張 旭，王柳玉，萬勝豪，湯建強，王 琪，丁新雅，吳萍萍①

（淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北235000）

0 引言

水螨（water mite），即為水體中生活的螨類，在分類學(xué)上，其隸屬于節(jié)肢動物門Arthropoda、蛛形綱Arachnida、蜱螨亞綱Acari、真螨總目Acariformes、絨螨目Trombidiformes、前氣門亞目Prostigmata、寄殖螨股Parasitengonina、水螨亞股Hydrachnidiae［1]. 水螨在水體中生態(tài)分布極為廣泛，是淡水無脊椎動物的重要組成部分，也是研究底棲水生節(jié)肢動物生態(tài)學(xué)的功能類群［2]. 水螨的物種豐富度和種群數(shù)量與水體質(zhì)量有著密切關(guān)系，因此水螨中許多種類可作為水體污染程度的生態(tài)指標(biāo)［3-4]. 我國對于水螨的分類研究進展較為緩慢，嚴(yán)重限制利用水螨進行淡水環(huán)境監(jiān)測等方向的應(yīng)用研究. 其主要原因是水螨個體形態(tài)微小（0.2～0.8 mm），種類繁多，形態(tài)結(jié)構(gòu)變化復(fù)雜，一些關(guān)鍵的鑒別特征需要通過解剖后才能觀察到，加上目前從事水螨分類的研究人員逐漸減少，使得通過常規(guī)的形態(tài)學(xué)鑒定水螨物種非常困難. DNA條形碼技術(shù)的出現(xiàn)為解決水螨物種的鑒定問題提供新思路.

DNA條形碼技術(shù)是利用線粒體細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ（cytochrome oxidase subunit I，COⅠ）基因中一段長度約658 bp的序列片段實現(xiàn)對物種的快速鑒定. 目前，COⅠ被認(rèn)為是動物界中最適合的DNA條形碼基因，已在鳥類、兩棲類、昆蟲等眾多動物類群中得到廣泛的應(yīng)用［5-7]，然而目前水螨的DNA條形碼研究僅限于個別種類的修訂和新種的描述，還未能在多數(shù)類群中開展［8-9]. 本研究以黃山及杭州等地區(qū)的水螨為研究材料，探討利用DNA條形碼技術(shù)在水螨物種鑒定中的可行性，為以后水螨的應(yīng)用研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 樣本來源

本研究共采集6種水螨9個樣本，樣本經(jīng)常規(guī)采集后浸泡在無水乙醇中，-20 ℃保存. 根據(jù)水螨的分類標(biāo)準(zhǔn)進行形態(tài)學(xué)鑒定. 為充分驗證DNA條形碼在水螨物種中的可行性，本研究還從GenBank中下載我國已經(jīng)發(fā)表的4種水螨11條序列（樣本信息詳見表1）.

表1 樣本信息

1.2 實驗方法

將水螨樣本用無菌水清洗后，用微量基因組提取試劑盒（TIANGEN DP316或QIAGEN 69504）提取總DNA. COⅠ基因擴增引物參考條形碼的通用引物并進行修改COⅠF（5′-GGTCAACAAATCATAAA?GATATTGG-3′）和COⅠR（TTCAGGGTGACCAAAAAATCA -3′）. PCR擴增程序為：94 ℃5 min，35次循環(huán)（94 ℃30 s，51 ℃30 s，72 ℃45 s），72 ℃10 min. 使用瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，切下目標(biāo)條帶，使用膠回收試劑盒進行純化（QIAGEN 28704）. 將載體pEASY-T1 Simple Cloning Vector（TRANS CT111）與純化后的PCR產(chǎn)物連接，進行藍白斑篩選. 在每個樣本中至少選擇2個陽性克隆，送至上海華大基因公司進行測序.

