（廣州澤力醫(yī)藥科技有限公司，廣東 廣州 510663）

辣木（Moringa oleiferaLam.），又稱(chēng)奇樹(shù)、鼓槌樹(shù)，是辣木科辣木屬（Moringa）的一種木本植物，原產(chǎn)印度及非洲，廣泛種植于亞洲和非洲熱帶和亞熱帶地區(qū)[1-2]。目前我國(guó)海南、云南、福建、貴州和廣東等地均有種植[3]，2012年被國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品。辣木的根、葉和嫩果可食用[4]；種子可榨油[5]。相關(guān)研究表明，辣木有降糖降脂[6-8]、通便解酒[9-10]、鎮(zhèn)靜止痛[11]、抗氧化抗衰老[12-15]等功效，對(duì)預(yù)防及緩解人體各種慢性病均有一定功效，有必要對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及化學(xué)成分進(jìn)行深入研究。

目前辣木葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)多以營(yíng)養(yǎng)成分礦質(zhì)元素含量高低為指標(biāo)，忽略了具有藥效作用的活性成分變化，僅有金玲等[16]、曾明瑩等[17]、許琳等[18]對(duì)辣木葉液相指紋圖譜進(jìn)行初步研究。本實(shí)驗(yàn)基于高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜的優(yōu)點(diǎn)及辣木葉相關(guān)質(zhì)量研究，收集廣東、云南及福建區(qū)域的辣木葉，分析比較其HPLC指紋圖譜特征，為不同產(chǎn)地辣木葉質(zhì)量特征的確定、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的完善及原料質(zhì)量可追溯系統(tǒng)的構(gòu)建提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilengt1100系列高效液相色譜儀（包括DAD陣列檢測(cè)器，美國(guó)Agilent 公司）；Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；DV215CD 型電子天平（美國(guó)奧豪斯公司）；KQ3200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW135 型中藥粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥與試劑

沒(méi)食子酸對(duì)照品（成都普思生物科技有限公司，批號(hào)P80380030）；異槲皮苷對(duì)照品（北京儀化通標(biāo)科技有限公司，批號(hào)170526-0373）；乙腈，甲醇（美國(guó)Fisher 公司，色譜純），磷酸（成都市科龍化工試劑廠，分析純），超級(jí)純水。9批辣木葉產(chǎn)地來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 9批辣木葉原材產(chǎn)地來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 在紫外檢測(cè)器下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，全波長(zhǎng)掃描圖顯示在230 nm下出現(xiàn)的色譜峰較多，且大部分樣品的色譜峰有較強(qiáng)的吸收。根據(jù)紫外檢測(cè)結(jié)果，選擇230，254，280，320，360 nm 5個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行HPLC分析，見(jiàn)圖1。綜合紫外全波長(zhǎng)檢測(cè)結(jié)果及HPLC分析結(jié)果，選擇230 nm作為辣木葉HPLC指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 5個(gè)不同波長(zhǎng)的色譜圖

2.1.2 流動(dòng)相的選擇 辣木葉藥材中物質(zhì)成分復(fù)雜，為提高色譜峰分離度，分別考察流動(dòng)相系統(tǒng)：乙腈-水（加酸）、甲醇-水（加酸），洗脫梯度設(shè)置相同，結(jié)果見(jiàn)圖2。甲醇-水（加酸）系統(tǒng)所得的譜圖信息較豐富，因此選擇流動(dòng)相甲醇-水（加酸）。

圖2 流動(dòng)相系統(tǒng)選擇

2.1.3 色譜柱的選擇 為優(yōu)選色譜柱，本實(shí)驗(yàn)分別考察迪馬Diamonsil C18和島津Inertsil C18色譜柱。結(jié)果見(jiàn)圖3，Diamonsil C18色譜柱分析效果更優(yōu)。

圖3 色譜柱的選擇

2.1.4 洗脫梯度的選擇 為保證譜圖各成分分離良好，故對(duì)色譜梯度進(jìn)行優(yōu)化。譜圖比較發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相為甲醇-0.05 %磷酸溶液，梯度洗脫條件見(jiàn)表2，分離效果和色譜峰形較好（見(jiàn)圖4中6號(hào)色譜圖）。

