邸亞男,朱麗英,沈 婕,錢 雯,潘 衛(wèi),3,4*

(1.北京大學(xué)第三醫(yī)院北方院區(qū)檢驗科；兵器工業(yè)北京北方醫(yī)院檢驗科,北京 100089；2.貴州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院,貴陽 550025；3. 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院貴州省產(chǎn)前診斷中心,貴陽 550025；4. 貴州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實驗室,貴陽 550025)

據(jù)統(tǒng)計,目前全球大約有超過2.8 億人存在視力損害和失明如白內(nèi)障、青光眼、老年性黃斑變性和糖尿病視網(wǎng)膜病變等[1],但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚,而且目前尚無有效治療藥物。 因此,理想的眼病動物模型對于了解其發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的治療藥物非常重要。 斑馬魚是一種發(fā)現(xiàn)于印度和巴基斯坦水域的熱帶魚,具有繁殖力強(qiáng)、體外發(fā)育快、透明胚胎等優(yōu)點(diǎn)[2-3],是一種應(yīng)用頗為廣泛的模式動物[4-5]。 研究表明,斑馬魚的藥物反應(yīng)和藥物代謝與人類的具有很高的相似性[6-7]。 另外,斑馬魚作為藥物篩選模型時,其給藥方式簡單,通常將待篩選樣品溶于斑馬魚胚胎培養(yǎng)液中,通過擴(kuò)散或吸收進(jìn)入胚胎發(fā)揮作用[3]。 因此,其已被越來越多地用于篩選眼睛疾病治療藥物和評估藥物相關(guān)的眼毒性當(dāng)中。

然而,由于許多藥物或化合物表現(xiàn)出較差的水溶性,往往需要有機(jī)溶劑來溶解以保證適當(dāng)?shù)纳锢寐屎捅┞稘舛?且一些研究指出有機(jī)溶劑本身也可能表現(xiàn)出一定的毒性效應(yīng)[8]。 因此,評估有機(jī)溶劑對斑馬魚胚胎發(fā)育,尤其是眼睛發(fā)育的影響在斑馬魚眼睛疾病研究中具有一定價值。 本研究以四種常用的有機(jī)溶劑包括乙醇、丙酮、異丙醇和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)處理斑馬魚胚胎,并觀察它們對斑馬魚胚胎,尤其是眼睛發(fā)育的影響,為其作為溶劑在斑馬魚眼睛疾病模型研究中提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗所用斑馬魚為野生AB 系性成熟成年(20 ～24 周齡)斑馬魚由貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室所贈,體重約350 ～400 mg。 其養(yǎng)殖和繁殖標(biāo)準(zhǔn)參考Westerfield[9]和《實驗用斑馬魚養(yǎng)殖地方標(biāo)準(zhǔn)的初步探討》[10]所述方法進(jìn)行。 生長溫度(28±1)℃,照明14 h/10 h 光/暗交替,雌雄分開喂養(yǎng),定時飼以Larval AP100(Zeigler 公司)。 斑馬魚卵是從性成熟成年斑馬魚的養(yǎng)殖中獲得的。 傍晚將3～4 對性成熟斑馬魚按雌雄1 ∶1或1 ∶2的比例放入交配缸中,用隔板隔開,次日早晨光照10 min 后撤掉擋板,收集受精卵。 受精卵清洗和消毒后,放入含有0.2%(w/v)亞甲基藍(lán)的培養(yǎng)液中于28℃控光培養(yǎng)。 本研究中所有動物實驗均嚴(yán)格遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

試劑乙醇、丙酮、異丙醇和DMSO(分析純)購于西龍化工股份有限公司；麻醉劑Tricaine 購于Sigma公司；小鼠抗ZPR1 抗體、小鼠抗ZPR3 抗體、小鼠抗ZN12 抗體購于ZRIC 斑馬魚資源中心；熒光標(biāo)記山羊抗鼠IgG 抗體購于Invitrogen 公司；體視鏡stemi-200c(德國蔡司公司)；激光共聚焦顯微鏡TCS SP8 DIVE(德國徠卡公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 斑馬魚胚胎處理

