王 雨,許達(dá)峰,周開(kāi)倫,武金才,丁驛超,古海強(qiáng),謝明微,劉向梅

(海南省人民醫(yī)院肝膽胰外科,?？?570031)

原發(fā)性肝癌是臨床最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,病死率僅次于肺癌,居于第2 位,其發(fā)病率逐年增長(zhǎng)[1]。 肝硬化時(shí),腸黏膜通透性增高與腸道細(xì)菌移位及腸源性?xún)?nèi)毒素血癥密切相關(guān),進(jìn)而增加細(xì)胞癌變風(fēng)險(xiǎn),肝硬化、肝癌患者存在腸道細(xì)菌紊亂的情況[2]。 腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移受多基因調(diào)控影響,目前腫瘤的基因治療已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[3]。 研究表明[4-6],微小RNA-144(microRNA-144,miRNA-144)是與腫瘤密切相關(guān)的miRNA,在食管癌、甲狀腺癌、大腸癌組織中均有異常表達(dá),且參與細(xì)胞發(fā)育分化過(guò)程中蛋白與基因的合成環(huán)節(jié)。 楊銳[7]認(rèn)為,miRNA-144 在膽管癌組織和膽管癌細(xì)胞系中的表達(dá)降低,推測(cè)miRNA-144 可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。 目前,關(guān)于miRNA-144 與惡性腫瘤的相關(guān)性研究較多,但關(guān)于其對(duì)肝癌及腸道菌群影響的研究尚少。 本研究對(duì)miRNA-144 基因過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌小鼠的抑瘤作用及對(duì)腸道菌群的影響進(jìn)行探討,旨在為肝癌的基因治療及腸道功能紊亂的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)C57BL/6J 雄鼠,4 周齡,43 只,體重20～22 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0011],飼養(yǎng)于海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(京)2017-0033]。 自由進(jìn)水飲食,溫度維持在23℃～25℃,相對(duì)濕度50%～60%,12 h/12 h 明暗交替安靜環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周,實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程做到了減少、替代、優(yōu)化的3R 原則,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開(kāi)展前獲得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(IACUC-20180509-44)。

1.2 主要試劑與儀器

腹水型肝癌H22 細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；miRNA-144 高表達(dá)慢病毒顆粒(上海吉滿(mǎn)生物科技有限公司)；BCA 蛋白定量試劑盒(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司)；DAB 顯色試劑(北京索萊寶科技有限公司)；緊密鏈接跨膜蛋白(occludin)、閉鎖小帶蛋白-1(zonula occluden-1,ZO-1)多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz 公司)；SP 免疫組化試劑盒、蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin HE)染色試劑盒、雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、腸球菌選擇性培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；糞便QIAamp? DNA Stool Mini Kit(德國(guó)Qiagen 公司)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀、全段酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad 公司)；石蠟切片機(jī)(德國(guó)SLEE 公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 制備移植性腹水型肝癌

取33 只小鼠,腹水型肝癌H22 細(xì)胞株復(fù)蘇,體外培養(yǎng)傳代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,1 000 r/min 離心5 min,PBS 緩沖液清洗2 次,取中上層細(xì)胞,生理鹽水4 倍稀釋,每只小鼠右前腋下無(wú)菌皮下接種0.2 mL,接種完成后正常飼養(yǎng)2 周。 定期以游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠腋下瘤塊長(zhǎng)短徑,待腫瘤最長(zhǎng)徑為0.8 ～1 cm 時(shí)為造模成功,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)

選取建模成功小鼠30 只,隨機(jī)分為模型組、空載組和過(guò)表達(dá)組,每組10 只,另選取10 只健康對(duì)照小鼠為對(duì)照組。 建模成功小鼠于建模后24 h進(jìn)行尾靜脈注射,空載組小鼠注射空載體慢病毒液0.1 mL,過(guò)表達(dá)組注射miRNA-144 高表達(dá)慢病毒液0.1 mL,對(duì)照組與模型組小鼠于同時(shí)間注射生理鹽水0.1 mL,注射完畢后繼續(xù)飼養(yǎng)3 d,期間觀(guān)察記錄小鼠的精神狀況、毛色變化、進(jìn)食量、體重及排便情況。

