王 燚，魏運(yùn)民，余世田，韓蓉蓉，頡永紅，劉盧生，蔣曹德，玉永雄，*

(1.西南大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400715; 2.重慶市高校草食動(dòng)物工程中心，重慶 400715)

酸性土壤(pH<5.0)約占全世界潛在可耕種土地的40%～50%[1]，植物在酸性土壤中生長(zhǎng)受到鋁毒、酸害、低磷等因子脅迫，而鋁毒害是酸性土壤中限制作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的關(guān)鍵因子[2]。研究表明，鋁在酸性土壤中主要以離子形式存在，并富集在植物根系的分生區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)[3]。游離的Al3+能通過(guò)誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)引起活性氧損傷[4]、破壞細(xì)胞骨架[5]等過(guò)程阻止細(xì)胞分裂，從而抑制根的生長(zhǎng)。目前生產(chǎn)上主要采用大量施加石灰來(lái)緩解土壤酸性的方法，成本高且容易造成土壤板結(jié)，相比之下，理解植物適應(yīng)鋁脅迫的分子機(jī)制，利用抗鋁基因培育耐鋁性強(qiáng)的農(nóng)作物新品種是解決酸性土壤鋁毒問(wèn)題的長(zhǎng)效策略[6]。

多年研究表明，植物主要有2種耐鋁機(jī)制[7-8]：(1)鋁耐受機(jī)制，即鋁進(jìn)入植物后被解毒和隔離于液泡，如鋁敏感蛋白3(aluminum sensitive protein 3， ALS3)是植物耐鋁所必需的蛋白[9]，能將進(jìn)入細(xì)胞的鋁離子轉(zhuǎn)移至液泡，減輕鋁毒害；(2)鋁排斥機(jī)制，目前最典型的鋁排斥機(jī)制是鋁誘導(dǎo)根系分泌有機(jī)酸(organic acid，OA)，螯合根際Al3+形成無(wú)毒化合物，防止鋁離子進(jìn)入根尖細(xì)胞。檸檬酸是鋁離子的強(qiáng)效螯合劑，其分泌受多藥與毒性復(fù)合物的排出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(multidrug and toxic compound extrus-ion protein，MATE)影響[10]。

發(fā)育調(diào)節(jié)質(zhì)膜多肽(DREPP)是一類植物特異性蛋白，參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育與逆境應(yīng)答過(guò)程，在植物抗逆過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11-12]。Kochian等[13]發(fā)現(xiàn)，擬南芥(Arabidopsisthaliana)中DREPP家族蛋白AtPCaP2(plasma membrane-associated cation binding protein 2)在干旱脅迫下對(duì)種子的萌發(fā)有正向調(diào)節(jié)作用，且過(guò)表達(dá)該基因能通過(guò)參與生長(zhǎng)激素調(diào)節(jié)增強(qiáng)擬南芥對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性。低溫脅迫下AtPCaP2也可通過(guò)激活cbf介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在寒冷脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[14]。水稻(OryzasativaL.)中DREPP同源基因OsDREPP2的表達(dá)與鹽脅迫相關(guān)，鹽脅迫下OsDREPP2在耐鹽品種中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于鹽敏感品種[15]。DREPP蛋白家族成員PtBP1(peaT1 binding protein 1)可以誘導(dǎo)植物的防御反應(yīng)[16]。但有關(guān)DREPP基因在植物耐鋁方面的作用還未見報(bào)道。

丹波黑大豆是原產(chǎn)于日本的耐鋁大豆品種[17]。本研究室在前期試驗(yàn)中測(cè)定的丹波黑大豆在酸性土壤條件下根尖芯片組數(shù)據(jù)和鋁脅迫條件下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，GmDREPP基因的表達(dá)量均明顯上調(diào)，由此推測(cè)該基因與植物耐鋁相關(guān)，但其耐鋁功能尚不明確。為此，本研究以日本丹波黑大豆為試驗(yàn)材料，克隆GmDREPP基因，構(gòu)建pCXSN-GmDREPP過(guò)表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化煙草，并研究鑒定該基因的耐鋁性，以期為培育耐鋁新品種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

