肖 超，陶 英，宋陸茜，趙佑山，吳凌云，常春康

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院血液科，上海 200233)

骨髓增殖性疾病 （myeloproliferative neoplasm，MPN）是一系或多系分化相對成熟的骨髓細(xì)胞不斷克隆性增殖所導(dǎo)致的一組腫瘤性疾病。原發(fā)性骨髓纖維化（primary myelofibrosis，PMF）、真性紅細(xì)胞增多癥（polycythemia vera，PV）和原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocythemia，ET）是費城染色體陰性MPN 的主要病種[1]，這3 種疾病患者都可能發(fā)生白血病轉(zhuǎn)化和血栓出血事件，但其臨床表現(xiàn)及預(yù)后各不相同。2016 版WHO 髓系腫瘤和急性白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]（以下簡稱2016 版WHO 診斷標(biāo)準(zhǔn)）將PMF明確區(qū)分為原發(fā)性骨髓纖維化前期（prefibrotic primary myelofibrosis，pre-PMF）和明顯的PMF（overt-PMF），而兩者的臨床癥狀和預(yù)后均存在明顯不同。

迄今為止，只有少數(shù)關(guān)于MPN 的流行病學(xué)研究，因而本研究調(diào)查了我院近期連續(xù)診斷的88例MPN 患者（主要是PV、ET、PMF），對其疾病參數(shù)進行了初步的分析研究，比較pre-PMF 與ET、pre-PMF 與overt-PMF 患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)及臨床參數(shù)，從而明確pre-PMF 診斷的臨床價值和重要性，以期為臨床治療選擇提供參考。

資料與方法

一、資料

選取2015 年1 月到2018 年1 月我科連續(xù)診斷的88例MPN 病例（參考2016 版WHO 診斷標(biāo)準(zhǔn)），收集這些病例的疾病相關(guān)數(shù)據(jù)進行分析研究，包括年齡、性別、診斷分型、白細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白水平、血小板計數(shù)、乳酸脫氫酶（lactic aciddehydrogenase,LDH）水平、脾腫大情況、骨髓巨核細(xì)胞數(shù)和Gomori 銀染色、相關(guān)基因 （JAK2 V617F、CALR、MPL）突變等。本研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

二、方法

血紅蛋白含量、血小板計數(shù)、白細(xì)胞計數(shù)均由我院血液病實驗室醫(yī)師抽取患者外周靜脈血后，經(jīng)sysmex xs-800i 血細(xì)胞分析儀檢測獲得數(shù)據(jù)。每例患者常規(guī)進行腹部超聲檢查，由我院超聲科醫(yī)師經(jīng)日立超聲診斷儀（凸陣探頭，3.5 MHz）測得脾腫大數(shù)值。骨髓巨核細(xì)胞數(shù)和Gomori 銀染色由我院血液病實驗室醫(yī)師將取得的骨髓活組織經(jīng)Bouin 液固定，用乙醇脫水，Hemapun865 劑包埋，隨后切片并染色，使用OLYMPUS CX41 顯微鏡進行病理檢查所得?；蛲蛔儥z測由我院血液科醫(yī)師行骨髓穿刺抽取少量骨髓液（部分骨髓干抽的患者使用外周血代替），經(jīng)患者知情同意，送往“金域醫(yī)學(xué)檢驗中心”（第三方醫(yī)學(xué)檢測機構(gòu)），通過片段分析和測序分別檢測CALR、JAK2 V617F、MPL 的突變情況。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05 時認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、各疾病分型患者的臨床特點（見表1）

88例MPN 患者中男性46例 （52%），女性42例（48%）；中位年齡為61歲（20～88歲），32例（36%）為老年患者（≥65歲）；22例（25%）有脾腫大（1例已行脾切術(shù)）。檢出JAK2 V617F 突變者有51例（58%），檢出CALR 突變5例（6%），檢出MPL突變2例（2%），三陰性30例（34%）。使用2016 版WHO 診斷標(biāo)準(zhǔn)進行分類，PV 有20例，ET 有23例，PMF 共45例，其中pre-PMF 為23例 （占PMF 的51%），overt-PMF 為22例（49%）。觀察分析PV、ET、pre-PMF、overt-PMF 患者的臨床特點，發(fā)現(xiàn)存在脾腫大例數(shù)、白細(xì)胞計數(shù)增多（＞11×109/L）、血紅蛋白含量降低（＜100 g/L）、血小板計數(shù)降低（＜100×109/L）的患者百分比以及LDH 水平、骨髓纖維化程度、骨髓巨核細(xì)胞數(shù)等都存在組間差異（P＜0.05）（見表1）。