1.3.3 組織取材及糞便采集

各組小鼠在干預(yù)結(jié)束后24 h 脫頸處死,觀(guān)察腫瘤形成情況,剝離腫瘤組織,稱(chēng)量模型組、過(guò)表達(dá)組瘤重,計(jì)算抑瘤率,并取正常肝組織、肝癌組織及結(jié)腸組織,儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用。 抑瘤率=[模型組平均瘤重(g)-過(guò)表達(dá)組平均瘤重(g)]/模型組平均瘤重(g)×100%。 無(wú)菌收集小鼠處死前48 h 內(nèi)新鮮直腸糞便(≥200 mg),迅速裝入無(wú)菌凍存管中儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用。

1.3.4 組織病理學(xué)觀(guān)察

取小鼠肝及結(jié)腸組織標(biāo)本,PBS 溶液沖洗干凈,4%多聚甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,制成4 μm 厚切片,常規(guī)HE 染色,于光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察肝組織及結(jié)腸組織病理變化。

1.3.5 盲腸內(nèi)容物菌群豐度及多樣性檢測(cè)

按照糞便DNA 基因組提取試劑盒說(shuō)明提取樣本基因組DNA,進(jìn)行細(xì)菌PCR 擴(kuò)增,通用引物forward primer(5’-3’)序列:ATGCTCGACTGTAGCT AGTG-3(F341)reverse primer(5’-3’)；GCTCGAT CGCATCGATATCG(R806),擴(kuò)增細(xì)菌核糖體RNA基因V3～V4 區(qū),得到500 bp 左右片段。 PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min；98℃變性25 s,58℃退火15 s,72℃延伸20 s,重復(fù)30 個(gè)循環(huán),72℃延伸5 min。應(yīng)用Illumina Misq 技術(shù)對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序,根據(jù)97%相似度進(jìn)行操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units,OUT)聚類(lèi),應(yīng)用軟件MEGAN 分析計(jì)算菌群多樣性(shannon)指數(shù)和豐富度(chao)指數(shù)。

1.3.6 腸道屏障功能及及細(xì)菌異位率檢測(cè)

于小鼠處死前收集眼眶靜脈叢血樣,靜置分層后離心收集上層血清,檢測(cè)血清二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)、內(nèi)毒素水平(分光光度計(jì)法),讀取酶標(biāo)儀436 nm 處吸光光密度(optical density,OD)值。 無(wú)菌獲取小鼠腸系膜淋巴結(jié)、腹腔灌洗液及肝、腎、脾、肺,分別將其置于增菌液中,需氧條件下培養(yǎng)24 h,涂片鑒定增菌培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本,將出現(xiàn)大腸桿菌或類(lèi)桿菌者記為陽(yáng)性,計(jì)算細(xì)菌異位率,細(xì)菌異位率=陽(yáng)性器官個(gè)數(shù)/(小鼠個(gè)數(shù)×5)×100%。

1.3.7 結(jié)腸組織Occludin、ZO-1、miRNA-144 mRNA相對(duì)表達(dá)量鑒定

取模型組、空載組、過(guò)表達(dá)組癌組織及各組結(jié)腸組織80 mg,TRIzol 法提取總RNA,以Nanodrop 系統(tǒng)測(cè)定RNA 樣品濃度與純度,測(cè)定260 nm、280 nm處OD 值,判斷樣品純度是否符合實(shí)驗(yàn)要求,以1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 定量。 以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,經(jīng)電泳鑒定、酶標(biāo)儀定量后,采用RT-PCR 法進(jìn)行檢測(cè),反應(yīng)體系:Master Mix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,cDNA 模板2 μL,ddH2O 5 μL；反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s,58℃退火40 s,72℃延伸48 s,重復(fù)40 個(gè)循環(huán)。 β-actin 或U6 為管家基因,2-△△Ct為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,取平均值。各基因引物序列,見(jiàn)表1。