本研究所用的耐鋁品種丹波黑大豆由日本引進(jìn)，轉(zhuǎn)基因用煙草為實(shí)驗(yàn)室保存的無(wú)菌苗。

1.1.2 主要試劑

大腸埃希菌(Escherichiacoli)感受態(tài)DH5α(北京天恩澤生物技術(shù)有限公司)；農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)感受態(tài)GV3101(唯地生物技術(shù)有限公司)；RNA提取試劑RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大連)；半定量PCR酶Taq、高保真酶Prime STAR、熒光定量PCR酶SYBR Premix ExTaqⅡ、T4DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶XcmⅠ(TaKaRa，大連)；膠回收試劑盒Gel Extraction Kit(Omega，美國(guó))；質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit I(Omega，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 植物材料培養(yǎng)

25 ℃避光萌發(fā)丹波黑大豆(Glycinemaxcv. Tamba)種子，待其發(fā)芽2 d后轉(zhuǎn)至霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)選用本實(shí)驗(yàn)室保存的煙草無(wú)菌苗葉片為外植體。耐鋁比較試驗(yàn)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行扦插水培，生根后培養(yǎng)與丹波黑大豆一致。

1.2.2 目的基因克隆與生物信息學(xué)分析

根據(jù)基因組序列設(shè)計(jì)引物(表1)，PCR擴(kuò)增采用高保真酶Primer STAR，回收片段連接T載體后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，挑取陽(yáng)性菌落搖菌送出測(cè)序并確認(rèn)。

將獲得的GmDREPP基因的CDS序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析(表2)，并進(jìn)行BLAST比對(duì)，挑選同源性較高的序列比對(duì)后用MEGA7.0構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.3 鋁脅迫下丹波黑大豆GmDREPP的表達(dá)分析

用0.5 mmol·L-1CaCl2對(duì)培養(yǎng)2周的丹波黑大豆預(yù)處理24 h，然后選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)3次。在50 μmol·L-1AlCl3(pH 4.5、0.5 mmol·L-1CaCl2)條件下進(jìn)行不同組織、不同根段和不同處理時(shí)間3個(gè)試驗(yàn)：(1)不同組織試驗(yàn)，處理24 h后取植株根、莖、葉、子葉測(cè)定；(2)根的不同區(qū)段試驗(yàn)，處理24 h后取距根尖0～2、2～4、4～6 cm的3個(gè)區(qū)段測(cè)定；(3)不同處理時(shí)間試驗(yàn)，處理0、3、6、9、12、15、18、21、24 h分別取根測(cè)定。另外，進(jìn)行不同濃度試驗(yàn)：分別用0、25、50、75、100 μmol·L-1AlCl3(pH 4.5、0.5 mmol·L-1CaCl2)處理24 h后取根測(cè)定。采取的根、根段或組織用液氮速凍備用。然后分別提取RNA，用于qRT-PCR。

表1 引物序列及其用途

Table 1 Primer sequence and purpose

引物Primer 引物序列(5′—3′)Primer sequence (5′—3′)用途PurposeGmDREPP-FGmDREPP-RATGGGTTATTGGAAGTCTAAGGTCAAGGCTTTGGTGGTTCTG基因克隆、半定量RT-PCR、載體構(gòu)建Gene cloning, semi-quantitative RT-PCR, vector constructionqRTGmDREPP-FCAGTCAAGGAATTGTGACGTTT熒光定量qRTGmDREPP-RCAAACAGGACTTCCATAATGGCFluorescent quantitation18S rRNA-FATGATAACTCGACGGATCGC大豆內(nèi)參18S rRNA-RCTTGGATGTGGTAGCCGTTTSoybean reference geneβ-actin-FTCCGGCGACGGTGTCTCACA煙草內(nèi)參β-actin-RCGCGGACAATTTCCCGTTCAGCTobacco reference geneNtMATE-FCAGCATTGTGTTCTTGCTCATTC熒光定量NtMATE-RGCCTATCCTCCCGAAACCAFluorescent quantitationNtALS3-FTCGCGATGACATCAAGATACAA熒光定量NtALS3-RCAGGAGATAGAGCAATAACCAACGAFluorescent quantitation

表2 生物信息學(xué)分析工具與數(shù)據(jù)庫(kù)

