李琳，梁輝，陳俗汝，劉迎佳，王維香

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川 成都 610039）

隨生活水平的不斷提高，人們更加關(guān)注食品衛(wèi)生質(zhì)量，愈發(fā)注重飲食安全健康。因此，建立食品相關(guān)物質(zhì)的快速毒性評(píng)價(jià)和致病機(jī)理研究平臺(tái)顯得尤為重要。

亞硝酸鹽作為良好的防腐劑和發(fā)色劑廣泛應(yīng)用于肉制品加工中，然而，有研究發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽急性中毒易致機(jī)體缺氧，容易導(dǎo)致肝臟組織的損傷[1,2]。陳永芳[3]通過(guò)建立亞硝酸鹽暴露小鼠模型研究了亞硝酸鹽對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響，結(jié)果表明亞硝酸鹽能降低小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，降低程度與亞硝酸鹽濃度呈劑量效應(yīng)。另有實(shí)驗(yàn)表明：亞硝酸鹽能引起小鼠不孕，或大鼠睪丸毒性[4-6]。斑馬魚Danio rerio 為新興的模式生物，在毒性研究方面與人類基因有87%的相似基因而具有獨(dú)特的作用[7]。本實(shí)驗(yàn)以斑馬魚為模式生物，通過(guò)研究亞硝酸鹽的急性毒性，觀察亞硝酸鹽對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的致死、孵化和畸形效應(yīng)，比較NaNO2和KNO2對(duì)斑馬魚胚胎的毒害效應(yīng)，以期為評(píng)估亞硝酸鹽的毒性和研究亞硝酸鹽對(duì)人體的影響提供食品安全評(píng)價(jià)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用野生型斑馬魚雌雄成魚，體形正常，鱗和鰭無(wú)損，游動(dòng)靈活，捕食敏捷。

實(shí)驗(yàn)藥品為NaNO2、KNO2、NaCl、KCl、NaHCO3、CaCl2、苯氧乙醇、吖啶橙（成都科龍?jiān)噭┯邢薰?，分析純）?/p>

實(shí)驗(yàn)用斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（青島中科海海水處理有限公司），恒溫培養(yǎng)箱（CB1350，上海皓莊儀器有限公司），SZX10 型OLYMPUS 顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社OLYMPUS CORPORATION）。

1.2 方法

1.2.1 胚胎培養(yǎng)液配制

分別稱取3.500g 的NaCl、0.050g 的KCl、0.025g的NaHCO3、0.100g 的CaCl2溶解于純凈水中，定容至1L 作為胚胎培養(yǎng)液。

1.2.2 處理液的配制

配制8.0 mg/mL NaNO2母液，將母液用胚胎培養(yǎng)液分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL 和2.0 mg/mL 的處理溶液；配制10.0 mg/mL KNO2母液，將母液用胚胎培養(yǎng)液分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL 和3.0 mg/mL 的處理溶液。

1.2.3 胚胎收集和處理

成年斑馬魚飼養(yǎng)在置于14 h∶10 h 的明暗交替系統(tǒng)下的3 升養(yǎng)殖水箱中，水箱中裝有處于循環(huán)系統(tǒng)中脫氯和紫外線消毒的養(yǎng)殖水。養(yǎng)殖水溫度保持在26.0～（28.5±1）℃，電導(dǎo)率保持在500～（750±50）s，酸堿度保持在6.9～（7.5±0.5），溶解氧飽和度等于或高于95%。成魚每天用人工飼料（德國(guó)TetraMin）和活的豐年蝦喂養(yǎng)2 次，每周6 天。