表1 各基因引物序列Table 1 Primer sequences of genes

1.3.8 結(jié)腸組織Occludin、ZO-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

取80 mg 結(jié)腸組織,BCA 法檢測(cè)蛋白定量,取蛋白樣品50 μg 經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,電轉(zhuǎn)60 min 后蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,5%脫脂奶粉TTBS 液(0.121% Tris, 0.9% NaCl, 0.1%Tween-20,pH7.5),漂洗后加Occludin 一抗(1 ∶800)或ZO-1 一抗(1 ∶500)4℃搖床孵育過(guò)夜,TTBS 液洗膜3 次,以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:10 000)室溫孵育2 h,漂洗后ECL 曝光成像,以目的蛋白OD 值/內(nèi)參β-actin 的OD 值比值為蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù),計(jì)量資料均以(±s)描述,多樣本計(jì)量資料比較采用方差分析,兩兩樣本比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況及抑瘤率

對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好,毛色光澤,進(jìn)食量、活動(dòng)量及糞便性狀正常,模型組、空載組及過(guò)表達(dá)組隨著時(shí)間的延長(zhǎng),精神狀態(tài)變差,毛色欠光滑,進(jìn)食量下降,活動(dòng)量減少,體重減輕,出現(xiàn)腹瀉及便血,過(guò)表達(dá)組癥狀稍輕。 過(guò)表達(dá)組抑瘤率為(35.90±5.32)%。

2.2 肝及腸道組織病理學(xué)觀(guān)察

HE 染色結(jié)果顯示,對(duì)照組肝組織中央清晰,肝細(xì)胞大小均勻,形態(tài)完整,核圓而大、居中；腸道壁結(jié)構(gòu)、形態(tài)均正常。 模型組及空載組肝組織正常結(jié)構(gòu)被破壞,肝索結(jié)構(gòu)消失,肝細(xì)胞大小不均、排列不齊、細(xì)胞核大、深染、可見(jiàn)核分裂,肝小葉內(nèi)見(jiàn)大量的碎片狀壞死,壞死周?chē)殡S大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和增生的纖維細(xì)胞；腸道壁結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,腸絨毛萎縮、排列稀疏,黏膜下層可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),伴有上皮細(xì)胞壞死及纖維素樣滲出。 過(guò)表達(dá)組肝組織結(jié)構(gòu)被破壞,細(xì)胞變性、壞死較輕,可見(jiàn)細(xì)胞體積固縮,部分細(xì)胞裂解,染色質(zhì)濃縮,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較輕；腸道壁結(jié)構(gòu)損傷輕微,有少量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),見(jiàn)圖1、圖2。

2.3 癌組織miRNA-144 mRNA 表達(dá)情況

模型組、空載組、過(guò)表達(dá)組miRNA-144 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(0.38±0.06)、(0.39±0.07)、(0.65±0.10),3 組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.000,P=0.000),模型組、空載組的miRNA-144 mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于過(guò)表達(dá)組(t=7.321、6.736,P=0.000、0.000),模型組與空載組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.343,P=0.736)。

2.4 腸道內(nèi)容物菌多樣性及豐度比較

各組間腸道菌群、shannon 及chao 指數(shù)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；模型組、空載組、過(guò)表達(dá)組的雙歧桿菌、乳酸菌、shannon 及chao 指數(shù)均低于對(duì)照組(P＜0.05),大腸桿菌、腸球菌均高于對(duì)照組(P＜0.05)；模型組與空載組的雙歧桿菌、乳酸菌、shannon 及chao 指數(shù)均低于過(guò)表達(dá)組(P＜0.05),大腸桿菌、腸球菌均高于過(guò)表達(dá)組(P＜0.05)；模型組與空載組的腸道菌群、shannon 及chao 指數(shù)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見(jiàn)表2。

圖1 肝組織病理圖片(HE 染色)Figure 1 Pathological picture of liver tissue (HE staining)

圖2 結(jié)腸組織病理學(xué)圖片(HE 染色)Figure 2 Histopathological picture of colon(HE staining)

表2 腸道內(nèi)容物菌群多樣性及豐度比較( ±s,n=10)Table 2 Diversity and abundance of intestinal microflora

表2 腸道內(nèi)容物菌群多樣性及豐度比較( ±s,n=10)Table 2 Diversity and abundance of intestinal microflora

注:4 組間比較,△P＜0.01；與對(duì)照組比較,*P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.01；與空載組比較,&P＜0.01。Note. Compared with the control group,△P ＜0.01.Compared with the control group,*P ＜0.01.Compared with the model group,#P ＜0.01.Compared with the no-load group,&P ＜0.01.

