李 蘇，顧繼山，吳曉宇，熊 蕓，孫國鋒，丁一剛，劉生鵬

武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430205

恩曲他濱（emtricitabine，F(xiàn)TC），化學(xué)名為4-氨基-5-氟-1-［（2R，5S）-2-羥甲基-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷-5-基］-2（1H）-嘧啶酮，是一種核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。該藥由美國Gilead 公司開發(fā)，于2003 年經(jīng)美國FDA 批準(zhǔn)上市，用于治療由人類免疫缺陷病毒（HIV）感染引起的艾滋病，以及乙型肝炎病毒（HBV）引起的乙型肝炎［1］。自上市以來，臨床證明FTC 的抗病毒失敗率低，治療效果好，是治療艾滋病和乙型肝炎最成功的藥物之一［2-3］。

傳統(tǒng)的FTC 濱合成路線主要采用化學(xué)合成的方法［4-6］，總收率均在29.8%～51%之間，且都存在成本高、反應(yīng)步驟多、毒性大和污染環(huán)境等缺點(diǎn)［7-8］。目前，由于脂肪酶具有高度的立體選擇性、熱穩(wěn)定性、底物廣泛性、催化活性、環(huán)境友好性和回收利用性等［9-11］，而被廣泛用于藥物的合成中［12-14］。本文在參考已報(bào)道的工藝基礎(chǔ)上［8，12，15］，以苯甲酸鈉2 和溴乙醛縮二乙醇3 為原料，縮合得到苯甲酰氧基乙醛縮二乙醇4，將4 在濃度為2.4 mol/L 鹽酸溶液中水解得到苯甲酰氧基乙醛5，5 與1，4-二噻烷-2，5-二醇6 在脂肪酶Novozyme 435 催化下得到（2R，5S）-2-苯甲酰氧甲基-5-乙酰氧基-l，3-氧硫雜環(huán)戊烷7，7 與硅烷化5-氟胞嘧啶8 進(jìn)行偶聯(lián)得到4-氨基-5-氟-1-［（2R，5S）-2-苯甲酰氧甲基-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷-5-基］-2（1H）-嘧啶酮9，將其水解后可得終產(chǎn)物FTC（圖1），總收率為51.3%，F(xiàn)TC 純度為99.7%。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker Avance NEO-600 MHz 型核磁共振波譜儀（德國Bruker 科技有限公司）；SHIMADZU CT0-20AC 高效液相色譜儀，SHIMADZU-2014 氣相色譜儀（日本島津儀器公司）；WRS-3A 熔點(diǎn)儀（上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司）；JASCO P-1030 自動(dòng)旋光儀（日本分光株式會(huì)社）。

苯甲酸鈉，1，4-二噻烷-2，5-二醇，5-氟胞嘧啶（阿拉丁生化科技股份有限公司）；溴乙醛縮二乙醇，三乙烯二胺，六甲基二硅胺烷（武漢格奧化學(xué)技術(shù)有限公司）；鹽酸，乙酸苯酯，正己烷，無水乙醇，三氟乙酸（上海麥克林生化科技有限公司）；四氫呋喃，N，N-二甲基甲酰胺，乙酸乙酯，二氯甲烷，三乙胺，甲醇等，（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；所有試劑均為分析純。Novozyme 435（諾維信公司）。

1.2 結(jié)果檢測

色譜柱：Chiralpak AD-H 柱（250 mm×4.6 nm，5 μm）；流動(dòng)相：V（正己烷）∶V（無水乙醇）∶V（甲醇）∶V（三氟乙酸）∶V（三乙胺）=800∶150∶50∶1∶1；柱溫：40 ℃；檢測器波長280 nm；流速設(shè)定為1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。精密稱取合成的FTC約5.0 mg，加入1 mL 甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，并用流動(dòng)相稀釋至刻度，制成濃度約為0.5 mg/mL 的溶液。結(jié)果得出目標(biāo)產(chǎn)物恩曲他濱1的純度為99.7%，符合中國藥典標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 苯甲酰氧基乙醛縮二乙醇（4）的合成 稱取化合物2（9.925 g，68 mmol）于1 L 三口燒瓶中，并加入N，N-二甲基甲酰胺（N，N-Dimethyl formamide，DMF，300 mL），加入3（19 mL，124.9 mmol），攪拌溶解，于135 ℃回流反應(yīng)2 h 后，再加入化合物2（9.925 g，68 mmol）繼續(xù)反應(yīng)14 h，TLC 監(jiān)測3消失。反應(yīng)完畢后，旋蒸除去DMF，加入乙酸乙酯溶解，分別用蒸餾水和飽和氯化鈉溶液洗滌，萃取有機(jī)層，無水硫酸鈉干燥，旋蒸除去溶劑，得到紅色粘稠液體26.25 g，收率88.2%。1H NMR（600 MHz，DMSO-d6），δ：8.07（d，2H，J=8.0 Hz，Ar-H），7.58（t，1H，J=7.4 Hz，Ar-H），7.45（t，2H，J=7.7 Hz，Ar-H），4.85（t，1H，J=5.5 Hz，-CH），4.36（d，2H，J=5.5 Hz，-CH2），3.71（q，4H，-CH2），1.23（t，6H，J=7.1 Hz，-CH3）。13C NMR（600 MHz，DMSO-d6），δ：166.27，133.06，130.04，129.73，128.39，99.75，64.47，62.54，15.36。與文 獻(xiàn)［8］一致。