Table 2 Bioinformatics analysis tools and databases

項(xiàng)目Item名稱Name網(wǎng)站W(wǎng)ebsite同源序列Homologous sequenceBLASThttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi理化性Physical and chemical propertiesProtParamhttps://web.expasy.org/protparam/二級(jí)結(jié)構(gòu)Secondary structureSOPMAhttps://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html三級(jí)結(jié)構(gòu)Tertiary structurePDBhttps://www.rcsb.org/跨膜區(qū)Transmembrane areaTMHMMhttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/信號(hào)肽Signal peptideSingalPhttp://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/功能結(jié)構(gòu)域Functional domainCDDhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi

1.2.4 構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體

用XcmⅠ對(duì)pCXSN載體進(jìn)行酶切并回收。以丹波黑大豆cDNA為模板，DREPP-F、DREPP-R為引物，高保真酶Primer STAR進(jìn)行擴(kuò)增，回收片段進(jìn)行加A實(shí)驗(yàn)(72 ℃，1 h)后再回收?；厥债a(chǎn)物與酶切回收的pCXSN載體用Solution I在16 ℃連接12 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α。根據(jù)菌落PCR檢測(cè)結(jié)果，挑取陽(yáng)性菌落培養(yǎng)提取質(zhì)粒pCXSN-GmDREPP，酶切檢測(cè)后送出測(cè)序驗(yàn)證，確認(rèn)獲得植物表達(dá)載體pCXSN-GmDREPP。

1.2.5 遺傳轉(zhuǎn)化煙草并篩選轉(zhuǎn)基因植株

將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pCXSN-GmDREPP通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，待形成菌落后進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，挑取陽(yáng)性菌落培養(yǎng)后侵染煙草。選取在篩選培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)良好的煙草植株，先后提取其DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，RNA作為模板反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選轉(zhuǎn)基因煙草植株。

1.3 轉(zhuǎn)基因煙草的耐鋁性鑒定

1.3.1 煙草根相對(duì)伸長(zhǎng)率的測(cè)定

將野生型(wild type，WT)和轉(zhuǎn)基因煙草1代種子用75%乙醇和30%次氯酸鈉溶液消毒滅菌后置于1/2MS培養(yǎng)基上至萌發(fā)，挑取萌發(fā)后長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗轉(zhuǎn)移至含50 μmol·L-1AlCl3的1/2MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，2周后觀測(cè)根長(zhǎng)并記錄。相對(duì)伸長(zhǎng)率(%)=50 μmol·L-1AlCl3(pH 4.5、0.5 mmol·L-1CaCl2)條件下根的伸長(zhǎng)量/無(wú)鋁脅迫條件下根的伸長(zhǎng)量×100。

1.3.2 過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定

煙草水培2周，選取根生長(zhǎng)一致的WT和轉(zhuǎn)基因煙草，50 μmol·L-1AlCl3(pH 4.5，0.5 mmol·L-1CaCl2)條件下處理24 h，取煙草根尖，用過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司)分別測(cè)定轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶活性。

1.3.3 檸檬酸分泌量測(cè)定

預(yù)培養(yǎng)煙草2周，取根生長(zhǎng)一致的WT和轉(zhuǎn)基因煙草在50 μmol·L-1AlCl3(pH 4.5，0.5 mmol·L-1CaCl2)條件下處理24 h，測(cè)煙草根質(zhì)量。用檸檬酸(CA)ELISA試劑盒(江西江藍(lán)純生物試劑有限公司)測(cè)定處理液中的檸檬酸含量，即為轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的檸檬酸分泌量。

1.3.4 丙二醛(MDA)含量測(cè)定

煙草預(yù)先水培2周，選取根生長(zhǎng)一致的WT和轉(zhuǎn)基因煙草，在50 μmol·L-1AlCl3(pH 4.5，0.5 mmol·L-1CaCl2)條件下處理24 h，取煙草根尖，用丙二醛(MDA)含量試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司)，分別測(cè)定轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草根中的MDA含量。

1.3.5 過(guò)表達(dá)煙草中耐鋁相關(guān)基因的表達(dá)分析

為了解過(guò)表達(dá)GmDREPP對(duì)煙草耐鋁重要基因NtALS3和NtMATE的影響，根據(jù)煙草基因組序列設(shè)計(jì)引物(表1)，以長(zhǎng)勢(shì)一致的轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的根為樣品，提取RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行qRT-PCR。