組別Groups雙歧桿菌(lgCFU/g)Bifidobacterium乳酸桿菌(lgCFU/g)Lactobacillus大腸桿菌(lgCFU/g)E.coli腸球菌(lgCFU/g)Enterococcus Shannon 指數(shù)Shannon index Chao 指數(shù)Chao index對(duì)照組Control group 9.01±0.80△ 8.75±0.88△ 7.55±0.88△ 6.85±0.65△ 4.10±0.55△ 836.32±65.32△模型組Model group 5.35±0.55△* 5.68±0.66△* 12.01±0.98△* 10.32±0.85△* 2.02±0.45△* 585.63±55.30△*空載組No-load group 5.30±0.57△* 5.60±0.70△* 12.10±0.95△* 10.28±0.88△* 2.05±0.50△* 584.20±56.32△*過(guò)表達(dá)組Over-expression group 6.55±0.60△*#& 7.12±0.80△*#& 10.32±0.85△*#& 9.01±0.76*#& 2.85±0.52△*#& 703.02±60.32△*#&

表3 腸道屏障功能比較( ±s,n=10)Table 3 Comparison of intestinal barrier function

表3 腸道屏障功能比較( ±s,n=10)Table 3 Comparison of intestinal barrier function

注:4 組間比較,△P＜0.01；與對(duì)照組比較,*P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.01；與空載組比較,&P＜0.01。Note. Compared with the control group,△P＜0.01.Compared with the control group,*P＜0.01.Compared with the model group,#P＜0.01.Compared with the no-load group,&P＜0.01.

組別Groups DAO(OD 值)DAO(OD value)內(nèi)毒素(OD 值)Endotoxin (OD value)細(xì)菌異位率(%)Bacteria ectopic rate對(duì)照組Control group 0.132±0.010△ 0.178±0.011△ 16.32±4.01△模型組Model group 0.401±0.030△* 0.385±0.028△* 60.01±8.02△*空載組No-load group 0.405±0.035△* 0.380±0.030△* 59.63±7.80△*過(guò)表達(dá)組Over-expression group 0.252±0.022△*#& 0.298±0.025△*#& 32.33±5.40△*#&

2.5 腸道屏障功能比較

各組間血清DAO、內(nèi)毒素OD 值及細(xì)菌異位率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；模型組、空載組、過(guò)表達(dá)組的血清DAO、內(nèi)毒素OD 值及細(xì)菌異位率均高于對(duì)照組(P＜0.05)；過(guò)表達(dá)組的血清DAO、內(nèi)毒素OD 值及細(xì)菌異位率均低于模型組與空載組(P＜0.05)；模型組與空載組的血清DAO、內(nèi)毒素OD 值及細(xì)菌異位率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 見(jiàn)表3。

2.6 結(jié)腸組織Occludin、ZO-1、miRNA-144 mRNA表達(dá)情況

各組間Occludin、ZO-1、miRNA-144 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 對(duì)照組、模型組、空載組的miRNA-144 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均低于過(guò)表達(dá)組(P＜0.05),模型組、空載組低于對(duì)照組(P＜0.05)；模型組、空載組、過(guò)表達(dá)組的Occludin、ZO-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(P＜0.05),模型組與空載組低于過(guò)表達(dá)組(P＜0.05)；模型組、空載組的Occludin、ZO-1、miRNA-144 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 見(jiàn)圖3、表4。

2.7 結(jié)腸組織Occludin、ZO-1 蛋白表達(dá)情況

各組Occludin、ZO-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；模型組、空載組、過(guò)表達(dá)組的Occludin、ZO-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(P ＜0.05),模型組、空載組低于過(guò)表達(dá)組(P＜0.05)；模型組、空載組Occludin、ZO-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 見(jiàn)圖4、表5。

圖3 RT-PCR 分析結(jié)果Figure 3 RT-PCR analysis results

圖4 結(jié)腸組織中緊密連接蛋白表達(dá)情況Figure 4 The expression of tight junction protein in colonic tissue

