈傷組織誘導(dǎo)率最高達(dá)96.33%。

由表8中k值可以看出，2，4-D對(duì)叢芽發(fā)生的促進(jìn)作用較小，NAA和6-BA是主要的影響因子，3個(gè)因素對(duì)叢芽發(fā)生的影響大小依次為NAA>6-BA>2，4-D。方差分析(表10)顯示，NAA和6-BA對(duì)誘導(dǎo)外植體發(fā)芽方面有極顯著影響(P<0.01)，2，4-D則影響較小(P>0.01)。因此，與誘導(dǎo)外植體愈傷組織分化的最佳激素組合一樣，誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)芽的最佳激素配比也是A1B2，最佳培養(yǎng)基配方為MS+0.3 mg·L-1NAA+3 mg·L-16-BA，發(fā)芽率可達(dá)98.00%。

表6 外植體滅菌存活率方差分析結(jié)果

Table 6 Variance analysis results of explant sterilization survival rate

變異來源Source平方和Sum of squareDf均方Mean squareF顯著性Significance75%乙醇75%CH3CH2OH9 542.9424 771.47825.83??次氯酸鈉 NaClO3451.562225.7839.08??HgCl278.07239.036.76對(duì)照Control11.5625.78R2=0.99

Df，自由度。“**”表示在0.01水平上差異顯著。下同。

Df， Degree of freedom. “**”indicated the significant difference at 0.01 level. The same as below.

2.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽生根的影響

2.3.1 多元二次方程模型的建立與檢驗(yàn)

選擇3個(gè)對(duì)生根影響顯著的因素：NAA、6-BA和活性炭，進(jìn)行蘭州百合不定芽誘導(dǎo)響應(yīng)面分析試驗(yàn)。根據(jù)Box-Beknhen中心組合原理設(shè)計(jì)

表7 愈傷組織誘導(dǎo)與叢芽發(fā)生正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

Table 7 Orthogonal experiment design and result of callus and clustered shoots induction

序號(hào)No.試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Experiment designABCD愈傷組織誘導(dǎo)率Rate of callus induction/%叢芽發(fā)生率Rate of clustered shoots induction/%1111185.30±1.6986.30±0.942122296.33±0.8198.00±0.473133384.30±1.2481.60±0.814212374.00±0.4773.00±1.245223182.00±1.6983.00±1.246231256.00±2.4454.33±1.247313260.00±2.4456.00±1.248321367.30±1.2466.00±0.819332149.60±0.8150.00±0.81

表8 極差分析結(jié)果

Table 8 Result of range analysis了17組試驗(yàn)，包括5組重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果如表11所示。

因素Factors愈傷組織誘導(dǎo)率Rate of callus inductionk1/%k2/%k3/%R/%最優(yōu)水平Optimal level叢芽發(fā)生率Rate of clustered shoots inductionk1/%k2/%k3/%R/%最優(yōu)水平Optimal levelA(NAA)88.6470.6658.9629.68188.6370.1157.3331.301B(6-BA)73.1081.8863.3018.58271.7682.3361.9820.352C(2,4-D)69.5373.3175.435.90368.8773.6773.534.792D(對(duì)照Control)72.3070.7775.204.4273.1069.4473.534.09

表9 愈傷組織誘導(dǎo)率方差分析結(jié)果

Table 9 Analysis of variance of callus induction rate

變異來源Source平方和Sum of squareDf均方Mean squareF顯著性SignificanceA(NAA)1 340.752670.3825.02??B(6-BA)518.162259.089.67??C(2,4-D)30.3215.150.565誤差Error53.58226.791

表10 叢芽發(fā)生率方差分析結(jié)果

Table 10 Analysis of variance of clustered shoots induction rate

變異來源Source平方和Sum of squareDf均方Mean squareF顯著性SignificanceA(NAA)1 486.052743.0233.28??B(6-BA)621.902310.9513.929??C(2,4-D)30.29215.140.678誤差Error44.65222.32

利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對(duì)表11中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到生根率(Y)與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA(A)、6-BA(B)和活性炭(C)的實(shí)際值全變量二次多元回歸方程為：

Y=89.54+4.91B+14.9C-25.28×A2-38.33×B2-21.41×C2。

由表12可以看出，本模型所選用的二次多項(xiàng)模型具有顯著性(P<0.01)，說明該試驗(yàn)方法是可行的。本模型的二次方程能夠模擬真實(shí)3因素3水平的試驗(yàn)結(jié)果，其決定系數(shù)R2=0.925 5，RAdj=0.829 7，說明二次多項(xiàng)模型可解釋92.55%的響應(yīng)值變化，僅有總模型的7.45%不能用該二次多項(xiàng)式解釋，表明此模型擬合度好，解釋本試驗(yàn)方法是可靠的，適合用于蘭州百合的生根優(yōu)化。