1.3.6 伊文思藍(lán)和蘇木精對(duì)煙草根尖染色

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的水培WT和轉(zhuǎn)基因煙草苗，在50 μmol·L-1AlCl3(pH 4.5，0.5 mmol·L-1CaCl2)溶液中處理24 h，分別在伊文思藍(lán)和蘇木精染液中染色30 min，待洗去根尖表面的染液后置于體視鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmDREPP基因的克隆與序列分析

擴(kuò)增所得目的片段與預(yù)測(cè)大小基本一致，目的片段經(jīng)純化回收，連接pMD19-T 載體后測(cè)序，結(jié)果如圖1所示。該序列全長(zhǎng)624 bp，編碼207個(gè)氨基酸，是一個(gè)完整的開放閱讀框。根據(jù)BLAST比對(duì)結(jié)果推測(cè)該基因是丹波黑大豆DREPP基因，命名為GmDREPP。

Prot Param在線工具預(yù)測(cè)分析，GmDREPP蛋白分子式為C1028H1646N254O346S1，相對(duì)分子質(zhì)量23 131.93，理論等電點(diǎn)4.95；氨基酸組成中谷氨酸占比最高(21.3%)，賴氨酸和丙氨酸占比17.4%、10.1%，精氨酸和色氨酸占比最低(0.5%)。

atg，起始密碼子；-，終止密碼子。atg， Initiation codon; -， Termination codon.圖1 GmDREPP的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and predicted amino acid sequences of GmDREPP

該蛋白的正、負(fù)電荷的殘基均為0；不穩(wěn)定系數(shù)50.26(>40)，表明GmDREPP為不穩(wěn)定蛋白。

2.2 生物信息學(xué)分析結(jié)果

SingalP軟件預(yù)測(cè)GmDREPP蛋白存在信號(hào)肽的可能性極低，為0.04%。經(jīng)TMHMM軟件預(yù)測(cè)GmDREPP蛋白無(wú)跨膜區(qū)，該蛋白1～207位氨基酸均位于細(xì)胞表面。CDD在線分析認(rèn)為GmDREPP蛋白第1～185位氨基酸形成其唯一一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，且與DREPP家族蛋白功能結(jié)構(gòu)域基本吻合。SOPMA軟件預(yù)測(cè)GmDREPP蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋占比58.94%，延伸鏈占比4.83%，β轉(zhuǎn)角占比2.90%，無(wú)規(guī)則卷曲占比33.33%(圖2)。利用PDB軟件預(yù)測(cè)GmDREPP蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3所示。

2.3 GmDREPP蛋白的進(jìn)化樹分析

用BlastP比對(duì)GmDREPP的氨基酸序列，用軟件MEGA 7.0取同源性大于70%的氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(圖4)。如圖所示，丹波黑大豆的蛋白序列與大豆(Glycinemax)、菜豆(Phaseolusvulgaris)和豇豆(Vignaunguiculata)的DREPP蛋白序列在進(jìn)化分枝中親緣關(guān)系較近，且與另外15種豆科植物聚為一枝，表明GmDREPP在同一科中同源性很高。

圖中藍(lán)色線條表示α-螺旋，紅色線條表示延伸鏈，綠色線條表示β-轉(zhuǎn)角，紫色線條表示無(wú)規(guī)則卷曲。Blue lines represented alpha helixs， red lines represented extend strands， green lines represent beta turns， and the purple lines represented random coils in the figure.圖2 GmDREPP蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Secondary structure prediction of GmDREPP

圖3 GmDREPP 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.3 Predicted 3D structure of GmDREPP

2.4 GmDREPP基因表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果表明，不同濃度AlCl3處理24 h后，隨鋁濃度的升高，丹波黑大豆根系中GmDREPP的表達(dá)量隨鋁濃度的升高而上升，且Al3+濃度高于50 μmol·L-1后其表達(dá)量無(wú)顯著變化(圖5-A)。50 μmol·L-1AlCl3(pH 4.5，0.5 mmol·L-1CaCl2)條件下處理24 h后，GmDREPP在丹波黑大豆的根、莖、葉、子葉中的表達(dá)量存在顯著差異，表達(dá)量由高到低分別為莖、根、子葉和葉(圖5-B)，根的3個(gè)區(qū)段中又以根尖0～2 cm表達(dá)量最高(圖5-C)，且根系GmDREPP的表達(dá)量在處理12 h后趨于穩(wěn)定(圖5-D)。

