龔曉武，李琴，呼肖娜，李勇，周娜

(石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院/新疆兵團化工綠色過程重點實驗室,新疆 石河子 832003)

新疆棉花秸稈資源十分豐富,然而大部分棉稈被焚燒或退耕還田,利用效率較低[1-2]。棉稈等木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成,其中纖維素在纖維素酶中水解可以生成葡萄糖,進一步發(fā)酵可生成乙醇等化學(xué)品[3]。由于生物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜,纖維素被半纖維素、木質(zhì)素包裹和纏繞,所以直接對其進行酶解反應(yīng)的糖產(chǎn)率較低。為了提高纖維素的水解效率,需要通過預(yù)處理方法,打破包裹纖維素的屏障[3-6]。研究[7-9]表明,酸法預(yù)處理能有效打破半纖維素分子中的醚鍵,破壞木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的緊密結(jié)構(gòu),使纖維素表面結(jié)構(gòu)暴露,與酶的接觸面積增大,促進酶解反應(yīng)的進行。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Artificial Neural Network,ANN)是模擬生物神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能和結(jié)構(gòu)的數(shù)學(xué)模型,可用于非線性、復(fù)雜過程的模擬與優(yōu)化。已有研究[2,10-12]將人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)用于生物質(zhì)的預(yù)處理過程,而將其用于優(yōu)化酶解過程的研究較少,因此，本文采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對稀H2SO4處理棉稈在纖維素酶中水解的過程進行模擬與優(yōu)化,對稀H2SO4處理棉稈在混合酶(纖維素酶、木聚糖酶)中的水解進行研究,期望提高棉稈的糖化效率,為生物質(zhì)高效酶解工藝的優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

棉稈來自新疆石河子市郊區(qū)農(nóng)田,經(jīng)日照曬干后,剪切、粉碎并過篩,取2 mm粒徑的棉稈備用；纖維素酶和木聚糖酶購于寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司,葡萄糖、木糖和阿拉伯糖等標準樣品為色譜純,其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 棉稈的稀H2SO4預(yù)處理

稱取4 g棉稈放入反應(yīng)釜中,再加入40 mL不同濃度(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mol/L)稀H2SO4溶液,在150 ℃預(yù)處理90 min后水洗至中性,烘干后備用。

1.2.2 稀H2SO4處理棉稈在纖維素酶中的水解

稱取2 g經(jīng)稀H2SO4預(yù)處理后的棉稈,加入不同濃度纖維素酶溶液(0、150、300、450和600 FPU),并用CH3COOH—CH3COONa緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液pH至4.0、4.5、5.0、5.5和6.0,將其置于恒溫水浴搖床(溫度為35、40、45、50和55 ℃)中在轉(zhuǎn)速150 r/min下反應(yīng)72 h,分別在0、8、12、24、36、48、72 h時取樣,測定其還原糖產(chǎn)率。

1.2.3 稀H2SO4處理棉稈在纖維素酶/木聚糖酶中的水解

稱取2 g稀H2SO4預(yù)處理后的棉稈,加入一定量的纖維素酶溶液(150、300和450 FPU)，并添加不同量的木聚糖酶溶液(0、25、75、125、150和200 IU),調(diào)節(jié)溶液pH為5.0,在45 ℃的恒溫水浴搖床中水解48 h,取樣,測定其還原糖產(chǎn)率。

1.3 分析方法

采用美國國家可再生能源實驗室(NREL)提出的二步酸水解法[13]測定棉稈中各組分的含量;利用HPLC測定棉稈酶解液中還原糖的濃度。

1.4 實驗設(shè)計

1.4.1 響應(yīng)曲面實驗設(shè)計

基于稀H2SO4處理棉稈在纖維素酶中水解產(chǎn)糖的單因素實驗,采用Box-Behnken中心組合設(shè)計四因素三水平實驗,研究酶解溫度、纖維素酶用量、pH和水解時間對稀H2SO4處理棉稈酶解產(chǎn)糖的影響,每組實驗平行2次,取平均值。

