李 迪,李 楊,吳 迪

(1.大慶油田總醫(yī)院心內(nèi)科,黑龍江 大慶 163000； 2.大慶市人民醫(yī)院,黑龍江 大慶 163001)

心肌缺血再灌注損傷指冠狀動(dòng)脈部分或完全急性阻塞后,一定時(shí)間又重新獲得再通,但其組織損傷反而呈進(jìn)行性加重的病理過程[1]。 一般來說,休克治療、動(dòng)脈搭橋術(shù)、溶栓療法、經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈血管成形術(shù)、心臟外科體外循環(huán)、心肺腦復(fù)蘇、斷肢再植和器官移植等方法可引起心肌缺血再灌注[2]。心肌缺血再灌注損傷可加重原有的損傷,引起心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生不可逆性改變[3]。 因此如何預(yù)防心肌缺血再灌注損傷具有重要的臨床意義。

天然化合物由于其安全有效,并且副作用小,受到全球研究學(xué)者的關(guān)注。 姜黃素(Curcumin,CUR)是姜黃根中的多酚類物質(zhì),具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化等作用[4-5]。 CUR 可降低膽固醇吸收和抵抗炎癥,因而可降低心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn),具有心臟保護(hù)作用[4-5]。 但作為藥物來講,CUR脂溶性較強(qiáng),但在水中很難溶解,口服吸收困難,靶細(xì)胞不易攝取,這限制了它的臨床應(yīng)用。 近年來,新型給藥系統(tǒng),如緩控釋給藥系統(tǒng)、靶向給藥系統(tǒng)、納米給藥系統(tǒng)、透皮給藥系統(tǒng)、粘附給藥系統(tǒng)等,發(fā)展迅速并且解決了許多藥物的溶解、釋放以及靶向性問題。 CUR 納米乳(CUR nanoemulsion, CURNMs)解決了CUR 水溶性問題,目前已用于抗炎、抗腫瘤及組織器官損傷保護(hù)等。 但CUR-NMs 是否對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用還未有研究報(bào)道。 本研究通過構(gòu)建CUR-NMs 藥物載體,觀察其對(duì)大鼠心肌缺血再灌注的保護(hù)作用和作用機(jī)制,為CUR 的臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)雄性SD 大鼠40 只,體重180 ～200 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[SCXK(京)2016-0001],本實(shí)驗(yàn)獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批準(zhǔn)文號(hào):20180825。 所有動(dòng)物飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境中[SYXK(黑)2018-007],每籠3 ～4 只動(dòng)物,自由飲水、攝食,12 h 光照/12 h 黑暗,溫度20℃～25℃,相對(duì)濕度40%～70%。,實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物飼養(yǎng)一周以適應(yīng)動(dòng)物房環(huán)境。 整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)期間嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R 原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

姜黃素(批號(hào)20181221)購(gòu)自大連美侖生物科技有限公司；棕櫚油和吐溫-80 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；CK、LDH、MDA 和SOD 試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程有限公司；calpain1、calpastatin、Bcl-2、caspase 3 抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司；GAPDH 抗體購(gòu)自武漢博士德公司；異氟烷購(gòu)自北京華中海威公司；TUNEL 染色試劑盒(貨號(hào)ATK00001)購(gòu)自武漢普健生物公司。 電子天平(賽多利斯)；高速剪切機(jī)(德國(guó)IKA)；高壓均質(zhì)機(jī)(德國(guó)APV 公司)；CX31倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)；64R 高速低溫離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司)；JEOL JEM-2100F 場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(日本JEOL)；NanoSight NS300 納米顆粒跟蹤分析儀(英國(guó)Malvern 公司)；小動(dòng)物心電圖監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)IVORX 公司)；SpectraMax 190 酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices 公司)；AI600 凝膠成像儀(美國(guó)GE 公司)；小動(dòng)物麻醉機(jī)(購(gòu)自北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CUR 納米乳的構(gòu)建及表征

參考文獻(xiàn)[6]制備CUR-NMs,首先將處方中的棕櫚油和姜黃素溶于無水乙醇中作為油相,使其濃度為1 mg/mL,以去離子水作為連續(xù)相制備水包油型乳劑。 將油相加入到水相中12000 rpm 剪切5 min形成初乳,隨后用高壓均質(zhì)機(jī)以15000 PSI 的壓力進(jìn)行均質(zhì)10 min,得到包載姜黃素的CUR-NMs。 取制備的CUR-NMs,用去離子水稀釋100 倍,移液槍吸取5 μL 樣品溶液滴加到覆有碳支持膜的銅網(wǎng)上,自然條件下晾干,利用透射電子顯微鏡觀察CURNMs 的表面形態(tài),同時(shí)通過納米顆粒分析儀對(duì)其粒徑分布進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 分組及給藥