紅色方框處是丹波黑大豆的GmDREPP蛋白。GmDREPP of Tamba Black soybean was showed in the red box.圖4 GmDREPP蛋白的進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree of GmDREPP

A，不同濃度Al3+處理24 h大豆根中GmDREPP的表達(dá)量；B，GmDREPP在大豆根、莖、葉和子葉中的相對(duì)表達(dá)水平；C，GmDREPP在根不同區(qū)段的相對(duì)表達(dá)水平；D，50 μmol·L-1 Al3+處理下不同時(shí)間大豆根尖GmDREPP表達(dá)量。不同柱上無(wú)相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，無(wú)相同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。A， Expression of GmDREPP in soybean roots under different concentrations of Al3+ for 24 h; B， Relative expression level of GmDREPP in roots， stems， leaves and cotyledon of soybean; C， Relative expression level of GmDREPP in roots different segments; D， Time course of GmDREPP expression in soybean roots in response to 50 μmol·L-1 Al3+ treatment. Different lowercase and uppercase letters above the columns represent significant differences among treatments at P<0.05 and P<0.01， respectively. The same as below.圖5 GmDREPP的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Expression analysis of GmDREPP gene

2.5 表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因煙草的篩選

將構(gòu)建好的質(zhì)粒pCXSN-GmDREPP(圖6)經(jīng)單酶切電泳檢測(cè)后送華大基因測(cè)序，驗(yàn)證結(jié)果表明已獲得全長(zhǎng)CDS序列。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，待形成菌落后進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，挑取陽(yáng)性菌落培養(yǎng)后遺傳轉(zhuǎn)化煙草，培養(yǎng)獲得煙草植株42株。根據(jù)提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得7株陽(yáng)性植株(圖7-A)。提取陽(yáng)性植株RNA反轉(zhuǎn)錄所得cDNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，獲得5株有表達(dá)活性的植株(圖7-B)，并從中選取3個(gè)表達(dá)水平較高的植株，即圖7中9、6、4號(hào)轉(zhuǎn)基因株系GmDREPP-2、GmDREPP-4、GmDREPP-5，測(cè)定相對(duì)表達(dá)量(圖8)并進(jìn)行耐鋁性分析。

2.6 耐鋁性檢測(cè)

2.6.1 轉(zhuǎn)基因?qū)︿X脅迫下煙草根系的影響

無(wú)鋁脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因煙草GmDREPP-2、GmDREPP-4、GmDREPP-5與WT煙草根系生長(zhǎng)狀況良好，根的伸長(zhǎng)量無(wú)明顯差異(圖9-A)。鋁脅迫下，煙草根系生長(zhǎng)均受抑制，但3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的根明顯較WT長(zhǎng)(圖9-B)，根的相對(duì)伸長(zhǎng)量顯著(P<0.05)高于野生型(圖9-C)，GmDREPP過(guò)表達(dá)的煙草植株較野生型植株高大。這一結(jié)果表明，GmDREPP在煙草中的過(guò)表達(dá)減輕了鋁脅迫對(duì)煙草根系生長(zhǎng)的抑制作用。

圖6 植物過(guò)表達(dá)載體pCXSN-GmDREPP結(jié)構(gòu)示意圖Fig.6 Diagram structure of plant overexpression vector pCXSN-GmDREPP

A，GmDREPP基因DNA水平的檢測(cè)；B，GmDREPP基因mRNA水平的檢測(cè)。1，轉(zhuǎn)pCXSN載體煙草；2，WT；3～9，轉(zhuǎn)基因煙草株；9，GmDREPP-2；4，GmDREPP-4；6，GmDREPP-5。A， Detection of DNA level of GmDREPP; B， Detection of mRNA level of GmDREPP. 1， Transgenic tobacco with pCXSN vector; 2， WT; 3-9， Transgenic tobacco lines; 9， GmDREPP-2; 4， GmDREPP-4; 6， GmDREPP-5.圖7 轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性植株篩選Fig.7 Screening of transgenic tobacco plants

圖8 轉(zhuǎn)基因煙草GmDREPP的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression of GmDREPP in transgenic tobacco

