吳一桂，馬華威，楊明偉，甘暉，盧小花，阮志德，呂敏

（1.防城港市漁業(yè)技術(shù)推廣站，廣西 防城港 538001；2.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；3.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021；4.廣西水產(chǎn)畜牧學(xué)校，廣西 南寧 530021）

黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco 肉味鮮美，魚肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高[1,2]。近年來(lái)，為了更好地發(fā)展黃顙魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，已對(duì)黃顙魚的生物學(xué)特性、養(yǎng)殖技術(shù)、苗種培育、疾病防治、飼料配制等進(jìn)行了多方面研究[3]。研究表明，養(yǎng)殖密度越大，魚類個(gè)體空間縮小，溶解氧含量降低，食物競(jìng)爭(zhēng)加劇，抑制魚類的消化、吸收等生理過(guò)程。個(gè)體生存空間減小其活動(dòng)行為、攝食生長(zhǎng)、能量代謝及免疫功能隨著大腦神經(jīng)調(diào)節(jié)分泌酶、激素等作用，其指標(biāo)也隨之發(fā)生變化，影響其生存能力和養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益[4]。低密度養(yǎng)殖，養(yǎng)殖空間利用不充分，養(yǎng)殖水體的效益降低；高密度養(yǎng)殖，雖然養(yǎng)殖空間得到了充分利用，但密度不合理會(huì)對(duì)魚類的生長(zhǎng)和品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響[5,6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究網(wǎng)箱養(yǎng)殖密度對(duì)黃顙魚的存活和生長(zhǎng)的影響，以期為黃顙魚人工網(wǎng)箱養(yǎng)殖設(shè)置適宜密度、提高養(yǎng)殖產(chǎn)量等提供參考。

抗菌肽是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)而產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)，由20～60 個(gè)氨基酸殘基組成。這類活性多肽多具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定以及廣譜抗菌等特點(diǎn),與抗生素和靶標(biāo)有不同的作用機(jī)制，不受傳統(tǒng)抗生素耐藥突變株影響，不易產(chǎn)生耐藥菌株、與傳統(tǒng)抗生素有協(xié)同作用、中和內(nèi)毒素等特性[7]。有研究表明：飼料中添加抗菌肽，具有促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化率、增強(qiáng)免疫功能等優(yōu)點(diǎn)而受到研究者關(guān)注[8-10]?？咕淖鳛橐环N新型添加劑，對(duì)其體外功能進(jìn)行了大量的研究，但相關(guān)的生產(chǎn)實(shí)踐研究并不多見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究在飼料添加抗菌肽對(duì)網(wǎng)箱養(yǎng)殖的黃顙魚生長(zhǎng)性能、體成分和免疫活性的影響，旨在為抗菌肽在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用網(wǎng)箱規(guī)格為2.0m 長(zhǎng)×2.0m 寬×2.0m高，箱架由鍍鋅鋼管焊接而成，用加侖塑料桶作浮具，網(wǎng)箱順流呈“一”字形排列，箱距1m，相互連接。網(wǎng)衣用聚乙烯合線編結(jié)成的雙層網(wǎng)，內(nèi)層網(wǎng)目為1cm，外層網(wǎng)目為2cm。網(wǎng)衣上端用聚乙烯繩索固定于箱架上部，高出水面35cm，底部四角各系上磚塊固定形狀，防止底部浮起。黃顙魚種入箱前20d 將網(wǎng)衣全部固定水中，使其有充分時(shí)間附生水生藻類，避免魚種入箱后擦傷魚體[11,12]。

實(shí)驗(yàn)用黃顙魚種購(gòu)自廣東某水產(chǎn)良種基地，為當(dāng)年孵化苗種，規(guī)格均勻、體色正常、活潑健康、無(wú)傷無(wú)病。下箱前，用食鹽水（3%）浸浴5min，以殺滅魚體表面病原菌和寄生蟲(chóng)。

實(shí)驗(yàn)用基礎(chǔ)飼料采購(gòu)防城港岳泰股份有限公司浮性顆粒配合飼料，粒徑?=2mm。實(shí)驗(yàn)用抗菌肽采購(gòu)自上海邦成生物工程有限公司。

1.2 方法

本實(shí)驗(yàn)于2017 年5 月15 日—7 月24 日在長(zhǎng)年水質(zhì)清澈、無(wú)污染的上思縣上伴水庫(kù)進(jìn)行。網(wǎng)箱設(shè)置在水流稍緩、風(fēng)浪小、水面開(kāi)闊、避風(fēng)向陽(yáng)的地方。實(shí)驗(yàn)期間，水庫(kù)水深35～50m，水位相對(duì)穩(wěn)定，透明度85～100cm，pH7.19～8.22，溶氧量（DO）5.04～11.71mg/L，水溫19.1～23.2℃。