SD 大鼠40 只,其中30 只冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎30 min 再松開灌注2 h 建立心肌缺血再灌注模型。 按照隨機(jī)數(shù)字表將其分為三組,每組10 只動(dòng)物,分別為模型組、CUR 處理組和CUR-NMs 處理組,CUR 處理組和CUR-NMs 處理組在缺血前4 h 分別腹腔注射CUR(20 mg/kg)和CUR-NMs(20 mg/kg)預(yù)處理, 模型組以等體積溶劑預(yù)處理。 剩余10只動(dòng)物只手術(shù)但不做結(jié)扎處理設(shè)為假手術(shù)組,假手術(shù)組予以等體積上述溶劑預(yù)處理。 手術(shù)時(shí),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用小動(dòng)物麻醉機(jī)給與異氟烷持續(xù)吸入麻醉,維持濃度為3%。

1.3.3 指標(biāo)檢測(cè)

多導(dǎo)生理記錄儀分別于基礎(chǔ)狀態(tài)、再灌注30、60、90、120 min 時(shí)記錄LVDP、+dp/dtmax 和-dp/dtmax。 生理記錄儀信號(hào)采集結(jié)束后,各大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血約3 mL,室溫下靜置至凝固,隨后3000 rpm 離心10 min,取上層血清,參照肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)血清CK、LDH、MDA 和SOD 水平。

1.3.4 TUNEL 染色檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況

取血后迅速處死大鼠,并進(jìn)行解剖,取出心臟,切取結(jié)扎部位周邊組織,用生理鹽水沖洗表面血液后置于4%多聚甲醛中固定,參考文獻(xiàn)[7]將收集好的心肌組織石蠟包埋、切片、蘇木素染核,將切面放入Tris-HCL(含3%BSA 和20%牛血清)中15℃～25℃浸泡,以PBS 浸泡切片兩次,晾干,取50 μL TUNEL 反應(yīng)混合液滴于切片上,37℃孵育1.5 h,PBS 洗3 遍,稍微晾干,于倒置顯微鏡下觀察組織細(xì)胞凋亡情況,并拍照,隨機(jī)選取5 個(gè)非重疊400 倍鏡視野,計(jì)數(shù)凋亡心肌細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞總數(shù),計(jì)算凋亡指數(shù),心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)=凋亡心肌細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.5 蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)心肌 calpain1、calpastatin、Bcl-2、caspase 3 蛋白表達(dá)變化

取各組大鼠心臟組織0.5 g,加入細(xì)胞組織裂解液液于均質(zhì)儀研碎,冰上靜置5 min,參考文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行蛋白提取、SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉。按需求加入calpain1 抗體(1 ∶2000)、calpastatin 抗體(1 ∶1000)、Bcl-2 抗體(1 ∶1000)、caspase 3 抗體(1 ∶800)或GAPDH 抗體(1 ∶5000)4℃溫育過夜。 次日,TBST 洗膜3 次,再加入相應(yīng)的抗兔IgG-HRP 二抗(1 ∶2000),室溫雜交1 h,PVDF 膜以ECL 發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色,用AI600 進(jìn)行成像并對(duì)蛋白印跡條帶進(jìn)行處理和分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。 兩組間比較采用t 檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,兩兩多重比較方法用LSD-t 檢驗(yàn)。 P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(雙尾)。

2 結(jié)果

2.1 CUR-NMs 的表征

2.2 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)變化

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠缺血30 min 再松開灌注2 h 后LVDP、+dp/dtmax 和-dp/dtmax 指標(biāo)均明顯下降(P＜0.01)；相較于模型組,CUR 處理組和CUR-NMs 處理組大鼠LVDP、+dp/dtmax 和-dp/dtmax均有不同程度升高(P＜0.05 或P＜0.01)；與CUR 處理組相比,CUR-NMs 處理組LVDP、+dp/dtmax 和-dp/dtmax 升高幅度更大(P＜0.01),見表1。

2.3 各組大鼠血清LDH、CK、MDA、SOD 水平比較

大鼠缺血30 min 再松開灌注2 h 后,相較于假手術(shù)組,模型組大鼠血清LDH、CK、MDA 明顯升高,SOD 顯著降低(P＜0.01)；與模型組相比,CUR 處理組和CUR-NMs 處理組LDH、CK、MDA 顯著下降,SOD 明顯升高(P＜0.05 或P＜0.01)；與CUR 處理組相比,CUR-NMs 處理組LDH、CK、MDA 降低,SOD升高(P＜0.05 或P＜0.01),見表2。