二、基因突變情況及各基因組的臨床特點

觀察PV、ET、pre-PMF、overt-PMF 組間的JAK2 V617F、CALR、MPL 基因突變情況，發(fā)現(xiàn)CALR 突變率在4 組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P=0.027）（見表1），overt-PMF 組的CALR 突變率高達18%（4/22），其余基因突變率在各組間的差異則無統(tǒng)計學(xué)意義。按基因突變情況分組，比較分析各基因組患者的臨床特點，發(fā)現(xiàn)CALR 突變患者的中位年齡較小，而其發(fā)生血小板計數(shù)降低、中重度骨髓纖維化的百分比高于其他基因組（見表2）。

三、pre-PMF 與overt-PMF、ET 患者臨床癥狀及預(yù)后比較

pre-PMF 患者相比overt-PMF 患者的臨床癥狀輕，兩者的白細(xì)胞增多、血紅蛋白含量降低、血小板計數(shù)降低的百分比分別為61%比77%（P=0.235）、22%比50%（P=0.048）、4%比27%（P=0.034），pre-PMF 平均LDH 水平較低 （P=0.037）。雖然overt-PMF 組患者的中位年齡略高于pre-PMF 組，overt-PMF 組中老年患者百分比及脾腫大百分比也有略高于pre-PMF 組的趨勢（50%比30%，55%比26%），但差異尚無統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＞0.05）（見表3）。

pre-PMF 患者與ET 患者的臨床表現(xiàn)相似，發(fā)病中位年齡接近，老年患者所占百分比也大致相同，2 組間的平均LDH 水平以及血紅蛋白含量降低、血小板計數(shù)降低的百分比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（見表3），僅出現(xiàn)脾腫大的百分比和白細(xì)胞計數(shù)增多的百分比不同，分別是26%比4%（P=0.043）和61%比17%（P=0.007）。然而，對pre-PMF 和ET 患者進行隨訪發(fā)現(xiàn)，ET 患者的生存時間長于pre-PMF 患者（見圖1），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.038）。

表1 88例患者的臨床特點[n（%），中位數(shù)（范圍）]

表2 各基因分組患者的臨床特點[n（%），中位數(shù)（范圍）]

表3 pre-PMF 與overt-PMF、ET 患者的臨床特點比較[n（%），中位數(shù)（范圍）]

圖1 ET 患者與pre-PMF 患者的生存曲線

將本研究的88例MPN 患者參考2008 版WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]進行判斷，有24例符合ET 診斷，而其中有1例，若參考2016 版WHO 診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]則可診斷為pre-PMF。分析該例患者，患者為39歲女性，無脾腫大，血常規(guī)檢查示白細(xì)胞計數(shù)8.4×109/L，血紅蛋白78 g/L，血小板計數(shù)684×109/L，中性粒細(xì)胞計數(shù)6.38×109/L；LDH 水平192 U/L；基因突變檢測到三陰性；骨髓巨核系增生，未見粒系、紅系增生，網(wǎng)硬蛋白Gomori 銀染色1 度，生存時間為70個月。因為患者沒有滿足2008 版WHO 的PMF 診斷標(biāo)準(zhǔn)（未達到2 項次要標(biāo)準(zhǔn)），故被診斷為ET，但其符合2016 版WHO 的pre-PMF 診斷標(biāo)準(zhǔn)（至少1 項次要標(biāo)準(zhǔn)），從生存時間僅為70個月來看，該例患者更符合pre-PMF 診斷。

四、PMF 中發(fā)生JAK2 突變患者者與三陰性患者比較

分別比較pre-PMF 組及overt-PMF 組中JAK2 V617F 突變陽性和三陰性患者的臨床資料（見表4）。在pre-PMF 組中，三陰性患者與JAK2 V617F 突變者相比，發(fā)病中位年齡較?。?0歲比65歲，P=0.03），脾腫大百分比較高（46%比0，P=0.017），但兩者間其他臨床特點（包括性別、白細(xì)胞增多、血紅蛋白含量降低、血小板計數(shù)降低、LDH 均值）差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示三陰性pre-PMF 患者的發(fā)病年齡較早，且脾腫大癥狀較明顯。在overt-PMF 組中，三陰性患者與JAK2 突變患者相比，臨床特點差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