2.6.2 鋁脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因植株根系抗氧化的影響

如圖10所示，與WT相比，鋁處理24 h后轉(zhuǎn)基因株系的POD、SOD活性顯著(P<0.05)上升，產(chǎn)生MDA的量更少。這種變化說(shuō)明，鋁脅迫下煙草過(guò)表達(dá)GmDREPP能提高根系POD、SOD活性，降低根尖MDA含量。

A，無(wú)鋁條件下煙草根系伸長(zhǎng)量；B，Al脅迫(50 μmol·L-1)下煙草根系伸長(zhǎng)量；C，煙草相對(duì)根系伸長(zhǎng)率。A， Root elongation of tobacco without Al; B， Root elongation of tobacco under aluminum stress (50 μmol·L-1); C， Relative root elongation of tobacco.圖9 過(guò)表達(dá)GmDREPP對(duì)鋁脅迫下煙草根系的影響Fig.9 Effects of overexpression GmDREPP on root system of tobacco under aluminum stress

數(shù)據(jù)以鮮質(zhì)量計(jì)。下同。Data was detected based on fresh weight. The same as below.圖10 鋁脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因植株根系抗氧化酶活性的影響Fig.10 Effects of aluminum stress on antioxidant enzyme activity of transgenic tobacco lines

2.6.3 鋁脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因植株根系檸檬酸分泌的影響

鋁脅迫處理3個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草GmDREPP-2、GmDREPP-4、GmDREPP-5，以及野生型煙草12 h后，分別測(cè)定其根系檸檬酸分泌量。如圖11所示，轉(zhuǎn)基因煙草的根系檸檬酸分泌量極顯著(P<0.01)高于野生型，為野生型的2.9倍以上，說(shuō)明過(guò)表達(dá)GmDREPP能顯著促進(jìn)煙草分泌檸檬酸響應(yīng)鋁脅迫以緩解鋁毒害。

圖11 鋁脅迫下煙草根系檸檬酸分泌量Fig.11 Citrate secretion of tobacco roots under aluminum stress

圖12 野生型和轉(zhuǎn)基因煙草中NtALS3和NtMATE的相對(duì)表達(dá)量Fig.12 Relative expression levels of NtALS3 and NtMATE in WT and transgenic tobacco lines

2.6.4 過(guò)表達(dá)煙草中NtALS3和NtMATE的表達(dá)分析

NtALS3和NtMATE已經(jīng)被證實(shí)是鋁脅迫的響應(yīng)基因。圖12顯示，無(wú)鋁脅迫(CK)時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系GmDREPP-2中NtALS3基因的表達(dá)量顯著高于WT和轉(zhuǎn)基因株系GmDREPP-4、GmDREPP-5，WT和轉(zhuǎn)基因株系GmDREPP-4、GmDREPP-5的NtALS3基因表達(dá)量無(wú)顯著差異；同時(shí)，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的NtMATE基因表達(dá)量均顯著高于WT。鋁處理(pH 4.5，0.5 mmol·L-1CaCl2，50 μmol·L-1AlCl3)12 h后，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草中NtALS3和NtMATE的相對(duì)表達(dá)量均極顯著(P<0.01)升高，且3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的NtALS3和NtMATE基因表達(dá)量均極顯著(P<0.01)高于WT。

2.6.5 鋁脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草根尖的傷害

取鋁處理(pH 4.5，0.5 mmol·L-1CaCl2，50 μmol·L-1AlCl3)12 h后的轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草根尖染色，結(jié)果如圖13所示。由圖可知，轉(zhuǎn)基因煙草根尖著色明顯較淺，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草根尖受損較輕，鋁離子積累少。

圖13 野生型和轉(zhuǎn)基因煙草根尖染色Fig.13 Staining at the root tips of WT and transgenic lines

3 討論

本研究通過(guò)分子克隆技術(shù)從丹波黑大豆中克隆獲得編碼丹波黑大豆GmDREPP蛋白基因的CDS序列(全長(zhǎng)624 bp，編碼207個(gè)氨基酸)，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCXSN-GmDREPP，并成功遺傳轉(zhuǎn)化煙草。根尖是識(shí)別鋁毒害、積累鋁離子的主要部位[18]。李季膚等[19]研究發(fā)現(xiàn)，地毯草鋁響應(yīng)基因AcABCG1在根中表達(dá)量較高且主要在根尖中表達(dá)，本研究的qRT-PCR結(jié)果與此一致，即鋁脅迫條件下，根系中根尖的表達(dá)量最高，推測(cè)GmDREPP可能是鋁脅迫的響應(yīng)基因。