由表13可以看出，模型所選用的二次多項(xiàng)式模型在1%水平內(nèi)極顯著(P<0.01)，表明該試驗(yàn)方法是可行的。交互項(xiàng)BC在5%水平內(nèi)顯著(P<0.05)，表明6-BA和活性炭?jī)梢蛩亟换プ饔脤?duì)蘭州百合外植體生根有顯著的影響，A2和B2都在1%水平內(nèi)極顯著(P<0.01)，說明NAA和6-BA對(duì)蘭州百合生根影響極顯著，C2在1%水平內(nèi)不顯著(P>0.05)，說明活性炭對(duì)蘭州百合生根影響較小。

2.3.2 響應(yīng)面分析和優(yōu)化

響應(yīng)曲面圖可直觀反應(yīng)出各因素之間交互作用的強(qiáng)弱，響應(yīng)曲面坡度越陡峭，說明各因素間的交互作用越顯著，響應(yīng)曲面越平緩，說明各因素的交互作用越弱。圖1-A為6-BA和NAA之間的交互作用，當(dāng)6-BA作用濃度一定時(shí)，隨著NAA濃度的增加，生根率先增加后減小，響應(yīng)曲面顯著，有明顯峰值；圖1-B為6-BA和活性炭之間的交互作用，當(dāng)6-BA濃度一定時(shí)，隨著活性炭濃度的增加，生根率先增加后減小，過高的活性炭濃度會(huì)抑制生根率；圖1-C為NAA和活性炭之間的交互作用，生根率隨著兩者濃度的增加先升高后降低，有明顯的最大值。

表11 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table 11 Box-Behnken design and the experimental result

培養(yǎng)基Medium植物激素Plant hormoneA(NAA)/(mg·L-1)B(6-BA)/(mg·L-1)C(活性炭Activated carbon)/(mg·L-1)生根率Rooting rate/%C10.53291.00±2.05C20.51173.30±1.24C30.53294.00±0.47C40.53286.33±0.81C50.33369.60±6.53C60.53287.30±2.05C70.51329.60±6.53C80.75223.00±0.81C90.73356.30±6.53C100.53388.60±2.05C110.55155.00±2.05C120.33130.00±2.05C130.55123.30±0.81C140.73123.00±2.16C150.31225.70±1.88C160.35226.40±0.81C170.71228.00±0.81

表12 二次多項(xiàng)模型方差分析結(jié)果

Table 12 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model

方差來源Source平方和Sum of squareDf均方Mean squareF顯著性Significance模型Model12 093.3891 343.719.66??失擬項(xiàng)Lack of fit935.093311.7032.65純誤差Pure Error38.1849.55總和Cor Total13 066.6616R2=0.925 5RAdj=0.829 7

表13 響應(yīng)面回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

Table13Regression coefficients and their significance of the quadratic model

方差來源Sources of variance平方和Sum of squareDf均方Mean squareFP顯著性Significance模型Model12 093.3891 343.719.660.003 4??A44.65144.650.320.588 6B104.401104.400.750.414 9C426.321426.323.070.123 4AB8.1218.120.060.815 9AC19.36119.360.140.720 1BC1 421.2911 421.2910.220.015 1?A24 260.6614 260.6630.640.000 9??B24 274.0714 274.0730.740.000 9??C2635.511635.514.570.069 8

“**”表示在0.01水平上差異顯著；“*”表示在0.05水平上差異顯著。

“**”indicated the significant difference at 0.01 level; “*”indicated the significant difference at 0.05 level.

圖1 各因素響應(yīng)面3D圖Fig.1 3D response surface of each factor

2.3.3 模型驗(yàn)證試驗(yàn)

Design-Expert. V8.0.6.1軟件分析結(jié)果顯示，各因素的最優(yōu)值為：NAA(A)=0.50 mg·L-1，6-BA(B)=3.13 mg·L-1，活性炭(C)=2.35 mg·L-1，理論生根率為92.29%。但實(shí)際操作中C3培養(yǎng)基的生根率達(dá)94%，超過預(yù)測(cè)值，說明用響應(yīng)面法優(yōu)化蘭州百合外植體生根條件是可行的。