討論

MPN 是由造血干細(xì)胞克隆增殖引起的一組異質(zhì)性疾病，主要的驅(qū)動突變基因包括JAK2 V617F、CALR、MPL 基因，其中，PV、ET、PMF（2016 版WHO分類標(biāo)準(zhǔn)分為pre-PMF 和overt-PMF），這些不同疾病分型患者的臨床表現(xiàn)及預(yù)后各不相同，臨床治療方法也不盡相同。

一、PV、ET、PMF 患者的基因突變與預(yù)后

PV 患者的中位生存期約為14 年，而ET 患者的中位生存期約為20 年；PV 患者20 年內(nèi)的白血病轉(zhuǎn)化率＜10%，ET 患者則＜5%。在95%的PV 患者中可發(fā)現(xiàn)JAK2 V617F 突變，而在不到60%的ET和PMF 患者中可檢測到JAK2 V617F 突變[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，PV、ET、pre-PMF 和overt-PMF 患者的JAK2 V617F 突變率分別 為75%（15/20）、61%（14/23）、43%（10/23）、55%（12/22）。有研究 顯示，ET 中的JAK2、CALR、MPL 突變是相互排斥的，其陽性率分別為55%、25%、3%，而約有17%的患者為三陰性[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，ET 患者中JAK2、CALR、MPL 基因突變及三陰性的比例分別為61%（14/23）、4%（1/23）、9%（2/23）、26%（6/23）。有文獻提示，驅(qū)動基因的突變狀態(tài)并未顯示對ET 患者生存有影響，但JAK2、MPL 突變與動脈血栓形成高風(fēng)險有關(guān)，而MPL 突變具有較高的纖維化進展風(fēng)險[5]。本研究中僅發(fā)現(xiàn)2例MPL 突變者，均診斷為ET，其骨髓纖維化不明顯，Gomori 銀染色皆為1 度，尚未發(fā)生血栓事件。在之后的治療過程中，需嚴(yán)密監(jiān)測患者纖維化的進展情況及血栓預(yù)防治療。

表4 PMF 中JAK2 突變患者與三陰性患者的臨床特點比較[n（%），中位數(shù)（范圍）]

PMF 以造血干細(xì)胞衍生的克隆性骨髓增生、細(xì)胞因子表達異常、骨髓纖維化、貧血、脾腫大、髓外造血、全身性癥狀、惡病質(zhì)、白血病進展和生存期短為特征。國外研究顯示，PMF 患者的中位年齡為66歲，男性占61%，38%的PMF 患者血紅蛋白＜100 g/L，18%的患者血小板計數(shù)＜100×109/L，13%的患者白細(xì)胞計數(shù)＞25×109/L，24%的患者需要紅細(xì)胞輸注，21%出現(xiàn)脾臟腫大，29%的患者有全身癥狀，31%的患者有異常核型；其JAK2 基因突變率為61%，MPL 基因突變率為8%，IDH1/IDH2 突變率為4%；低危和高?；颊叩? 年白血病轉(zhuǎn)化率分別為6%和21%[6]。日本一項研究顯示，PMF 診斷的中位年齡為66歲，中位生存期為47個月，3 年總生存率為59%；感染和急性白血病轉(zhuǎn)化是其最常見的死亡原因[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，PMF（將pre-PMF 與overt-PMF 合并） 的JAK2 突變者占49%（22/45），CALR突變者占9%（4/45），無MPL 突變者；男性占56%（25/45），白細(xì)胞計數(shù)增多（＞11×109/L）、血紅蛋白含量降低（＜100 g/L）、血小板計數(shù)降低（＜100×109/L）的百分比分別為69%（31/45）、36%（16/45）、16%（7/45），與國外研究結(jié)果相近。

