王燕忠， 丁麗敏， 陳一瑞， 王永斌

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院下沙院區(qū)檢驗(yàn)科，浙江 杭州 310016；2.浙江省人民醫(yī)院血液內(nèi)科，浙江 杭州 310014；3.揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 揚(yáng)州 225001）

食管癌是一種嚴(yán)重影響人們生活水平的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。近年來食管癌在我國(guó)的發(fā)病率和致死率居高不下，我國(guó)已成為食管癌高發(fā)的國(guó)家之一。食管癌的臨床癥狀不明顯，被發(fā)現(xiàn)時(shí)多為晚期，因此尋找食管癌發(fā)生的生物學(xué)標(biāo)志物，對(duì)于食管癌的及早發(fā)現(xiàn)和有效治療具有重要的意義。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的非編碼小RNA，由基因組轉(zhuǎn)錄生成并通過與靶基因的3'端互補(bǔ)配對(duì)，降解靶基因或抑制其翻譯而發(fā)揮治療作用[2]。據(jù)推測(cè)，人類1/3的基因受到miRNA調(diào)控，因此在人類生長(zhǎng)發(fā)育和疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要調(diào)節(jié)作用[3]?？烧{(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）作為影響食管癌細(xì)胞增殖和凋亡的重要指標(biāo)，其表達(dá)量嚴(yán)重影響著食管癌的發(fā)展，因此本研究探討miRNA-21-5p與STAT3之間的靶向關(guān)系，為食管癌的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年1月—2018年6月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院下沙院區(qū)治療的食管癌患者78例（病例組），其中男37例、女41例，中位年齡為（46±3.9）歲。對(duì)照組是69名體檢健康者，其中男33名、女36名，中位年齡為（47±4.0）歲。病例組和對(duì)照組的一般信息之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有食管癌患者均首次經(jīng)檢查確診，符合食管癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，具備完整的食管癌病歷資料；（2）患者入組前未進(jìn)行治療或者藥物干預(yù)；（3）術(shù)后經(jīng)病理診斷證實(shí)為食管癌，臨床分期為Ⅰ～Ⅲ期，無轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）病歷或基本資料不完整；（2）患有多種腫瘤；（3）患者間身體狀況存在較大差異。本研究符合浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院下沙院區(qū)倫理學(xué)相關(guān)要求，且所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 血液采集及miRNA-21-5p表達(dá)檢測(cè)

采集食管癌患者、體檢健康者禁食10～12 h后清晨空腹靜脈血5 mL，室溫放置，待充分凝固后離心，吸取血清置-80℃保存。根據(jù)血清miRNA提取分離試劑盒（日本Thermo Fisher公司）說明書要求提取血清中miRNA并測(cè)定其濃度，用Bulge-Loop TM hsa-miR RT（北京天根生化科技有限公司）代替Oligo（dT）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的引物序列為5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT ATTCGCACTGGATACGACTCAACA-3'。將逆轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物應(yīng)用擴(kuò)增miRNA qRT-PCR試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性2 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。miRNA-21-5p的引物由廣州銳博科技有限公司合成，上游引物為5'-CGGCGGTAGCTTATCAGACTGA-3'。下游引物為5'- GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；同時(shí)利用U6作為內(nèi)參，U6的上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA-21-5p/U6的相對(duì)表達(dá)量。以上所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 預(yù)測(cè)miRNA-21-5p調(diào)控的下游靶基因

利用picTar（https：//pictar.mdc-berlin.de/）、TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_72/）、Tarbase（http：//diana.imis.athenainnovation.gr/DianaTools/index.php?r=tarbase/index）3個(gè)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)分別預(yù)測(cè)miRNA-21-5p調(diào)控的下游靶基因。

1.4 Draw venn diagram篩選靶基因交集

將picTar、TargetScan、Tarbase 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的miRNA-21-5p的下游靶基因分別導(dǎo)入Draw venn diagram，取出3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)交集，并且篩選出與食管癌相關(guān)靶點(diǎn)。

1.5 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)食管癌患者癌組織和癌旁組織中STAT3 mRNA的表達(dá)

取食管癌根治性切除術(shù)患者癌組織和癌旁組織各1份，用液氮冷凍后在-80 ℃儲(chǔ)存待測(cè)。根據(jù)試劑盒說明提取癌組織和癌旁組織中總RNA并測(cè)定其濃度，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，熔解曲線和擴(kuò)增曲線見圖1、圖2。STAT3上游引物為5'-ATGAGTGTGGCCGTTGCA-3'，下游引物為5'-TGTCCCGGCAGAATTTCC-3'，同時(shí)用3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，GAPDH上游引物為5'-GCTGAGTATGTCGTGGAGT-3'，下游引物為5'-GTTCACACCCATCACAAAC-3'。PCR擴(kuò)增體系：SuperMix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）4 μL，H2O 5 μL，共20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸60 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算STAT3/GAPDH的相對(duì)表達(dá)量。以上所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 3 次。