1.3 數(shù)據(jù)分析

用EditSeq 5.0 軟件打開測序結(jié)果，刪除兩端載體序列，在GenBank 和BOLD Systems 進行比對，通過分子鑒定，確保所獲序列是目的序列. 用MEGA 7.0 軟件進行序列比對，保留658 bp的高同源性序列，計算堿基組成，保守位點，變異位點，簡約信息位點；基于K2P模型計算遺傳距離并導(dǎo)出相應(yīng)數(shù)據(jù)，使用Ex?cel軟件繪制遺傳頻率分布直方圖；使用DAMBE 6.6.47軟件對序列的飽和度進行分析，以此檢驗序列是否適用于后續(xù)的分析；以絨螨科Trombiidae（GenBan登錄號：KP979229）為外群釆用鄰接法（neighbor-join?ing，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分支的置信度用自展法進行1000次重復(fù)抽樣檢測.

2 結(jié)果與分析

2.1 GenBank與BOLD Systems的分子鑒定結(jié)果

本實驗有9個樣本成功得到COⅠ序列. 9條序列在GenBank和BOLD數(shù)據(jù)庫中分子鑒定結(jié)果相似，僅在比對相似度上稍有差異（見表2）. 所有序列均未能通過分子數(shù)據(jù)鑒定到具體的種類，序列的比對相似度在80.90%～89.38%（GenBank）和80.19%～89.26%（BOLD），其中有66.67%的樣本（6個樣本）的分子鑒定結(jié)果在屬級階上與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，有33.33%的樣本（2 個Nilotonia sp. 的樣本和1 個Hydry?phantessp. 的樣本）. 在科級階元上也與形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果不一致，僅能通過分子數(shù)據(jù)鑒定到目級階元.有77.78%的樣本（7個樣本）通過GenBank和BOLD數(shù)據(jù)庫比對的物種相同，而有22.23%的樣本（1個Tor?renticolasp. 和1個Hygrobatessp.）在2個數(shù)據(jù)庫中比對的結(jié)果為不同的物種.

表2 基于COⅠ基因片段的9個水螨樣本在GenBank 和BLOD Systems的分子鑒定結(jié)果

2.2 堿基序列分析

利用MEGA7.0 軟件對20 條序列進行堿基序列分析. 結(jié)果表明T、C、A、G 的平均含量為35.8%、18.3%、30.6%、15.3%. A+T含量為66.4%，有明顯的堿基偏好性. 保守位點、變異位點、簡約信息位點分別為335個、323個、275個，在658個位點中分別占50.91%、49.09%、41.79%.

2.3 堿基替換飽和度分析

使用MEGA7.0軟件進行堿基替換分析，核苷酸替換多為一致替換（527個），顛換數(shù)和轉(zhuǎn)換數(shù)的平均比值相同，在第1、2、3位點的比值分別為0.8、1.8、1.0. 堿基置換主要發(fā)生在密碼子第1個位點上，轉(zhuǎn)換40個，其頻率為總數(shù)的60.5%；顛換51個，其頻率為總數(shù)的76.1%. 對COⅠ基因序列進行堿基替換飽和性分析時，使用DAMBE軟件，以堿基替換頻率為縱坐標(biāo)，以TN93模型校正距離為橫坐標(biāo)，進行散點分析. 從飽和度分析散點圖中可以看出（見圖1），堿基替換顛換比率與遺傳距離呈線性關(guān)系，沒有出現(xiàn)飽和態(tài)勢，能夠構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

圖1 飽和度分析散點圖

2.4 遺傳距離分析

基于MEGA7.0 軟件（K2P 模型），計算遺傳距離. 結(jié)果顯示（見表3），種內(nèi)遺傳距離最大值變動范圍0～0.012，其中Sperchon plumifer的種內(nèi)遺傳距離最大. 種間遺傳距離變動范圍0.158～0.365，平均種間遺傳距離為0.276，Sperchon rostratus和Sperchon fuxiensis的種間遺傳距離最小為0.158. 種間遺傳距離最大值出現(xiàn)在Sperchon plumifer與Sperchonopsis ecphyma之間，為0.365. 最大種內(nèi)遺傳距離（0.012）小于最小種間遺傳距離（0.158），存在明顯的條形碼間隔（見圖2）.

表3 基于COⅠ基因片段的10種水螨的種內(nèi)與種間遺傳距離

圖2 遺傳距離分布直方圖

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與分析

利用MEGA7.0軟件以絨螨科Trombiidae為外群［10]，構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類結(jié)果如圖3所示. 同一物種的所有序列均以100%的高支持率聚為一支. 例如：Sperchon plumifer的4 條序列；Sperchon rostratus的4條序列；Sperchon fuxiensis的2條序列；Nilotoniasp.的2條序列；Hydrovolzia cancellata的3條序列.