實(shí)驗(yàn)前一天，按2∶1 的比例選取健康的性成熟活潑雄、雌斑馬魚放入盛有養(yǎng)殖水的交配盒中，用隔板隔開，遮光處理。第二天將隔板取走，光刺激，雌雄魚追逐開始產(chǎn)卵，記錄產(chǎn)卵時(shí)間。30 min 內(nèi)將魚卵挑出、清洗干凈至無(wú)異物附著，受精后5～6hpf（hours post fertilization）在體式顯微鏡下觀察選擇發(fā)育正常的胚胎放入盛有5.0 mL 處理液的6 孔板中，每孔30 個(gè)胚胎，置于（28.5±0.5）℃的恒溫培養(yǎng)箱中暴露至96 hpf。期間，每隔24 h，換新鮮處理液。分別在24 hpf、48 hpf、72 hpf 和96 hpf 時(shí)觀察記錄胚胎死亡、孵化、畸形情況，以及24 hpf 時(shí)測(cè)定胚胎5 min 內(nèi)的自主活動(dòng)次數(shù)，48 hpf 時(shí)測(cè)胚胎20s 內(nèi)的心跳次數(shù)，72 hpf 時(shí)測(cè)量孵出仔魚體長(zhǎng)。用改良寇式法[8]計(jì)算NaNO2和KNO296 hpf 的LC50（導(dǎo)致胚胎死亡50%時(shí)的濃度），EC50（導(dǎo)致胚胎致畸50%時(shí)的濃度）以及IC50（抑制50%胚胎孵出時(shí)的濃度），重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，并用Excel 單因素顯著差異法統(tǒng)計(jì)分析對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間各測(cè)定指標(biāo)結(jié)果的差異性（P＜0.05）。

1.2.4 胚胎細(xì)胞凋亡熒光染色

96 hpf 時(shí)將六孔板中孵出仔魚用胚胎液洗一次，每孔加入2.5mL 2.0mg/L 吖啶橙染色液，暗處理30min；隨后用胚胎培養(yǎng)液清洗三次，每次靜置5min；加入1.0mL 0.08%苯氧乙醇，麻醉后置熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度并用Image J 軟件分析熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同亞硝酸鹽對(duì)斑馬魚胚胎孵化率、致畸率和致死率的影響

正常胚胎在48 hpf 時(shí)開始孵出，72 hpf 內(nèi)全部孵出。由圖1-A 可知，亞硝酸鹽處理組隨處理濃度增大，孵化率下降，并呈劑量效應(yīng)，表明亞硝酸鹽對(duì)斑馬魚胚胎孵化有抑制作用。用改進(jìn)寇氏法計(jì)算NaNO2和KNO2對(duì)斑馬魚胚胎的96 hpf-IC50分別為0.84 mg/mL 和1.04 mg/mL，表明NaNO2對(duì)斑馬魚孵化抑制程度強(qiáng)于KNO2。

由圖1-B 可見，經(jīng)NaNO2和KNO2處理后，斑馬魚胚胎均在48 hpf 時(shí)開始出現(xiàn)異常，并隨濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，畸形率增加，呈劑量效應(yīng)，表明亞硝酸鹽誘導(dǎo)斑馬魚胚胎發(fā)育畸形。NaNO2和KNO2對(duì)斑馬魚胚胎的96 hpf-EC50分別為1.12 mg/mL 和1.50 mg/mL，表明NaNO2對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的致畸效應(yīng)強(qiáng)于KNO2。

圖1 不同亞硝酸鹽對(duì)斑馬魚的孵化率（A）、畸形率（B）和死亡率（C，96hpf）的影響Fig.1 Effects of nitrite on hatching rate（A），deformity rate（B）and mortality rate（C,96hpf）of zebrafish

NaNO2和KNO2對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的致死率見圖1-C。由圖1-C 可知：在72hpf 內(nèi)，各個(gè)濃度的NaNO2和KNO2處理液對(duì)斑馬魚胚胎并無(wú)致死性。在96 hpf 時(shí)，0.4 mg/mL 和0.8 mg/mL NaNO2的低濃度處理液的致死率不高，分別為2.23%和4.43%；1.2 mg/mL、1.6 mg/mL、2.0mg/mL NaNO2處理液的致死率分別為28.00%、41.33%以及81.67%。0.5 mg/mL 和1.0 mg/mL KNO2處理液在低濃度的致死率較低，兩者均為4.44%，在1.5 mg/mL 時(shí)致死率開始迅速上升，死亡率為8.89%，2.0 mg/mL、3.0 mg/mL處理液的致死率分別為22.22%、53.33%。亞硝酸鹽處理導(dǎo)致斑馬魚胚胎死亡且致死率與亞硝酸鹽濃度呈劑量效應(yīng)。NaNO2和KNO2對(duì)斑馬魚胚胎的96 hpf-LC50分別為1.30mg/mL 和1.44 mg/mL，表明NaNO2對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的致死性大于KNO2。

2.2 不同亞硝酸鹽對(duì)斑馬魚胚胎自主活動(dòng)、心率、體長(zhǎng)的影響

由圖2-A 可知，在不同濃度亞硝酸鹽處理液下，斑馬魚自主活動(dòng)受到抑制。隨著處理液濃度的增加，抑制作用也逐漸增強(qiáng)，且在0.5 mg/mL 和1.0mg/mL KNO2時(shí)有顯著性差異（P＜0.05）。