1.2.1 養(yǎng)殖密度實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)設(shè)4 個(gè)密度：2kg/m3（D1）、3kg/m3（D2）、4kg/m3（D3）和5kg/m3（D4）。2017 年5 月15 日魚種入箱養(yǎng)殖，第2d 開(kāi)始投喂，實(shí)驗(yàn)過(guò)程采用常規(guī)養(yǎng)殖方式（表1）。

投喂浮性顆粒配合飼料（防城港岳泰股份有限公司），粒徑?=2mm，投喂飼料營(yíng)養(yǎng)水平：粗蛋白質(zhì)38.03%、粗脂肪9.12%、粗灰分12.24%、水分10.07%、總能18.62MJ/kg。

1.2.2 抗菌肽實(shí)驗(yàn)

在基礎(chǔ)飼料表面噴灑不同劑量的抗菌肽（水溶），添加量分別為：10mg/kg（G1）、30mg/kg（G2）、60mg/kg（G3）和100mg/kg（G4），然后用海藻酸鈉（劑量250mL，0.5%）包埋，自然風(fēng)干備用。黃顙魚的放養(yǎng)密度為3 kg/m3，以基礎(chǔ)飼料為對(duì)照組（CK 組），實(shí)驗(yàn)持續(xù)70d。每天8:00、12:30 和17:30 投喂三次，日投飼量為黃顙魚體質(zhì)量的5%～8%，視攝食情況調(diào)整。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目

生長(zhǎng)性能測(cè)定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后停食12h，測(cè)定各組魚體質(zhì)量、體長(zhǎng)，計(jì)算日增重（DWG）、增重率（DBW）、成活率（SR）、特定生長(zhǎng)率（SGR）、飼料系數(shù)（FC）和肥滿度（K）。

DWG（g/d）=（Wt-W0）/t；

DBW（%）=100×（Wt-W0）/Wt；

SR（%）=Nt/N0×100；

FC=F/（Wt-W0）；

SGR（%/d-1）=（lnWt'-lnW0'）/t×100；

K=W/L3×100；

式中，W0與Wt分別表示實(shí)驗(yàn)前后各實(shí)驗(yàn)箱魚體總質(zhì)量（g），N0代表實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)魚尾數(shù)，Nt代表實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)魚尾數(shù)，t 為實(shí)驗(yàn)天數(shù)（d），F(xiàn) 為相應(yīng)各實(shí)驗(yàn)箱所投喂的飼料質(zhì)量（g），W0' 與Wt'分別表示實(shí)驗(yàn)前后各實(shí)驗(yàn)網(wǎng)箱魚平均質(zhì)量（g），W 表示魚體質(zhì)量（g），L 代表體長(zhǎng)（cm）。

酶活性的測(cè)定：過(guò)氧化物酶（CAT）及超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定，稱取一定質(zhì)量肝臟和脾臟，加入4℃生理鹽水9 倍質(zhì)量，冰水中勻漿，5000r/min 離心15min，分離上清液，待用；溶菌酶（LSZ）測(cè)定需進(jìn)行血清制備，方法每組隨機(jī)取魚10 尾，采用斷尾采血法取血約1mL，分別存放于1.5mL 的離心管中，室溫靜置2h，4℃時(shí)9000r/min 離心10min，分別吸取上層血清備用，分裝2 份，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。CAT、SOD 與LSZ 的測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物技術(shù)研究所。各酶活測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒操作指南執(zhí)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（mean±SE）表示，用SPSS 13.0 進(jìn)行單因素方差分析和Duncan’s多重比較。

表1 實(shí)驗(yàn)中黃顙魚種的初始規(guī)格及放養(yǎng)密度Tab.1 Size and stocking density of yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco during the experiment

表2 不同密度下黃顙魚的生長(zhǎng)性能（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Tab.2 Growth parameters of yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco at different stocking densities

2 結(jié)果與分析

2.1 不同密度黃顙魚生長(zhǎng)性能比較

由表2 可知，D1、D2 和D3 組的存活率在87%以上，各組間差異不顯著（P＞0.05），而D4 組的SR較低（85.4%），與其余3 組間差異顯著（P＜0.05）。密度為2kg/m3和3kg/m3時(shí)，魚體K、FC 無(wú)顯著差異（P＜0.05）。魚終末體質(zhì)量隨養(yǎng)殖密度的增大而下降，D1 和D2 無(wú)顯著性差異，與D3、D4 差異顯著（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組D1、D2 和D3 隨著養(yǎng)殖密度的增大，DWG、DBW、終末體長(zhǎng)、K、SGR 遞減，差異顯著（P＜0.05）。