根系伸長(zhǎng)是細(xì)胞分裂的過(guò)程，鋁毒害對(duì)植物根系生長(zhǎng)的抑制作用主要通過(guò)阻止細(xì)胞分裂實(shí)現(xiàn)[20]。本研究中，鋁處理對(duì)煙草根系生長(zhǎng)有明顯抑制作用，但轉(zhuǎn)GmDREPP煙草根的相對(duì)伸長(zhǎng)率明顯高于野生型，說(shuō)明GmDREPP能緩解煙草根系生長(zhǎng)受到的抑制。伊文思藍(lán)和蘇木精染色結(jié)果也與根部生長(zhǎng)情況一致，進(jìn)一步說(shuō)明GmDREPP增強(qiáng)了煙草的耐鋁能力。

SOD和POD是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，在緩解逆境脅迫引起的氧化損傷中發(fā)揮重要作用[21-22]。經(jīng)50 μmol·L-1AlCl3處理12 h后，轉(zhuǎn)基因植株的SOD、POD活性明顯高于野生型，與耐鋁型杉木(Cunninghamialanceolata)幼苗葉片[23]和玉米(ZeamaysL.)[24]的SOD、POD活性變化趨勢(shì)一致。由此可知，過(guò)表達(dá)GmDREPP基因能提高煙草中抗氧化酶的活性，這也是轉(zhuǎn)GmDREPP煙草提高耐鋁性的原因之一。

植物可以通過(guò)細(xì)胞膜上的特異受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，接受并轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)境中的鋁信號(hào)，激活下游相關(guān)基因(如MATE，ALS3等)表達(dá)抵御鋁毒害[25-26]。MATE和ALS3是緩解鋁脅迫的關(guān)鍵基因。ALS3蛋白能將進(jìn)入植物細(xì)胞中的鋁離子轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡隔離[27]，同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)尿苷二磷酸葡糖(uridine diphosphate glucose，UDPG)至細(xì)胞壁合成纖維素固定鋁離子，提高植物耐鋁性[28-29]。植物抵御鋁毒害最有效的機(jī)制之一是鋁誘導(dǎo)植物根系分泌有機(jī)酸[30]，其中檸檬酸能與鋁絡(luò)合形成穩(wěn)定常數(shù)較大的復(fù)合物，被認(rèn)為是強(qiáng)效的鋁解毒劑。鋁脅迫條件下，MATE蛋白通過(guò)促進(jìn)植物檸檬酸分泌[31]，使檸檬酸與鋁絡(luò)合形成穩(wěn)定無(wú)毒復(fù)合物緩解鋁毒害[32]。本研究中鋁脅迫條件下，轉(zhuǎn)GmDREPP煙草中NtALS3和NtMATE基因的表達(dá)量顯著升高，推測(cè)過(guò)表達(dá)GmDREPP可能通過(guò)影響其體內(nèi)次生代謝物或激素的變化間接影響NtALS3和NtMATE的表達(dá)[33-35]，從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草的耐鋁性。但他們之間的具體關(guān)系目前還沒有研究，這也是后期探索的目標(biāo)。同時(shí)，鋁處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)基因煙草NtMATE的相對(duì)表達(dá)量極顯著(P<0.01)高于野生型，且轉(zhuǎn)GmDREPP后煙草根系檸檬酸的分泌量提升了1.5倍以上，說(shuō)明過(guò)表達(dá)GmDREPP能通過(guò)上調(diào)MATE基因表達(dá)從而促進(jìn)煙草分泌檸檬酸響應(yīng)鋁脅迫。

綜上所述，轉(zhuǎn)GmDREPP煙草顯著上調(diào)了緩解鋁脅迫的關(guān)鍵基因NtALS3和NtMATE的表達(dá)，增強(qiáng)了抵御鋁毒害的能力，其中NtMATE的表達(dá)量升高促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因煙草的檸檬酸分泌；同時(shí)提高抗氧化酶SOD、POD活性來(lái)降低鋁脅迫對(duì)質(zhì)膜的氧化損傷。過(guò)表達(dá)GmDREPP從以上2個(gè)方面增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草的耐鋁性，證明該基因具有耐鋁功能。