表4 結(jié)腸組織中Occludi、ZO-1、miRNA-144 mRNA 相對(duì)表達(dá)量( ±s,n=10)Table 4 Relative expression of Occludi, ZO-1 and miRNA-144 mRNA in colon tissue

表4 結(jié)腸組織中Occludi、ZO-1、miRNA-144 mRNA 相對(duì)表達(dá)量( ±s,n=10)Table 4 Relative expression of Occludi, ZO-1 and miRNA-144 mRNA in colon tissue

注:4 組間比較,△P＜0.01；與對(duì)照組比較,*P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.01；與空載組比較,&P＜0.01。Note. Compared with the control group,△P ＜0.01.Compared with the control group,*P ＜0.01.Compared with the model group,#P＜0.01.Compared with the no-load group,&P ＜0.01.

組別Groups miRNA-144 Occludin ZO-1對(duì)照組Control group 1.10±0.15△ 0.95±0.10△ 1.55±0.20△模型組Model group 0.50±0.10△* 0.50±0.07△* 0.95±0.15△*空載組No-load group 0.51±0.09△* 0.49±0.08△* 0.96±0.16△*過(guò)表達(dá)組Over-expression group 2.56±0.22△*#& 0.66±0.08△*#& 1.20±0.18△*#&

表5 結(jié)腸組織中Occludin、ZO-1 的蛋白相對(duì)表達(dá)量( ±s,n=10)Table 5 Relative expression of Occludin and ZO-1 proteins in colonic tissues

表5 結(jié)腸組織中Occludin、ZO-1 的蛋白相對(duì)表達(dá)量( ±s,n=10)Table 5 Relative expression of Occludin and ZO-1 proteins in colonic tissues

注:4 組間比較,△P＜0.01；與對(duì)照組比較,*P＜0.05；與模型組比較,#P＜0.05；與空載組比較,&P＜0.05。Note. Compared with the control group,△P ＜0.01.Compared with the control group,*P＜0.01.Compared with the model group,#P ＜0.01.Compared with the no-load group,&P ＜0.01.

組別Groups Occludin ZO-1對(duì)照組Control group 0.90±0.13△ 0.62±0.10△模型組Model group 0.35±0.07△* 0.20±0.06△*空載組No-load group 0.36±0.08△* 0.19±0.07△*過(guò)表達(dá)組Over-expression group 0.62±0.10△*#& 0.40±0.08△*#&

3 討論

肝癌具有惡性程度高、發(fā)病隱匿、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移性強(qiáng)的特點(diǎn),目前手術(shù)切除、放化療等手段雖可消除病灶或抑制瘤體的發(fā)展,但仍有較高的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率[8]。 “肝腸軸”概念(機(jī)體腸道與肝間的交互作用,前者的紊亂是肝疾病發(fā)生的重要原因,腸道的穩(wěn)態(tài)環(huán)境對(duì)肝的保護(hù)及機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有重要作用)的提出,使肝疾病與腸道的作用受到關(guān)注,為肝癌腸轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新的切入點(diǎn)[9]。 隨著基因檢測(cè)手段的進(jìn)步,miRNA 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用受到重視,成為腫瘤治療新途徑,了解miRNA 在原發(fā)性肝癌中表達(dá)的意義及對(duì)小鼠腸道微生態(tài)環(huán)境的影響,可為臨床的治療提供依據(jù)。