研究顯示,斑馬魚眼睛的發(fā)育始于受精后12 h(hpf,hours post fertilization)由前腦外翻形成視囊,大約72 hpf 時眼睛的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育幾乎全部完成并具有視覺功能[11]。 同時,根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)定各個有機(jī)溶劑的濃度[12]。 因此,本研究收集12 hpf 胚胎120枚分別置于含有機(jī)溶劑0.5%乙醇、1.5%丙酮、1%異丙醇和2.5% DMSO 的胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)至72 hpf,每種有機(jī)溶劑30 枚胚胎。 對照組30 枚胚胎僅用胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)。 每組實驗重復(fù)3 次。 72 hpf 后,統(tǒng)計并觀察胚胎的存活率和畸形率及眼睛的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.2 斑馬魚眼睛大小的觀察

斑馬魚胚胎生長至72 hpf 后, 以0.05%Tricaine 溶液麻醉并固定后,用體視鏡stemi-200c所帶成像系統(tǒng)拍照,并用AxioVison 軟件測量斑馬魚眼睛和身體長度。 體長為從頭部頂端到軀干末端(不包括尾鰭)；眼睛長度為眼睛長軸前部至后部。同時,測量斑馬魚眼睛和身體面積,測量時本研究首用AxioVison 軟件將斑馬魚眼睛和身體區(qū)域圈定之后利用工具欄的Measure 功能進(jìn)行面積計算得到面積數(shù)值。 為了更加準(zhǔn)確的評估斑馬魚眼睛大小的變化,本研究計算了眼睛長度和身體長度的比值(眼睛/身體長度比)及眼睛面積和身體面積的比值(眼睛/身體面積比)。 由于DMSO 組斑馬魚幼魚的身體彎曲使其長度較難測量,所以僅僅測量了眼睛/身體面積比值。

1.3.3 斑馬魚眼睛免疫組織化學(xué)染色

斑馬魚胚胎生長至72 hpf 后, 以0.05%Tricaine 溶液麻醉,4% PFA 固定,室溫下依次用15%蔗糖和30%蔗糖脫水2 h,然后依次置于25%、50%、75%和100%包埋劑OCT 中各處理2 h,包埋組織后用冷凍切片機(jī)切片(約6 μm),置于防脫載玻片上,37℃切片干燥15 min,1%牛血清白蛋白室溫封閉1 h,加一抗ZPR1(1 ∶500)或ZPR3(1 ∶500)或ZN12(1 ∶500)4℃孵育過夜；PBS 清洗3 次后,加熒光標(biāo)記山羊抗鼠IgG 室溫孵育2 h；PBS 清洗3次。 細(xì)胞核用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色。 蓋上蓋玻片置于激光共聚焦顯微鏡下觀察染色情況,并應(yīng)用Image J 軟件計算各組平均熒光強(qiáng)度。 其中,ZPR1為視錐細(xì)胞標(biāo)記抗體,ZPR3 為視桿細(xì)胞標(biāo)記抗體,Zn12 為視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記抗體。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 14.1 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù),多組間的比較采用方差分析,兩組間定量資料的比較采用t檢驗。 P＜0.05 差異具有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 四種有機(jī)溶劑中斑馬魚胚胎的畸形率和死亡率

斑馬魚胚胎生長至72 hpf 后,結(jié)果顯示,對照組和四種有機(jī)溶劑乙醇、丙酮、異丙醇、DMSO 暴露組的存活率分別為96%和93%、90%、90%、86%。 其中,以DMSO 暴露組斑馬魚幼魚的存活率最低,但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)。 對照組斑馬魚幼魚形態(tài)正常,而有機(jī)溶劑暴露組則出現(xiàn)了不同程度形態(tài)變化如心包水腫、出血、卵黃缺損和身體彎曲等(見表1、圖1)。 其中,以DMSO 致畸作用最嚴(yán)重,導(dǎo)致的心包水腫、出血、卵黃缺損和身體彎曲的發(fā)生率分別為16%、10%、20%和3%；乙醇的致畸作用最弱,僅6%表現(xiàn)為身體彎曲。

圖1 有機(jī)溶劑對斑馬魚胚胎的致畸作用Note. A,The control zebrafish larvae (72 hours post-fertilization) had well-developed body and head regions. B,C,and D,Abnormalities in embryos exposed to different solvents. Abnormalities included pericardial edema (black arrows), hemorrhage (blue arrows), body curvature (red arrows), and yolk defects (purple).Figure 1 Teratogenic effects of solvents on zebrafish embryos