2.2 抗菌肽對(duì)黃顙魚生長(zhǎng)性能的影響

由表3 可知，GK、G1、G2、G3 組黃顙魚的DBW、SGR 和K 隨著抗菌肽添加量的增加而上升，但G4 組出現(xiàn)了下降趨勢(shì)。10mg/kg 添加量與對(duì)照組CK 無(wú)顯著性差異（P＞0.05），60mg/kg 和90mg/kg 組生長(zhǎng)性能無(wú)顯著差異（P＞0.05）。當(dāng)添加量30mg/kg到60mg/kg 時(shí)，DBW、SGR、K 差異顯著（P＜0.05），60mg/kg 時(shí)DBW、SGR 和K 最高，高于其余各組，F(xiàn)C呈下降趨勢(shì)。值得注意的是，當(dāng)添加量從60mg/kg 到90mg/kg 時(shí)，DBW、SGR、K 下降，說(shuō)明過(guò)高劑量抗菌肽對(duì)DBW、SGR、K 等有一定的負(fù)面影響。

2.3 抗菌肽對(duì)黃顙魚SOD、CAT 與LSZ 活性的影響

由表4 可知，添加10mg/kg 抗菌肽組黃顙魚的CAT 活性最高，顯著高于60mg/kg、90mg/kg 和對(duì)照組（P＜0.05）；SOD 活性的變化趨勢(shì)同CAT 相似，但90mg/kg 組顯著低于其余各組（P＜0.05）；隨著飼料中抗菌肽添加量的增加，血清中LSZ 的活性增強(qiáng)，以30mg/kg 組活性達(dá)到最高，到90mg/kg 的LSZ 活性顯著下降，低于其余各組（P＜0.05）,與其他各組差異顯著（P＜0.05）。

3 討論

3.1 養(yǎng)殖密度對(duì)黃顙魚生長(zhǎng)性能的影響

關(guān)于魚類養(yǎng)殖密度的研究已有較多報(bào)道，養(yǎng)殖密度對(duì)不同魚類和不同生長(zhǎng)階段的影響不一。本實(shí)驗(yàn)中，在初始密度為2kg/m3、3kg/m3、4kg/m3的網(wǎng)箱中，黃顙魚的日增重、最終體質(zhì)量、特定生長(zhǎng)率都隨著養(yǎng)殖密度的增大而降低，與西伯利亞雜交鱘Acipenser baerii[13]的結(jié)果相一致。一般情況下，養(yǎng)殖密度增大魚類對(duì)水體的空間、溶解氧及食物競(jìng)爭(zhēng)越大，抑制了生長(zhǎng)及飼料效率，密度脅迫影響黃顙魚的生長(zhǎng)和代謝[14-16]，生長(zhǎng)抑制通常可反映慢性應(yīng)激的狀況[17-19]。低密度養(yǎng)殖條件下成活率較高是由于黃顙魚對(duì)空間、餌料等資源的個(gè)體競(jìng)爭(zhēng)較小所致。本實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖密度為2kg/m3和3kg/m3組的FC 無(wú)顯著差異，而楊嚴(yán)鷗等[19]研究養(yǎng)殖密度對(duì)黃顙魚飼料利用效率的差異時(shí)，發(fā)現(xiàn)飼料轉(zhuǎn)化效率隨著養(yǎng)殖密度的增加顯著下降。本實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖密度2kg/m3、3kg/m3、4kg/m3情況，終末體質(zhì)量呈14.18%和14.96%下降，當(dāng)養(yǎng)殖密度達(dá)到5kg/m3時(shí)，酶活性顯著下降（P＜0.05），這與姚清華等[20]瓦氏黃顙魚Pelteobagrus vachelli實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相一致。

表3 不同劑量抗菌肽下黃顙魚的生長(zhǎng)性能Tab.3 Growth performance of yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco fed diets containing different levels of antimicrobial peptides（n=9,+SE）

表3 不同劑量抗菌肽下黃顙魚的生長(zhǎng)性能Tab.3 Growth performance of yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco fed diets containing different levels of antimicrobial peptides（n=9,+SE）

表4 不同劑量抗菌肽對(duì)黃顙魚肝臟及血清中幾種酶活性的影響Tab.4 Effects of dietary antimicrobial peptides on activities of catalase（CAT）,lysozyme（LSZ）and superoxide dismutase（SOD）in liver and serum of yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco（n=9,+SE）