圖2 不同亞硝酸鹽對(duì)斑馬魚自主活動(dòng)次數(shù)（24hpf）（A）、心率（48hpf）（B）以及體長(zhǎng)（72hpf）（C）的影響Fig.2 Effect of nitrite on the number of independent activities（24hpf）（A）、heart-beating rate （48hpf）（B）and body length（72hpf）（C）of zebrafish

由圖2-B 可知，48hpf 時(shí)空白組的胚胎每20s內(nèi)心跳45 次，隨著NaNO2濃度增大，斑馬魚胚胎心率逐漸降低，2.0mg/mL 時(shí)差異顯著，各KNO2溶液濃度對(duì)斑馬魚心率的影響較小。

由圖2-C 可知，在72hpf 時(shí)的斑馬魚仔魚平均體長(zhǎng)為3400.00μm。隨著NaNO2、KNO2濃度增加體長(zhǎng)減小，但兩者對(duì)斑馬魚仔魚體長(zhǎng)的影響無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 不同亞硝酸鹽導(dǎo)致斑馬魚胚胎畸形

顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)（圖3-B 和3-C），NaNO2和KNO2處理斑馬魚均存在心包水腫、脊柱彎曲、頭部卵黃不同程度發(fā)黑等畸形現(xiàn)象，且以頭部發(fā)黑為主，其次是脊柱彎曲，最后是心包水腫，部分胚胎發(fā)育遲緩且伴隨著一定程度的頭部發(fā)黑與心包水腫，表明NaNO2和KNO2對(duì)斑馬魚的毒害機(jī)理相似。96hpf 時(shí)，2.0 mg/mL NaNO2處理導(dǎo)致斑馬魚頭部發(fā)黑、脊柱彎曲、心包水腫的畸形各占比分別為90.00%、87.78%和33.33%，而3.0mg/mL KNO2處理導(dǎo)致畸形各占比分別為50.00%、53.33%和18.89%（圖3-D），表明NaNO2對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的致畸性更嚴(yán)重。

2.4 亞硝酸鹽誘導(dǎo)斑馬魚胚胎細(xì)胞死亡

圖3 不同亞硝酸鹽對(duì)斑馬魚胚胎形態(tài)發(fā)育致畸的影響Fig.3 Effect of nitrite on morphological developmental deformity of zebrafish embryos

圖4 NaNO2 處理導(dǎo)致斑馬魚胚胎死亡Fig.4 Effect of NaNO2 on cell death of zebrafish embryos

吖啶橙熒光染色可以反映細(xì)胞死亡情況[9]。由圖4-A 可知，對(duì)照組斑馬魚的頭部、卵黃囊有較淺的綠色，說(shuō)明在正常生長(zhǎng)過(guò)程中有少許細(xì)胞凋亡，且主要集中在頭部、卵黃部。隨著亞硝酸鹽濃度的增加，斑馬魚頭部和卵黃熒光色增加，在1.6mg/mL和2.0mg/mL NaNO2下，頭部、卵黃部熒光色最明顯。隨處理液中亞硝酸鹽濃度增加，死亡細(xì)胞數(shù)增多，脊柱也出現(xiàn)不同程度的熒光色，表明脊柱已受到毒害作用，且毒害作用與NaNO2濃度呈劑量效應(yīng)。用Image J 軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析顯示（圖4-B），NaNO2濃度在1.6mg/mL 和2.0mg/mL 時(shí)差異顯著（P＜0.05）。