二、pre-PMF 與overt-PMF 的區(qū)別

在2016 WHO 診斷標(biāo)準(zhǔn)公布之前，pre-PMF 未被醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為是MPN 的一個獨特亞群，也未被拿來與overt-PMF 對比分析。直到2017 年，有學(xué)者強調(diào)了將兩者區(qū)分為2個單獨亞型的重要性。Grisslinger 等[8]的研究表明，pre-PMF 代表overt-PMF的一個前驅(qū)階段，在臨床、血液學(xué)和分子表型方面，pre-PMF 相對于overt-PMF，其患者有較長的總體生存期以及無白血病和無纖維化存活期；但與其他研究報道一致，pre-PMF 患者的總生存期明顯短于ET。pre-PMF 患者相對更年輕，而overt-PMF 患者血液學(xué)異常更明顯（貧血、白細(xì)胞減少、血小板減少、原始細(xì)胞計數(shù)高），癥狀更多，脾臟明顯腫大，高危分子突變發(fā)生頻率更高。因此，2016 版WHO 診斷標(biāo)準(zhǔn)將PMF 明確區(qū)分為pre-PMF 和overt-PMF，具有很大的預(yù)后評估意義。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，pre-PMF患者比晚期PMF 患者的臨床癥狀輕，兩者的白細(xì)胞增多、血紅蛋白含量降低、血小板計數(shù)降低的百分比分別為61%和77%、22%和50%、4%和27%，而晚期PMF 的發(fā)病中位年齡高于pre-PMF （65歲比61歲），且老年患者的百分比和發(fā)生脾腫大的百分比也高于pre-PMF （50.0%比30.4%，54.5%比26.1%）。這些恰好提示了兩者預(yù)后間的差異，也支持將兩者區(qū)分的必要性。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，相比于overt-PMF，pre-PMF 隊列中女性患者比例占優(yōu)勢，提示男性患者快速進展到overt-PMF 的可能性更大[8]。本研究也發(fā)現(xiàn)MPN 的某些疾病亞型具有性別優(yōu)勢，PV 中男性占百分比較多（70.0%），而ET 中女性占百分比較多（69.6%），這種現(xiàn)象可能與樣本量小導(dǎo)致的性別偏倚有關(guān)，也可能與男性雄激素的促紅細(xì)胞生長功能有關(guān)，或許提示性別與疾病間的某種其他聯(lián)系，需日后擴大樣本量進一步研究。

在pre-PMF 中，三陰性患者比JAK2 V617F 突變者的發(fā)病中位年齡小，發(fā)生脾腫大的例數(shù)多，可能提示三陰性患者的癥狀重、預(yù)后差。但在overt-PMF 中，三陰性患者與JAK2 突變患者相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能提示三陰性對overt-PMF 的預(yù)后影響不大。

三、pre-PMF 與ET 的區(qū)別

雖然，pre-PMF 患者與ET 患者的臨床表現(xiàn)極為相似，且存在相同的分子標(biāo)志及基因突變，但pre-PMF 的預(yù)后差，死亡率及白血病轉(zhuǎn)化率也相對較高，因而，借助形態(tài)學(xué)上的不同，仔細(xì)區(qū)分pre-PMF與ET 具有明確的預(yù)后意義[9]。有文獻顯示，ET 的骨髓組織病理學(xué)標(biāo)志是，具有成熟細(xì)胞質(zhì)和多分葉狀核的巨形巨核細(xì)胞的特征性增生及成簇聚集[10]；而pre-PMF 和overt-PMF 的骨髓組織病理學(xué)特點主要是非典型的巨形未成熟巨核細(xì)胞伴云狀未成熟核，這在ET 和PV 中很難看到。這種異常的原發(fā)性巨核細(xì)胞粒細(xì)胞化生是巨核細(xì)胞和粒細(xì)胞異常增生的一種雙重性腫瘤性增殖，是pre-PMF 的早期特征。骨髓的纖維化是絕大多數(shù)PMF 患者的顯著特征，但不是ET 的特征，其在pre-PMF 的自然病程中都將或多或少地快速進展。