圖1 熔解曲線

圖2 擴(kuò)增曲線

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，多組之間的比較采用方差分析，2個(gè)組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-21-5p在食管癌患者血清中的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，miRNA-21-5p在食管癌患者血清中表達(dá)量（1.01±0.19）顯著高于體檢健康者血清中的表達(dá)量（0.23±0.07）（P=0.00）。進(jìn)一步分析不同分期的食管癌患者血清中的miRNA-21-5p表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Ⅲ期患者的表達(dá)量（1.13±0.11）顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期的患者（0.92±0.09）（P=0.01），說明miRNA-21-5p的表達(dá)量與食管癌分期有關(guān)，miRNA-21-5p表達(dá)量越高，分期越晚。這些結(jié)果說明，miRNA-21-5p高表達(dá)可以作為食管癌患者的特異性標(biāo)志。

2.2 miRNA-21-5p可靶向調(diào)控STAT3

通過3個(gè)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)分別預(yù)測(cè)miRNA-21-5p調(diào)控的下游靶基因，PicTar預(yù)測(cè)出靶基因148個(gè)、TargetScan預(yù)測(cè)出384個(gè)、Tarbase預(yù)測(cè)出742個(gè)，3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)取交集得到miRNA調(diào)控的靶基因有24個(gè)，其中STAT3為miRNA-21-5p調(diào)控并且與食管癌細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)。

2.3 食管癌患者癌組織STAT3 mRNA高表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)食管癌患者癌組織和癌旁組織中STAT3 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在食管癌患者癌組織中STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于癌旁組織（P=0.01），并且根據(jù)Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，其與血清中miRNA-21-5p的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.401，P=0.00）。見圖3。

圖3 STAT3、miRNA-21-5p實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

食管癌的發(fā)生由多因素影響且特性復(fù)雜，因此了解食管癌發(fā)生的分子機(jī)制并且找到食管癌有效的治療途徑迫在眉睫。miRNA是一種長(zhǎng)度為21～24 nt的非編碼小RNA，通過與靶基因3'非翻譯區(qū)相結(jié)合而調(diào)控靶基因表達(dá)，亦可通過降解靶基因或抑制其翻譯而發(fā)揮治療作用[4]，miRNA與多種疾病相關(guān)，并且調(diào)控著疾病的不同發(fā)展階段。有研究結(jié)果表明，在食管癌組織和正常食管組織中，miRNA的表達(dá)存在顯著差異，異常表達(dá)的miRNA可以作為癌癥的生物學(xué)標(biāo)志，預(yù)測(cè)癌癥的發(fā)生[5]。齊天偉等[6]發(fā)現(xiàn)，miRNA-200c顯著降低可以作為食管癌發(fā)病的生物學(xué)標(biāo)志，miRNA-34a可通過影響抑制食管癌細(xì)胞的增殖及凋亡達(dá)到治療疾病的作用[7]，多種miRNA可以通過調(diào)控不同的信號(hào)分子治療同一種疾病。SONG等[8]發(fā)現(xiàn)，miRNA-16過表達(dá)可抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并且miRNA-16可通過靶向B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）基因抑制細(xì)胞凋亡[9-10]，研究表明miR-16可以通過靶向調(diào)控淀粉樣B（A4）前體蛋白[myloid beta（A4） presursor protein，APP]等多種基因治療阿爾茨海默癥等多種疾病[11-13]，這也說明同種miRNA可以作用于不同靶點(diǎn)治療不同疾病。

本研究以食管癌患者血清為臨床樣本，并且與體檢健康者血液進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在食管癌患者血清中miRNA-21-5p的表達(dá)顯著升高，而對(duì)照組血清樣本中miRNA-21-5p相對(duì)表達(dá)量較低。因此，本研究以miRNA-21-5p為研究重點(diǎn)，探討其在食管癌中的具體作用機(jī)制。通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miRNA-21-5p可調(diào)控多種靶基因，其中通過picTar、TargetScan、Tarbase分別預(yù)測(cè)其靶基因，發(fā)現(xiàn)其調(diào)控的靶基因數(shù)目分別為148、384、742個(gè)，并且我們通過Draw venn diagram取出3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的共有靶基因24個(gè)，其中STAT3是與食管癌細(xì)胞增殖和凋亡密切相關(guān)的基因，STAT3的持續(xù)激活會(huì)導(dǎo)致食管癌細(xì)胞的快速增殖，因此本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)食管癌患者癌組織和癌旁組織中STAT3的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在食管癌患者癌組織中STAT3表達(dá)量顯著高與癌旁組織，并且其表達(dá)水平與血清中miRNA-21-5p表達(dá)水平呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，血清中miRNA-21-5p的異常升高可以作為食管癌發(fā)生的生物學(xué)標(biāo)志，其作用機(jī)制可能與上調(diào)患者癌組織中STAT3表達(dá)促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖有關(guān)。