圖1 CUR-NMs 表面形態(tài)及其粒徑分布Figure 1 Surface morphology and particle size distribution of CUR-NMs

表1 各組大鼠缺血再灌注血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化( ±s,n=10)Table 1 Changes in the hemodynamic parameters of ischemia-reperfusion rats in each group

表1 各組大鼠缺血再灌注血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化( ±s,n=10)Table 1 Changes in the hemodynamic parameters of ischemia-reperfusion rats in each group

注:與假手術(shù)組相比,**P＜0.01；與模型組相比,#P＜0.05,##P＜0.01；與CUR 處理組相比,△△P＜0.01。Note. Compared with the sham group,**P＜0.01.Compared with the model group,#P＜0.05,##P＜0.01.Compared with the CUR treatment group,△△P＜0.01.

組別Groups左心室發(fā)展壓Left ventricular development pressure左心室內(nèi)壓最大上升速率Maximum rate of rise of left ventricular pressure左心室內(nèi)壓最大下降速率Maximum rate of decrease in left ventricular pressure假手術(shù)組Sham group 102.30±8.61 98.25±9.13 99.67±9.29模型組Model group 56.58±4.12** 60.57±6.39** 60.08±4.83**CUR 處理組CUR treatment group 71.12±5.23# 77.67±5.25# 78.12±5.66#CUR-NMs 處理組CUR-NMs treatment group 86.16±7.16△△## 94.33±7.52△△## 93.17±7.02△△##

表2 各組大鼠血清LDH、CK、MDA、SOD 水平較( ±s,n=10)Table 2 Comparison of serum LDH, CK, MDA, and SOD levels of the rats in each group

表2 各組大鼠血清LDH、CK、MDA、SOD 水平較( ±s,n=10)Table 2 Comparison of serum LDH, CK, MDA, and SOD levels of the rats in each group

注:與假手術(shù)組相比,**P＜0.01；與模型組相比,#P＜0.05,##P＜0.01；與CUR 處理組相比,△P＜0.05,△△P＜0.01。Note. Compared with the sham group,**P＜0.01.Compared with the model group,#P＜0.05,##P＜0.01.Compared with the CUR treatment group,△P＜0.05,△△P＜0.01.

組別Groups乳酸脫氫酶(U/mL)LDH肌酸激酶(U/mL)CK丙二醛(nmol/mL)MDA超氧化物歧化酶(U/mL)SOD假手術(shù)組Sham group 0.18±0.02 0.51±0.06 2.86±0.02 125.30±9.18模型組Model group 0.58±0.07** 0.98±0.08** 7.25±0.59** 76.72±6.23**CUR 處理組CUR treatment group 0.45±0.04# 0.78±0.05# 5.86±0.51# 98.12±7.02#CUR-NMs 處理組CUR-NMs treatment group 0.28±0.02△△## 0.62±0.04△△## 3.78±0.35△△## 116.63±8.63△##

2. 4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況

大鼠缺血30 min 再松開灌注2 h 后,假手術(shù)組、模型組、CUR 處理組、CUR-NMs 處理組凋亡指數(shù) 分 別 為(1.98 ± 0. 20)、(22. 50 ± 2. 12)、(15. 00±1.65)、(7. 52±0. 66)。 與假手術(shù)組相比,模型組心肌細(xì)胞凋亡明顯增加(P＜0. 01)；與模型組相比,CUR 處理組和CUR-NMs 處理組心肌細(xì)胞凋亡明顯減少(P＜0. 01)；而相較于CUR處理組,CUR-NMs 處理組心肌細(xì)胞凋亡明顯減少(P＜0. 01),見圖2。

2.5 各組大鼠心肌calpain1、calpastatin、Bcl-2、cleaved-caspase 3 蛋白表達(dá)變化

大鼠缺血30 min 再松開灌注2 h 后,模型組較假手術(shù)組calpain1 和cleaved-caspase 3 蛋白表達(dá)明顯上調(diào),Bcl-2 和calpastatin 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01)；與模型組相比,CUR 處理組和CUR-NMs 處理組calpain1 和cleaved-caspase 3 蛋白表達(dá)顯著下調(diào),Bcl-2和calpastatin 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05 或P＜0.01)；相較于CUR 處理組,CUR-NMs 處理組calpain1 和cleaved-caspase 3 蛋白表達(dá)下調(diào),Bcl-2 和calpastatin 蛋白表達(dá)上調(diào)(P＜0.05 或P＜0.01)(見圖3,表3)。

圖3 各組大鼠心肌calpain1、calpastatin、Bcl-2、cleaved-caspase 3 表達(dá)變化Figure 3 Changes in myocardial calpain1, calpastatin, Bcl-2, and cleaved-caspase 3 expression in each group of rats