表4 不同劑量抗菌肽對(duì)黃顙魚肝臟及血清中幾種酶活性的影響Tab.4 Effects of dietary antimicrobial peptides on activities of catalase（CAT）,lysozyme（LSZ）and superoxide dismutase（SOD）in liver and serum of yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco（n=9,+SE）

高密度擁擠脅迫作為一種環(huán)境脅迫因子引起魚類的應(yīng)激反應(yīng)，影響個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育[21]。限制網(wǎng)箱養(yǎng)殖黃顙魚放養(yǎng)密度的水質(zhì)因素包括水溫、水流速、鹽度、溶解氧、pH 和光照度等，限制其營(yíng)養(yǎng)方面的因素包括攝食率及食物轉(zhuǎn)化率等。因此，在生產(chǎn)中可根據(jù)這些養(yǎng)殖條件合理設(shè)置密度，使魚飼料系數(shù)、生長(zhǎng)效率和肥滿度等指標(biāo)均達(dá)最佳水平。

3.2 添加不同劑量抗菌肽對(duì)黃顙魚生長(zhǎng)性能的影響

黃滄海等[21]發(fā)現(xiàn)，飼料中添加農(nóng)肽寶有利于提高羅非魚幼魚的肥滿度?？咕淖鳛樗a(chǎn)飼料添加劑，能夠耐受飼料制粒時(shí)的高溫，可提高魚類的生長(zhǎng)性能，更重要的是其僅作用于發(fā)生病變的原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，而對(duì)魚類機(jī)體正常細(xì)胞并無(wú)殺傷作用[8-10]。本實(shí)驗(yàn)將抗菌肽添加到魚飼料中網(wǎng)箱養(yǎng)殖黃顙魚，添加量在0～60mg/kg 時(shí)，成活率無(wú)明顯變化，DBW、SGR 及K 顯著提高，當(dāng)添加量大于60mg/kg時(shí)，DBW、SGR 及K 顯著下降。本結(jié)果表明，適量的抗菌肽可顯著促進(jìn)黃顙魚的生長(zhǎng)。

3.3 不同劑量的抗菌肽對(duì)黃顙魚肝臟中SOD 活性、CAT、LSZ 活性的影響

CAT、SOD 和LSZ 作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的組成部分,其活力的高低反映了機(jī)體的免疫防御能力，是評(píng)價(jià)魚類免疫力的常用指標(biāo)。CAT 是重要的酶促防御系統(tǒng)之一，主要集中于紅細(xì)胞與過(guò)氧化物酶體中，可以清除H2O2，分解氫氧自由基，其活性高低與抗逆性密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)飼料中添加10mg/kg 與30mg/kg 抗菌肽時(shí)，CAT 活性顯著提高，表明只需小劑量抗菌肽就可大幅提高CAT 活性。SOD 是一種清除超氧化物自由基的酶,其功能是催化超氧陰離子O2-歧化為H2O2和O2,免除自由基對(duì)機(jī)體的危害，肝臟中SOD 活性的高低反映了器官組織抗氧化能力的大小，是機(jī)體免疫水平以及健康狀況的重要指標(biāo)[24]。LSZ 是非特異性免疫的主要成分,可以直接分解細(xì)菌，起到抵抗細(xì)菌感染的作用。本實(shí)驗(yàn)飼料中添加10mg/kg 時(shí)，SOD 活性提高了28.1%，但劑量達(dá)到60mg/kg 時(shí)，活性顯著下降（P＜0.05），說(shuō)明適量添加抗菌肽可提高機(jī)體抗氧化酶活性,與陳冰等[23]的研究結(jié)果較為一致；但劑量≥60mg/kg 時(shí)，SOD 與LSZ 的活性顯示有顯著的負(fù)面影響,推斷可能是高劑量抗菌肽毒性變強(qiáng),破壞了肝臟組織結(jié)構(gòu)或?qū)е旅富钚韵陆礫24]。關(guān)于抗菌肽使用劑量、添加時(shí)間長(zhǎng)短及作用效果的確切關(guān)系還存在許多的疑問(wèn)，有待深入研究。

3.4 結(jié)論

為了保障黃顙魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖健康生長(zhǎng)，降低生產(chǎn)成本，即具有較高的成活率、日增重及增重率，建議網(wǎng)箱養(yǎng)殖密度小于或等于4 kg/m3，飼料中可添加不超過(guò)60 mg/kg 的抗菌肽。