3 討論

水螨是物種多樣性十分豐富的類群（>6000種）［11]，但目前在BOLD和GenBank數(shù)據(jù)庫中注冊的序列數(shù)量相對較少，其中GenBank數(shù)據(jù)庫5451條，BOLD數(shù)據(jù)庫9883條（截止到2019年10月）. 根據(jù)本研究的序列比對結(jié)果，水螨的分子鑒定存在2 個方面的問題. 1）BOLD 和GenBank 中包含的物種信息比較簡單，多數(shù)種類僅包含屬名、科名甚至目名. 這就導(dǎo)致使用DNA條形碼對物種進行分子鑒定時，很難比對到具體的物種名. 例如本研究中所有的樣本均未能比對到具體的種名，僅有部分樣本（66.67%）比對結(jié)果在屬級階元上與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致. 2）BOLD 和GenBank 2 個數(shù)據(jù)庫對水螨序列的比對相似度都偏低（BOLD 80.19%～89.26%，GenBank 80.90%～89.38%）. 武宇鵬等的研究結(jié)果顯示，果園螟蛾在BOLD數(shù)據(jù)庫中分子鑒定的相似度在98.51%以上［7]，而王嘉鶴等的研究結(jié)果顯示，石斑魚在GenBank 和BOLD 數(shù)據(jù)庫中分子鑒定的相似度高達97.21%～100%［12]. 這2點均說明水螨的DNA條形碼研究嚴(yán)重滯后，目前還未能滿足使用數(shù)據(jù)庫對物種進行分子鑒定的要求. 水螨的DNA條形碼研究與其它動物類群相比還有很大的差距，補充水螨DNA條形碼的數(shù)據(jù)量和完善數(shù)據(jù)庫中的物種信息是目前水螨DNA條形碼亟待開展的工作.

圖3 基于COⅠ基因片段10種水螨的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

Hebert曾提出，利用DNA條形碼技術(shù)進行物種分類鑒定有2個前提條件，一：種內(nèi)遺傳差異小于種間遺傳差異［13]. 二：物種在系統(tǒng)發(fā)育樹中形成獨立的分支［14]. 本研究的結(jié)果顯示，同一水螨物種不同樣本的序列差異小，種內(nèi)最大遺傳距離（0.012）小于種間最小遺傳距離（0.158），種內(nèi)、種間遺傳差異未出現(xiàn)交叉，有顯著的條形碼間隔. 另外，本研究所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹也表明，同一水螨物種的所有序列都以100%的高支持率聚為一支. 由此可見，基于COⅠ基因完全可以滿足DNA條形碼理論的兩個假設(shè)，證實COⅠ作為水螨類群DNA條形碼基因是可行的.

值得探討的是，Bernasconi曾在蠅類的條形碼研究中證實COⅠ基因僅適合于低級階元而不適合高級階元的分析［15]. 本研究基于COⅠ基因所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，雖然同一水螨物種可以聚為單系，但是在屬級及科級階元上所顯示的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系比較混亂. 例如Sperchon的3個物種盡管分為一簇，但它們與Lebertiasp.和Torrenttcolasp.這些不同科的物種聚為一個大支，出現(xiàn)同源交叉現(xiàn)象. 這也說明水螨類群中，COⅠ基因同樣僅適用于種級階元，而不能很好地用于高級階元的系統(tǒng)發(fā)育分析.

相對于其它類群來說，水螨的DNA 條形碼進展緩慢，雖然本研究在一定程度上證實COⅠ基因可以作為水螨的DNA條形碼，但本次研究所涉及到的物種數(shù)較少，是否能夠在所有的物種中都能得到相同的結(jié)論還需要后續(xù)的深入研究. 另外，本研究的結(jié)果也顯示，COⅠ基因作為水螨類群的DNA條形碼在高級階元的分析上具有局限性，可以在后續(xù)的水螨DNA 條形碼研究中開發(fā)其他基因，例如：線粒體的16S rRNA、COXⅢ以及核基因中的28S rRNA等［16-18].