圖1 FTC 的合成路線Fig.1 Synthesis route of FTC

1.3.2 苯甲酰氧基乙醛（5）的合成 稱取化合物4（3.0 g，12.6 mmol）、20 mL 四氫呋喃于50 mL 三口燒瓶中，升溫至60 ℃回流反應(yīng)，磁力攪拌下，滴加入2.4 mol/L（10 mL）的鹽酸。1 h 后，結(jié)束反應(yīng)。旋蒸除去四氫呋喃，加入乙酸乙酯溶解，用飽和碳酸氫鈉溶液和氯化鈉溶液洗滌，萃取有機(jī)層，無水硫酸鈉干燥，旋蒸除去溶劑。粗品經(jīng)層析柱純化，得到淺黃色油狀液體1.77 g，收率為84.7%。1H NMR（600 MHz，DMSO-d6），δ：9.73（s，1H，-CHO），7.96～8.17（d，2H，J=7.45 Hz，Ar-H），7.61（d，1H，J=7.2 Hz，Ar-H），7.48（d，2H，J=7.7 Hz，Ar-H），4.91（s，2H，-CH2）。13C NMR（600 MHz，DMSO-d6），δ：196.11，166.21，133.86，130.15，129.14，128.78，69.26。與文獻(xiàn)［8］一致。

1.3.3 （2R，5S）-2-苯甲酰氧甲基-5-乙酰氧基-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷（7）的合成 稱取化合物5（0.26 g，1.58 mmol）、6（0.14 g，0.95 mmol）、乙酸苯酯（0.6 mL，4.74 mmol）、三乙胺（0.22 mL，1.43 mmol）、DABCO（0.013 g，0.094 8 mmol，0.1 eq）溶于10 mL 無水四氫呋喃中，40 ℃回流反應(yīng)6 h。向反應(yīng)混合物中加入0.38 g 0.4 nm 分子篩，緩慢攪拌1 h，加入磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.4，3 mL），250 mg（25 mg/mL）Novozyme 435 繼續(xù)攪拌8 h 后停止。過濾反應(yīng)混合物，濾液用飽和氯化鈉溶液洗滌，萃取有機(jī)層，無水硫酸鈉干燥，旋蒸除去溶劑。粗品經(jīng)層析柱純化，得到無色油狀液體0.371 g，收率為82.1%，ee值為99%（文獻(xiàn)［8］為82%）。1H NMR（600 MHz，DMSO-d6），δ：8.05（d，2H，J=8.0 Hz，Ar-H），7.55（d，1H，J=7.2 Hz，Ar-H），7.43（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），5.43（t，1H，J=4.7 Hz，-CH），4.75～4.94（m，1H，-CH），4.01～4.57（m，2H，-CH2），2.97～3.24（m，2H，-CH2），2.04（s，3H，-CH3）。13C NMR（600 MHz，CDCl3），δ：171.31，166.01，133.21，129.75，128.44，100.06，81.10，66.42，38.69。與文獻(xiàn)［12］一致。

1.3.4 4-氨基-5-氟-1-［（2R，5S）-2-苯甲酰氧甲基-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷-5-基］-2（1H）-嘧啶酮（9）的制備 稱取5-氟胞嘧啶（0.52 g，4.0 mmol）、3 mL 六甲基二硅胺烷、0.1 g 催化劑硫酸銨、15 mL DMF 于100 mL 三口燒瓶中。升溫至100 ℃，回流反應(yīng)。反應(yīng)至反應(yīng)液澄清透明，停止反應(yīng)并旋蒸除去六甲基二硅胺烷，冷卻至室溫，得到化合物8。加入1.4 mL 三乙胺混合均勻以備用。