2.4 優(yōu)化后的蘭州百合組培過程

蘭州百合組培主要分為外植體滅菌、愈傷組織誘導(dǎo)、發(fā)芽和生根4部分，圖2是采用本研究?jī)?yōu)化的最佳消毒方法和培養(yǎng)基進(jìn)行蘭州百合組培的結(jié)果。其中，圖2-A中外植體經(jīng)75%乙醇消毒20 s+2%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，未發(fā)生污染；圖2-B和圖2-C為最佳培養(yǎng)基MS+0.3 mg·L-1NAA+3 mg·L-16-BA中蘭州百合外植體的愈傷組織誘導(dǎo)和發(fā)芽情況；圖2-D為最佳培養(yǎng)基1/2 MS+0.5 mg·L-1NAA+3 mg·L-16-BA+2 mg·L-1活性炭中蘭州百合的生根情況。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)中，不對(duì)外植體做任何消毒處理的對(duì)照組存活率幾乎為0%，沒有樣品產(chǎn)生愈傷組織，7 d內(nèi)無外植體存活，但經(jīng)過消毒劑處理的樣品，存活率最高可達(dá)96.30%，這與梁小敏等[13]的研究結(jié)果吻合，說明消毒在組培試驗(yàn)中是控制植物組培死亡率的關(guān)鍵。不同消毒劑組合對(duì)外植體存活率影響不一[14]，常用的消毒劑有乙醇、次氯酸鈉溶液、過氧化氫、HgCl2溶液等[15-17]。本研究使用了3種消毒劑相互組合，通過與對(duì)照組比較，確定外植體消毒的主要影響因素為乙醇和次氯酸鈉溶液，次要影響因素是HgCl2溶液。有報(bào)道指出，最適合垂花百合外植體的消毒劑組合是70%乙醇處理30 s+0.1% HgCl2溶液浸泡12 min[18]，周非[19]研究發(fā)現(xiàn)，藥百合的最佳消毒劑為70%乙醇；本研究結(jié)果與此一致，但本研究中乙醇濃度為75%，另一消毒劑為消毒效果更強(qiáng)的次氯酸鈉溶液，推測(cè)可能是本試驗(yàn)在冬季進(jìn)行，取材不是植物生長(zhǎng)的最佳季節(jié)，相較于HgCl2溶液，次氯酸鈉在溶液中釋放出的氯離子可以更有效的殺死菌體，從而提高外植體存活率。

A，消毒后的外植體；B，愈傷組織誘導(dǎo)；C，叢芽發(fā)生；D，生根誘導(dǎo)。A， Sterilized explants; B， Callus induction; C， Clustered shoots induction; D， Rooting induction.圖2 蘭州百合組培過程Fig.2 Tissue culture of Lanzhou lily

百合植物組織培養(yǎng)過程中較常用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有NAA、6-BA和2，4-D等[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化的試驗(yàn)中，NAA和6-BA是顯著影響因子，2，4-D對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化影響較小，這與前人研究結(jié)果一致。極低濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑就能夠?qū)ν庵搀w生長(zhǎng)起明顯的促進(jìn)作用[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加0.2 mg·L-1的NAA對(duì)百合愈傷組織誘導(dǎo)和發(fā)芽都有明顯的促進(jìn)作用[22]，本試驗(yàn)得出的結(jié)果與此一致；但柳玉晶等[23]發(fā)現(xiàn)，最適合東方百合的NAA質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為1 mg·L-1，這與本試驗(yàn)的結(jié)果相差較大，分析可能原因?yàn)椴煌贩N百合所適用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度略有不同，也可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)是在冬季進(jìn)行的，外植體尚處在休眠期，需要提高NAA的濃度來促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化。研究發(fā)現(xiàn)，普通的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑同樣對(duì)組培苗根的發(fā)育有促進(jìn)作用[24]。本研究在常規(guī)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的基礎(chǔ)上加入活性炭，并用響應(yīng)面分析的方法探究其對(duì)外植體生根的影響。結(jié)果表明，適宜濃度的活性炭可顯著提高外植體的生根率，這是因?yàn)榛钚蕴吭谔峁┌淡h(huán)境的同時(shí)可以有效吸附培養(yǎng)基中的抑制物，這與潘得林等[25]的研究結(jié)果一致。但是當(dāng)濃度不合適時(shí)，反而會(huì)抑制生根率[26-27]，本研究中也遇到了類似問題；例如表11中的C7組合，當(dāng)活性炭濃度最大時(shí)生根率僅有27.60%，C8培養(yǎng)基中生根率僅為23.00%，可能是活性炭在吸附培養(yǎng)基中抑制物的同時(shí)，也會(huì)吸附培養(yǎng)基中的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，導(dǎo)致根系不能吸收足夠的營(yíng)養(yǎng)成分，從而降低生根率?；钚蕴繉?duì)生根培養(yǎng)的具體作用機(jī)理，有待今后進(jìn)一步研究。

綜上，獲得成活率高的組培苗可以從以下2方面著手：第一，盡量選取當(dāng)季新鮮的外植體，外植體消毒可選用不同消毒劑組合消毒，但時(shí)間不可過長(zhǎng)。第二，后續(xù)愈傷組織誘導(dǎo)、發(fā)芽和生根的過程中，組培苗對(duì)激素的反應(yīng)較靈敏，選擇合適的激素濃度配比會(huì)顯著提高成活率。