miRNA 是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)短小、內(nèi)源性、非編碼特性的單鏈RNA 分子,全長(zhǎng)21 ～25 個(gè)核苷酸,在多種真核生物中參與轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控表達(dá),其異常表達(dá)可影響細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等重要過(guò)程[10-11]。 劉旭斌等[12]認(rèn)為miRNA 參與肝癌的發(fā)生發(fā)展；趙立涵等[13]研究發(fā)現(xiàn),miRNA-144-3p 能通過(guò)抑制HDGF 基因與蛋白的表達(dá),促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。 本研究結(jié)果中,除對(duì)照組外,其余3 組小鼠隨著時(shí)間的延長(zhǎng),精神狀態(tài)變差,毛色欠光滑,進(jìn)食量、活動(dòng)量、體重均下降,出現(xiàn)腹瀉及便血,肝組織與結(jié)腸組織均有不同程度的破壞,而過(guò)表達(dá)組較輕；模型組、空載組中癌組織miRNA-144 mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于過(guò)表達(dá)組。 證實(shí)miRNA-144 過(guò)表達(dá)可抑制肝癌的發(fā)展。 腸道黏膜屏障可防止腸腔內(nèi)有害物質(zhì)通過(guò)腸黏膜進(jìn)入其他組織及循環(huán)中,腸道黏膜屏障功能受損時(shí),腸道內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素可進(jìn)入門(mén)靜脈系統(tǒng),引起炎癥和免疫反應(yīng),進(jìn)一步加重腸道黏膜損傷并造成遠(yuǎn)隔器官損傷。 而肝癌患者因腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,維持表皮和內(nèi)皮細(xì)胞的選擇性滲透屏障功能被破壞,細(xì)胞間的緊密連接受損,導(dǎo)致腸道黏膜損傷[14-15]。 王軻等[16]認(rèn)為,腸道微生態(tài)失衡促進(jìn)肝硬化-肝癌癌前病變的惡性轉(zhuǎn)變,通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群,阻止細(xì)菌的移位并阻斷相關(guān)信號(hào)通路,可延緩或阻止肝癌癌前病變的形成和惡性轉(zhuǎn)變。 本研究結(jié)果中,與對(duì)照組比較,其余3 組的雙歧桿菌、乳酸菌、shannon 及chao 指數(shù)更低,過(guò)表達(dá)組高于模型組與空載組；與對(duì)照組比較,其余3組的大腸桿菌、腸球菌、血清DAO、內(nèi)毒素OD 值及細(xì)菌異位率更高,而過(guò)表達(dá)組低于模型組與空載組。 以上結(jié)果說(shuō)明miRNA-144 過(guò)表達(dá)能減輕肝與腸道組織損傷,調(diào)節(jié)腸道菌群,改善腸黏膜屏障功能。

機(jī)械屏障是腸黏膜屏障功能中的重要組成部分,緊密連接和黏附連接是腸道上皮機(jī)械屏障功能的重要組成部分[17]。 Occludin 與ZO-1 是緊密連接的主要組成成分,Occludin 蛋白的外形結(jié)構(gòu)及跨膜結(jié)構(gòu)參與腸壁通透性的調(diào)節(jié)；ZO-1 在緊密連接中起橋梁作用,與ZO-2、ZO-3 形成復(fù)合體,通過(guò)其PDZ區(qū)與Occludin 的羧基端結(jié)合,其羧基端與細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白結(jié)合,是緊密連接的功能蛋白,其表達(dá)在上皮細(xì)胞滲透性與維持細(xì)胞極性中發(fā)揮重要作用[18-19]。 李永春等[20]認(rèn)為,蠟樣芽孢桿菌能改善膽汁淤積肝損傷大鼠的腸黏膜通透性,其機(jī)制與上調(diào)小腸組織中緊密連接蛋白的表達(dá)有關(guān)。 王莉[21]認(rèn)為,黃芩苷能通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA,改善TNF-α 誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞通透性,提高靶基因ZO-1 的表達(dá)。 本研究結(jié)果中,除過(guò)表達(dá)組外,其余3 組結(jié)腸組織的miRNA-144 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均下降,模型組、空載組均低于對(duì)照組；除對(duì)照組外,其余3 組Occludin、ZO-1 mRNA 及Occludin、ZO-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量均下降。 提示miRNA-144 過(guò)表達(dá)能上調(diào)Occludin、ZO-1 mRNA 和蛋白的表達(dá),從而調(diào)節(jié)腸道微生態(tài),改善腸黏膜屏障功能。

綜上所述,miRNA-144 過(guò)表達(dá),能抑制肝癌的發(fā)展,改善小鼠腸道微生態(tài)環(huán)境與腸道黏膜功能,其調(diào)節(jié)機(jī)制可能與增加Occludin、ZO-1 mRNA 和蛋白的表達(dá)有關(guān),可將miRNA-144 作為肝癌基因治療的切入點(diǎn)。