表3 各組大鼠心肌calpain1、calpastatin、Bcl-2、cleaved-caspase 3 表達(dá)變化Table 3 Changes in myocardial calpain1, calpastatin, Bcl-2, and cleaved-caspase 3 expression in each group of rats

3 討論

一般來講,在心肌缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后組織損傷反而加重,甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷。 心肌缺血再灌注能引起心功能改變,表現(xiàn)為心室舒張末期壓力(VFDP)增大,心室收縮峰(VPSP)、心室內(nèi)壓±dp/dtmax降低,室性期前收縮、陣發(fā)性室速及室顫等[9]。 心肌缺血再灌注還能破壞心肌超微結(jié)構(gòu),引起心肌能量代謝異常,如釋放細(xì)胞內(nèi)LDH 和CK[10]。 本研究模型組大鼠缺血30 min 再松開灌注2 h 后LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax 指標(biāo)均明顯下降,血清LDH、CK 顯著升高,提示本研究模型成功,心肌缺血再灌注引起心肌細(xì)胞損傷。 而CUR 和CUR-NMs 處理均能抑制上述指標(biāo)的變化,且與CUR 相比,CUR-NMs 處理后心肌缺血再灌注模型鼠LVDP、+dp/dtmax 和-dp/dtmax 升高幅度更大,LDH 和CK 下降更多。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),CUR 和CUR-NMs 均能抑制心肌缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡,二者中CUR-NMs 的抑制效應(yīng)更強(qiáng)。 這些提示,CUR 和CUR-NMs 均對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用,且CUR-NMs明顯優(yōu)于CUR。 研究顯示,心肌缺血再灌注可產(chǎn)生大量的氧自由基和其降解產(chǎn)物(如MDA),內(nèi)源性自由基清除物(如SOD)不足以將過多的氧自由基清除[11]。 而過多的氧自由基可導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,細(xì)胞通透性增加,引起氧化損傷[12]。 本研究顯示,大鼠心肌缺血再灌注引起MDA 增加,SOD 減少,而CUR 和CUR-NMs 可抑制MDA 和SOD 的變化,且CUR-NMs 的抑制作用更強(qiáng)。 提示CUR 和CUR-NMs 均可減輕心肌缺血再灌注引起的氧化損傷,CUR-NMs 效果更佳。

鈣蛋白酶1(calpain1)屬于Ca2+依賴性的半胱氨酸蛋白酶水解家族成員,其活性受到鈣離子濃度和其天然的活性抑制分子calpastatin 的限制[13]。 研究顯示,毛蕊異黃酮可能通過抑制calpain-1 的表達(dá)發(fā)揮抗腦缺血再灌注損傷作用[14]。 提示calpain1參與缺血再灌注損傷。 為此, 本研究觀察了calpain1 在心肌缺血再灌注中的變化。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注模型組細(xì)胞calpain1 表達(dá)上調(diào),而calpastatin 表達(dá)下調(diào),提示缺血再灌注大鼠心肌calpain1 表達(dá)和活性增加。 而CUR 和CUR-NMs 預(yù)處理后calpain1 和calpastatin 蛋白表達(dá)變化受到抑制,且CUR-NMs 的抑制作用更強(qiáng)。 提示CUR 和CUR-NMs 可能通過抑制calpain1 蛋白表達(dá)和活性從而對(duì)心肌缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。

CUR 脂溶性較強(qiáng),但在水中很難溶解。 因此從制劑角度解決CUR 的藥物輸送問題十分關(guān)鍵。 納米乳劑是脂質(zhì)體輸送親脂性化合物的理想工具[15]。納米乳劑的表面特性與機(jī)體細(xì)胞膜的生物學(xué)特性類似,易被細(xì)胞攝取,因此在改善溶解度的同時(shí)也能夠增加藥物在體內(nèi)的攝取[16-17]。 這是本研究CUR-NMs 對(duì)心肌缺血再灌注保護(hù)作用強(qiáng)于CUR 的可能原因。 但CUR-NMs 穩(wěn)定性不佳,對(duì)于儲(chǔ)存條件要求較高,工業(yè)化難度大,因而它的廣泛應(yīng)用還面臨很大挑戰(zhàn)。 總之,本研究發(fā)現(xiàn)CUR-NMs 可改善大鼠心肌缺血再灌注損傷,且效果優(yōu)于CUR；該效應(yīng)可能與增強(qiáng)細(xì)胞攝取、抑制calpain1 蛋白表達(dá)和活性有關(guān)。 CUR-NMs 可能是臨床治療心肌缺血再灌注損傷的潛在藥物。