表2 梯度洗脫程序

圖4 梯度優(yōu)化色譜圖

2.1.5 色譜條件的確定 根據(jù)以上優(yōu)化結(jié)果，確定最佳的色譜條件為：色譜柱：迪馬Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A），0.05 %磷酸（B）；梯度洗脫（0～20 min，5 %～10 % A；20～40 min，10 %～28 % A；40～65 min，28 %～50 %；65～75 min，50 %～100 % A）；流速：1.0 ml/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品4.0 mg，異槲皮苷對(duì)照品2.3 mg，分別用甲醇溶解并定容至10 ml量瓶，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.004 g/L沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液和0.230 g/L異槲皮苷對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取辣木葉樣品適量，粉碎，過(guò)1.2 mm篩網(wǎng)，稱(chēng)取4.0 g，精密稱(chēng)定，置入50 ml具塞錐形瓶，精密加入純水20 ml，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取30 min（功率500 W，頻率53 kHz），補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過(guò)濾（中性濾紙），搖勻，濾液于0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 指紋圖譜的方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 依法制備供試品溶液，按2.1.5項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，以沒(méi)食子酸峰（4號(hào)峰）為參照峰，分別測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于3.0 %，相對(duì)峰面積的RSD均小于1.5 %，且各譜圖相似度均在0.99以上，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 稱(chēng)取同一辣木葉藥材細(xì)碎品（批號(hào)為YF20190401）6份，依法制備供試液，按2.1.5項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以沒(méi)食子酸峰（4號(hào)峰）為參照峰，分別測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2.0 %，相對(duì)峰面積的RSD均小于2.5 %，且各譜圖相似度均在0.98以上，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 依法制備供試品溶液，按2.1.5項(xiàng)下色譜條件，分別于0，2，4，6，12，24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，以沒(méi)食子酸峰（4號(hào)峰）為參照峰，分別測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜2.0 %，相對(duì)峰面積的RSD均＜2.0 %，且各譜圖相似度均在0.97以上，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 辣木葉指紋圖譜的建立及共有峰的指認(rèn)

取9批不同產(chǎn)地的辣木葉細(xì)碎品適量，按2.2.2項(xiàng)下制備各供試品溶液，按2.1.5項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄各產(chǎn)地辣木葉230 nm處的色譜圖。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）軟件生成對(duì)照指紋圖譜色譜圖，標(biāo)定共有峰15個(gè)，見(jiàn)圖5，6。精密吸取對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)與對(duì)照品保留時(shí)間比對(duì)，指認(rèn)指紋圖譜15個(gè)共有峰中的沒(méi)食子酸（4號(hào)峰），異槲皮苷（11號(hào)峰）。

圖5 9批辣木葉藥材的指紋圖譜疊加圖

圖6 辣木葉藥材指紋圖譜共有峰及特征峰標(biāo)定

2.5 9批辣木葉原材相似度評(píng)價(jià)

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”對(duì)藥材樣品指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，將9批樣品色譜圖與對(duì)照指紋圖譜比較，其中沒(méi)食子酸峰（4號(hào)峰）峰形和分離度都較好，故選擇作為參照峰，計(jì)算各共有峰與參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，具體結(jié)果見(jiàn)表3～5。

結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于2.0 %，各共有峰的相對(duì)峰面積差別顯著，表明不同產(chǎn)地辣木葉藥材化學(xué)成分在種類(lèi)無(wú)太大差別，但含量存在較大差異。表5結(jié)果表明，廣東、云南、福建所采集的辣木葉原材相似度在0.6～0.9，化學(xué)成分含量呈區(qū)域性顯著差別，結(jié)果與表4結(jié)果一致。不同區(qū)域辣木葉原材化學(xué)成分含量差異較大，原因可能與辣木葉原材中成分含量受地區(qū)氣候、采收期及加工方式等因素有關(guān)。

3 討論

本研究首次對(duì)廣東地區(qū)、云南地區(qū)、福建地區(qū)采集的辣木葉藥材液相指紋圖譜研究，經(jīng)方法學(xué)考察，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度良好，多批辣木葉的成分種類(lèi)差別小，但各共有峰峰面積相差較大，表明本實(shí)驗(yàn)收集的不同區(qū)域辣木葉成分含量有較大差異，且同一區(qū)域的辣木葉成分種類(lèi)基本吻合。本實(shí)驗(yàn)建立的液相指紋圖譜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可準(zhǔn)確反映不同區(qū)域辣木葉成分種類(lèi)及含量的差別，對(duì)辣木葉原料的質(zhì)量控制及相關(guān)辣木葉產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供高水平的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也為辣木葉原料的篩選提供科學(xué)的評(píng)價(jià)方式。

表3 9批辣木葉指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表4 9批辣木葉指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積

表5 9批辣木葉藥材相似度分析