3 討論

斑馬魚是研究脊椎動(dòng)物發(fā)育的理想模型。其易發(fā)生基因突變，體表形態(tài)上會(huì)有明顯的變化，這為研究基因組、蛋白質(zhì)組學(xué)提供了很好的實(shí)驗(yàn)材料。在毒理學(xué)研究和污染控制中，它用于各類標(biāo)準(zhǔn)化的化學(xué)品和排放物的急、慢性毒性試驗(yàn)[10]。亞硝酸鹽在肉制品、腌制品等中普遍應(yīng)用，研究亞硝酸鹽對(duì)人體、動(dòng)物、環(huán)境的毒害作用有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽對(duì)斑馬魚生長(zhǎng)的毒害主要表現(xiàn)為自主活動(dòng)和心跳次數(shù)減少、體長(zhǎng)變短、心包水腫、脊柱彎曲、卵黃異常、頭部發(fā)黑等，這與Simmons 等[11]的研究結(jié)果一致，同時(shí)與龍虎斑（Epinephelus lanceolatus×E.fuscoguttatus）、大刺鰍Mastacembelus aculeatus 幼魚的中毒癥狀相似。兩者暴露在亞硝酸鹽環(huán)境中均體色加深、鰓絲呈棕色、魚體失去平衡側(cè)躺，最終死亡[12,13]。NaNO2暴露能降低斑馬魚心跳次數(shù)，說(shuō)明其對(duì)斑馬魚的心臟發(fā)育有一定毒害作用。李俊博等[14]研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽以濃度依賴的方式致斑馬魚瓣膜發(fā)育的毒性效應(yīng)，胚胎心臟水腫等發(fā)育異常,其作用的時(shí)間自36hpf 起。從48hpf 開始，過(guò)量的亞硝酸鹽影響房室通道處的心內(nèi)膜墊發(fā)生,導(dǎo)致在76hpf 時(shí)斑馬魚的瓣膜發(fā)育明顯缺失。實(shí)驗(yàn)測(cè)得72hpf 時(shí)亞硝酸鹽處理的斑馬魚仔魚體長(zhǎng)短于對(duì)照組，表明亞硝酸鹽抑制斑馬魚生長(zhǎng)。Vosláová 等[15]采用OECD 215 幼魚生長(zhǎng)試驗(yàn)，通過(guò)亞致死劑量研究NO2-對(duì)斑馬魚生長(zhǎng)的影響，其結(jié)果表明，NO2-抑制斑馬魚幼魚生長(zhǎng)。

本研究用改良寇氏法計(jì)算得NaNO2對(duì)斑馬魚胚胎的96hpf-LC50為1.30mg/mL，KNO2的96hpf-LC50為1.44 mg/mL，而Simmons 等[11]研究得到96hpf-LC50為0.41 g/mL。Petra 等[16]測(cè)得NO2-對(duì)斑馬魚96hpf-LC50為0.24mg/mL。本研究的LC50明顯高于已報(bào)道文獻(xiàn)，原因可能是受毒時(shí)間不同，Simmons等[11]的實(shí)驗(yàn)受毒時(shí)間是24h 開始，胚胎越早接觸處理液，可能會(huì)產(chǎn)生抵抗性，敏感性會(huì)降低。曹伏君等[12]和樊海平等[13]分別對(duì)龍虎斑、大刺鰍幼魚進(jìn)行了亞硝酸鹽急性毒性作用的研究。結(jié)果表明亞硝酸鹽對(duì)龍虎斑和大刺鰍幼魚的96hLC50分別為90.41mg/L 和0.789mg/L。與斑馬魚相比，龍虎斑和大刺鰍幼魚比較敏感，容易受到亞硝酸鹽的毒害。童雅琛等[17]發(fā)現(xiàn)，低濃度（2.0mol/L）的亞硝酸鹽會(huì)造成家兔心率加快，高濃度（5.0 mol/L 和7.0 mol/L）下，心率出現(xiàn)明顯下降。大鼠經(jīng)1.0mL 的2%或4%的NaNO2溶液投服后，即可引起中毒死亡[18]。Til等[19]研究大鼠接受不同濃度KNO2的飲用水的毒性作用，觀察到劑量相關(guān)的腎上腺帶狀腎小球肥大，對(duì)大鼠的無(wú)作用劑量低于100 mg/L。根據(jù)世界衛(wèi)生組織《飲用水水質(zhì)準(zhǔn)則》，對(duì)于奶瓶喂養(yǎng)的嬰兒，其接觸亞硝酸鹽主要的外部來(lái)源就是飲用水，以嬰兒免得高鐵血紅蛋白癥的亞硝酸鹽準(zhǔn)則值為3.0mg/L（以NO2-計(jì)）[20]。尚未見有關(guān)于KNO2對(duì)斑馬魚的毒害作用的報(bào)道，本研究豐富了相關(guān)資料,具有一定借鑒意義。亞硝酸鹽對(duì)斑馬魚胚胎及幼魚的毒性特征與傳統(tǒng)動(dòng)物模型的毒性特征相似，且毒性實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單易操作，斑馬魚可以替代傳統(tǒng)動(dòng)物模型用于食品安全檢測(cè)。