表1 不同有機(jī)溶劑暴露組斑馬魚胚胎的存活率和致畸率Table 1 Survival and teratogenicity rate in zebrafish embryos treated with different solvents

2.2 四種有機(jī)溶劑對斑馬魚眼睛大小的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn),對照組斑馬魚幼魚(n=30)眼睛長度/身體長度比值為(0.090±0.006),眼睛面積/身體面積比值為(0.066±0.006)；乙醇處理組斑馬魚幼魚(n=30)眼睛長度/身體長度比值為(0.087±0.045), 眼睛面積/身體面積比值為(0.058 ±0.007)；異丙醇處理組斑馬魚幼魚(n=30)眼睛長度/身體長度比值為(0.091±0.006),眼睛面積/身體面積比值為(0.065±0.006)；丙酮處理組斑馬魚幼魚(n=30)眼睛長度/身體長度比值為(0.090±0.003), 眼睛面積/身體面積比值為(0.056 ±0.008)；DMSO 處理組斑馬魚幼魚(n=30)眼睛面積/身體面積比值為(0.041±0.004)。 方差分析顯示,斑馬魚幼魚眼睛長度/身體長度比值在有機(jī)溶劑暴露組和對照組之間沒有顯著差異；但是DMSO暴露組斑馬魚幼魚眼睛面積/身體面積比值顯著低于其他組(P＜0.05,見圖2)。

2.3 四種有機(jī)溶劑對斑馬魚眼睛視網(wǎng)膜的影響

為了觀察有機(jī)溶劑對斑馬魚視網(wǎng)膜發(fā)育的影響,組織免疫熒光染色顯示,與對照組相比,四種有機(jī)溶劑暴露組的視網(wǎng)膜分層均為正常(見圖3),但DMSO 暴露組視錐細(xì)胞排列紊亂(見E3)。兩組間t 檢驗顯示,乙醇、異丙醇、丙酮和DMSO 暴露組視桿細(xì)胞(Zpr3)和視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞(Zn12)平均熒光強(qiáng)度較正常組顯著減低(P＜0.05),而暴露組視錐細(xì)胞(Zpr1)平均熒光強(qiáng)度較正常組減低,但僅有乙醇和DMSO 暴露組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(見圖4)。

圖2 不同有機(jī)溶劑暴露組斑馬魚幼魚(72 hpf)眼/體長度比值和眼/體面積比值Note. CN, contrl group. ETH, ethanol exposed group. ISO,isopropanol exposed group. MET, methanol exposed group.DMSO,dimethyl sulfoxide exposed group,*P＜0.05.Figure 2 Eye to body length and area ratio in embryos treated with different solvents

圖3 不同有機(jī)溶劑暴露組斑馬魚幼魚(72 hpf)視網(wǎng)膜細(xì)胞免疫熒光染色Note. DAPI staining for nuclei showed the lamination of the retina.As in the control group (A-1), the retinas in the solvent-treated groups (B-1, C-1, D-1, and E-1) were segregated into three nuclear layers, including ONL, INL, and GCL. Zpr1 (cone cell),Zpr3 (rod cell), and Zn12 (retinal neurons) immunostaining showed the cone photoreceptors (A-2, B-2, C-3, D-3, and E-3),cod photoreceptors (A-4, B-4, C-4, D-4, and E-4), and neurons(A-5, B-5, C-5, D-5, and E-5). The results showed there were no differences in cone photoreceptors, cod receptors, or neurons between the solvent-treated groups and control group, except thinner laminations of the retina were observed after treatment with 2.5%DMSO.Figure 3 Immunostaining of retinal cells in embryos treated with different solvents

圖4 各組視錐細(xì)胞、視桿細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞免疫熒光染色熒光強(qiáng)度Note. CN, Control group. ETH, ethanol exposed group. ISO,isopropanol exposed group. MET, methanol exposed group.DMSO,dimethyl sulfoxide exposed group. Zpr1, cone cell.Zpr3, rod cell. Zn12, retinal neurons,*P＜0.05.Figure 4 Fluorescence intensity of immunofluorescence staining of cones, rod cells and neurons in each group