將化合物7（0.3 g，1.0 mmol）溶于6 mL 無水二氯甲烷中，倒入上述制備的8，并加入0.3 g 孔徑0.4 nm 分子篩，于80 ℃下回流攪拌反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入乙酸乙酯溶解，用飽和碳酸氫鈉溶液、蒸餾水和鹽水洗滌，萃取有機(jī)層，無水硫酸鈉干燥，旋蒸除去溶劑，用乙醇重結(jié)晶，得到粗產(chǎn)物混合物，為淺黃色粉末。不經(jīng)純化，直接進(jìn)入下一步。1.3.5 FTC（1）的合成 取化合物9（0.3 g，0.7 mmol）溶于50 mL 甲醇和50 mL 氨水溶液中混合，在室溫下攪拌10 h 后，抽濾，旋蒸除去溶劑，粗品經(jīng)層析柱純化，得到0.15 g 白色粉末，收率為83.6%，純度為99.7%，ee 值為99.5%。旋光度[α]25D=-119.4°（c 1.05，MeOH）［文 獻(xiàn)［4］為-116°，c 1.05，MeOH］；m.p.180～185 ℃；1H NMR（600 MHz，DMSO-d6），δ：8.19（d，1H，J=7.2 Hz，-CH），7.81（s，1H，NH），7.57（s，1H，NH），6.13（s，1H，NH），5.41（t，J=5.54 Hz，1H，-OH），5.17（t，1H，J=3.8 Hz，-CH），3.65～3.82（m，2H，-CH2），3.39（dd，1H，J=24.5 Hz，-CH2），3.12（dd，1H，J=11.9 Hz，4.3 Hz，-CH2）。13C NMR（600 MHz，DMSO-d6），δ：157.95，153.45，137.06，135.47，126.26，87.01，62.60，37.24。與文獻(xiàn)［7］一致。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物5 反應(yīng)條件優(yōu)化

考察了以88%甲酸水溶液、不同濃度鹽酸和對(duì)甲苯磺酸等作為H+供體時(shí)的反應(yīng)條件（表1）?？梢缘贸觯?dāng)反應(yīng)溫度由室溫升至60 ℃時(shí)，副產(chǎn)物乙醇蒸發(fā)，使反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行。并且，采用2.4 mol/L 鹽酸時(shí)，得到最高收率，88.2%。

表1 用于縮醛水解反應(yīng)的不同催化劑的反應(yīng)條件和結(jié)果*Tab.1 Reaction conditions and results over different catalysts used for hydrolysis reaction

2.2 脂肪酶催化合成化合物7 的優(yōu)化

2.2.1 溶劑對(duì)酶催化反應(yīng)的影響 酶促催化反應(yīng)中，酶的催化活性和立體選擇性會(huì)受到溶劑的logP 值和極性的影響，因此必須選擇合適的有機(jī)溶劑。選取除水處理后的甲苯、二氯甲烷、四氫呋喃、乙腈、甲醇和N，N-二甲基甲酰胺6 種有機(jī)溶劑進(jìn)行對(duì)比。從表2 可以看出，四氫呋喃作為溶劑時(shí)，轉(zhuǎn)化率和對(duì)映體選擇性最高。在強(qiáng)親水性溶劑（logP ＜0）中，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率很低，是因?yàn)橛H水性溶劑導(dǎo)致Novozyme 435 脂肪酶周圍必需的水層被剝離，脂肪酶的結(jié)構(gòu)被破壞，催化活性降低。而非極性溶劑（logP ＞2.5）的疏水性雖然能使酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，但是其對(duì)映體選擇性很低。

表2 溶劑對(duì)酶催化反應(yīng)的影響Tab.2 Effect of solvent on reaction of lipase-catalysis

2.2.2 溫度對(duì)催化反應(yīng)的影響 由于脂肪酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度會(huì)影響酶的活性、穩(wěn)定性和對(duì)映體選擇性，所以必須考察溫度對(duì)脂肪酶的催化反應(yīng)的影響。通常情況下，隨著溫度升高，反應(yīng)速度也隨之升高。當(dāng)升高到一定溫度后，酶逐漸變性，失去催化活性。本研究考察了25～70 ℃之間的影響，結(jié)果如表3 所示。可以看到，轉(zhuǎn)化率在40 ℃時(shí)達(dá)到最大值，因此選取40 ℃為最佳反應(yīng)溫度。

表3 溫度對(duì)酶催化反應(yīng)的影響Tab.3 Effect of temperature on lipase-catalysis reaction

3 結(jié) 論

本文優(yōu)化了FTC 的合成工藝路線。優(yōu)化了苯甲酰氧基乙醛5 的合成工藝；以及在關(guān)鍵中間體7的合成過程中，選取Novozyme 435 脂肪酶為催化脂肪酶用于催化反應(yīng)；在催化過程中確定了最佳反應(yīng)溶劑和反應(yīng)溫度，分別為四氫呋喃和40 ℃，得到ee 值＞99%，收率為82.1%的化合物7。經(jīng)過優(yōu)化后，得到總收率為51.3%，純度為99.7%的FTC。綜上所述，本文的研究內(nèi)容為其他不對(duì)稱手性化合物的合成提供了一種有參考價(jià)值的思路和方案。