根據(jù)2016 版WHO 的pre-PMF 診斷標(biāo)準(zhǔn)，診斷pre-PMF 至少需要滿足貧血、白細(xì)胞增多、乳酸脫氫酶升高和脾腫大這4個標(biāo)準(zhǔn)之一。有研究評估了170例pre-PMF 患者這4個標(biāo)準(zhǔn)出現(xiàn)的相對頻率，并與225例ET 患者進行比較，發(fā)現(xiàn)超過91%的pre-PMF 病例顯示出4 種標(biāo)準(zhǔn)中的一種或多種特征，而只有48%的ET 患者有此現(xiàn)象[11]。該研究應(yīng)用Cox 回歸模型分析次要標(biāo)準(zhǔn)對總體存活的影響，發(fā)現(xiàn)只有白細(xì)胞增多是pre-PMF 和ET 存活率的重要影響因子。pre-PMF 中的分子特征也顯示了存活差異，CALR 突變的存活優(yōu)于JAK2 突變，但在ET中未發(fā)現(xiàn)這種差異。該研究比較了pre-PMF 與ET患者的不同結(jié)局及相關(guān)分子遺傳數(shù)據(jù)，強調(diào)了這是2 種不同的疾病概念，而不是相同疾病的連續(xù)狀態(tài)。因此，細(xì)致的組織形態(tài)學(xué)診斷結(jié)合次要臨床標(biāo)準(zhǔn)，可以區(qū)分pre-PMF 與ET。本研究中有1例患者根據(jù)2008 版WHO 診斷標(biāo)準(zhǔn)被診斷為ET，而根據(jù)2016 版WHO 診斷標(biāo)準(zhǔn)則可診斷為pre-PMF。由于pre-PMF 與ET 間的預(yù)后存在差異，因而2016 版WHO 診斷標(biāo)準(zhǔn)對區(qū)分pre-PMF 與ET 極為重要，對臨床治療的選擇將有極大幫助。

四、基因檢測對骨髓纖維化靶向治療的指導(dǎo)意義

MPN 患者絕大部分最終都會發(fā)生骨髓的纖維化，這是一種進展性疾病，而其不斷惡化的消耗性癥狀（包括盜汗、體重減輕、發(fā)熱）嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和預(yù)后[12-13]，超過80%的骨髓纖維化患者可出現(xiàn)脾臟腫大[14]。JAK-STAT 通路失調(diào)是骨髓纖維化疾病的特點[12-15]，JAK 信號通路可激活STAT的轉(zhuǎn)錄因子，從而控制免疫和造血細(xì)胞的分化、生長、增殖及存活[16]。超過90%的骨髓纖維化患者存在JAK2 V617F、CALR 或MPL 基因突變，繼而導(dǎo)致JAK 信號失調(diào)，最終導(dǎo)致造血細(xì)胞惡性增殖及炎性因子過度釋放[17-18]。JAK 通路抑制劑可以結(jié)合JAK1 和JAK2 激酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖并減輕脾臟腫大，且這種抑制作用與JAK2 V617F 突變存在與否無關(guān)[19]。三陰性患者目前還沒有明確的靶基因，而采用二代測序探索這些患者的其他基因情況（如SETBP1、SRSF2、ASXL1、TET2、EZH2、IDH1/IDH2 等），或許能找到潛在的靶基因，并提供更好的治療辦法。

總之，MPN 是一組異質(zhì)性克隆性血液系統(tǒng)疾病，PV 和ET 患者的中位生存期長于PMF 患者，而PMF 中的pre-PMF 患者與overt-PMF 患者呈現(xiàn)出不同的臨床表現(xiàn)及預(yù)后，因此區(qū)分以上這些疾病對臨床治療策略的選擇相當(dāng)重要，尤其是pre-PMF 與ET、overt-PMF 的鑒別診斷。雖然，pre-PMF患者與ET 患者的臨床表現(xiàn)極為相似，但pre-PMF患者出現(xiàn)一種或多種2016 版WHO 診斷標(biāo)準(zhǔn)提及的表現(xiàn)頻率高于ET，且pre-PMF 形態(tài)學(xué)具有特征性的原發(fā)性巨核細(xì)胞粒細(xì)胞化生改變，因此，通過組織形態(tài)學(xué)診斷結(jié)合次要臨床標(biāo)準(zhǔn)，可以準(zhǔn)確區(qū)分pre-PMF 與ET。雖然JAK 通路抑制劑能改善PMF 患者的脾腫大和生活質(zhì)量，但如果行二代測序找到三陰性患者的潛在靶基因，或許可以找到更好的治療辦法。