3 討論

由于眼睛發(fā)育與人類的相似性及在藥物篩選方面的優(yōu)勢,斑馬魚越來越多地被用于人類眼睛疾病發(fā)病機(jī)制研究及治療藥物的篩選和研發(fā)。 但是通常情況下,很多藥物不能溶解于水中,需要載體如有機(jī)溶劑乙醇、丙酮等運(yùn)輸至動物體內(nèi)。 本研究觀察了四種有機(jī)溶劑乙醇、甲醇、異丙醇和DMSO對斑馬魚胚胎發(fā)育尤其是眼睛發(fā)育的影響。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),斑馬魚胚胎在該四種有機(jī)溶劑中暴露至72 hpf 的存活率均高于50%,這與之前的研究結(jié)果相似[13]。 本研究還發(fā)現(xiàn),不同有機(jī)溶劑對斑馬魚幼魚的形態(tài)存在不同程度的影響,乙醇影響最小,僅表現(xiàn)為身體彎曲,DMSO 影響最大,可導(dǎo)致幼魚出現(xiàn)心包水腫、出血、卵黃缺損和身體彎曲等異常。 但是,本研究中觀察到的致畸效應(yīng)比之前的研究更嚴(yán)重[12],可能是由于本研究中有機(jī)溶劑暴露時間較長所致。 另外,由于本研究未肉眼觀察到有機(jī)溶劑暴露組和對照組幼魚間眼睛形態(tài)的差異,所以測量了其眼睛的大小及眼睛長度/身體長度比值和眼睛面積/身體面積比值。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),DMSO 暴露組的眼/體面積比值顯著降低。 綜上結(jié)果,本研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)溶劑DMSO 對斑馬魚存活及生長發(fā)育的影響很大,提示本研究在進(jìn)行以斑馬魚為動物模型的相關(guān)研究中,最好不要選用DMSO 作為藥物或其他受試化合物的溶劑。

斑馬魚視網(wǎng)膜由三層組成,包括內(nèi)核層、外核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層,其中感光細(xì)胞主要位于外核層,而神經(jīng)節(jié)細(xì)胞位于靠近晶狀體的內(nèi)核層[13]。 本研究顯示,有機(jī)溶劑暴露的斑馬魚視網(wǎng)膜分為內(nèi)核層、外核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層,無明顯的分層缺陷。但是,DMSO 暴露組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)較其他組薄。 同時,除DMSO 外,其余三種有機(jī)溶劑對視網(wǎng)膜視錐細(xì)胞、桿狀細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)育的影響較小。

據(jù)文獻(xiàn)報道,胚胎乙醇暴露會影響視覺功能的發(fā)展,因此斑馬魚是胎兒酒精綜合征研究非常有價值的動物模型[14]。 然而,本研究未發(fā)現(xiàn)乙醇暴露的斑馬魚胚胎眼睛發(fā)育有明顯的形態(tài)學(xué)變化和視網(wǎng)膜發(fā)育缺陷。 這可能是由于本研究中所使用的乙醇濃度低所致。 另外的研究表明,乙醇在低濃度下會影響感光細(xì)胞功能,而不引起視網(wǎng)膜形態(tài)的異常[15]。 遺憾的是,由于經(jīng)費(fèi)有限,本研究中既未設(shè)置不同乙醇濃度暴露組,也未評估斑馬魚的視覺功能,所以本研究不知道0.5%乙醇暴露或更低的濃度是否會影響視覺功能。 因此,在乙醇作為有機(jī)溶劑載體時,需要測試不同濃度乙醇對視覺功能的影響。

綜上所述,本研究中所檢測的有機(jī)溶劑乙醇、丙酮和異丙醇可分別在0.5%、1.5%和1%水平下作為斑馬魚胚胎的載體溶劑而不會對其造成明顯影響。 然而,不同的實驗環(huán)境,魚的種類和胚胎不同的發(fā)育時期等因素都可能對有機(jī)溶劑的安全性產(chǎn)生影響[16]。 因此,本研究應(yīng)謹(jǐn)慎選擇有機(jī)溶劑作為藥物或其他化學(xué)受試品的溶解載體,并且應(yīng)該進(jìn)行預(yù)實驗來確定其最佳使用濃度。