1.4.2 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建

以響應(yīng)曲面實驗獲得的數(shù)據(jù)為源數(shù)據(jù),選用酶解溫度、纖維素酶用量、pH和水解時間4個因素為輸入?yún)?shù),酶解所得的還原糖產(chǎn)率為輸出參數(shù),利用Matlab軟件建立稀H2SO4處理棉稈在纖維素酶中水解過程的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型,通過多次訓(xùn)練得到當(dāng)模型隱含層的神經(jīng)元個數(shù)為5時還原糖產(chǎn)率的網(wǎng)絡(luò)輸出值與實驗值之間的誤差最小,從而建立本文研究的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型結(jié)構(gòu)為4-5-1,如圖1所示。稀H2SO4處理棉稈在纖維素酶中水解過程模型的有效性由網(wǎng)絡(luò)模型的均方誤差(mean square error,MSE)和相關(guān)系數(shù)(R)確定[14]。

圖1 稀H2SO4處理棉稈在纖維素酶中水解的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型圖

2 結(jié)果與分析

2.1 棉稈的三組分分析

棉稈原料、稀H2SO4處理棉稈及酶解后棉稈的組分如表1所示。

表1 三種棉稈物料的組分

注：稀硫酸預(yù)處理的條件為150 ℃、90 min、0.3 mol/L H2SO4和10%固含量，酶解條件為45.32 ℃、434.23 FPU纖維素酶、pH 4.98和68.37 h。

由表1可知:

(1)棉稈經(jīng)H2SO4處理后,其纖維素含量和木質(zhì)素含量分別從38.49%、24.15%增至49.21%、25.32%,但半纖維素含量由27.21%降至15.79%。表明稀H2SO4可以有效溶解棉稈中的半纖維素,對纖維素和木質(zhì)素的影響則較小,這與WANG等[3]研究結(jié)果一致。

(2)稀H2SO4處理的棉稈在纖維素酶中水解后,其纖維素含量降至23.74%,木質(zhì)素含量增至45.17%。這是由于棉稈中部分纖維素在纖維素酶溶液中水解后,纖維素含量的降低而引起木質(zhì)素的含量相對升高[9]。

2.2 稀H2SO4預(yù)處理對棉稈酶解產(chǎn)糖的影響

結(jié)果(圖2)顯示:隨著棉稈預(yù)處理時稀H2SO4濃度的增加,還原糖產(chǎn)率呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢,當(dāng)稀H2SO4濃度為0.3 mol/L時,棉稈的還原糖產(chǎn)率達到最大,為65.73%;此后,隨著稀H2SO4濃度繼續(xù)增加,酶解后的糖產(chǎn)率顯著下降,這是由于預(yù)處理條件增強使棉稈中纖維素發(fā)生降解而引起[8]。結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果[15],后續(xù)酶解實驗中采用棉稈物料的預(yù)處理條件為反應(yīng)溫度150 ℃、時間90 min和H2SO4濃度0.3 mol/L。

圖2 稀H2SO4濃度對棉稈酶解產(chǎn)糖的影響

2.3 稀H2SO4預(yù)處理棉稈酶解產(chǎn)糖的響應(yīng)曲面實驗

在單因素實驗基礎(chǔ)上采用Box-Behnken設(shè)計實驗,研究酶解溫度、纖維素酶用量、pH和水解時間對稀H2SO4處理棉稈產(chǎn)糖的影響,四因素三水平的實驗設(shè)計如表2所示,共計29組實驗,實驗數(shù)據(jù)如表3所示。

表2 棉稈在纖維素酶中水解的實驗參數(shù)和水平

表3 棉稈在纖維素酶中水解的Box-Behnken實驗設(shè)計及其響應(yīng)值

2.4 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立、訓(xùn)練與優(yōu)化

基于表3中響應(yīng)曲面實驗數(shù)據(jù),采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建稀H2SO4處理棉稈在纖維素酶中酶解產(chǎn)糖的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型,表3中50%的數(shù)據(jù)用于網(wǎng)絡(luò)模型的訓(xùn)練,25%用于測試,25%用于驗證。通過多次訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)模型,獲得最優(yōu)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型(4-5-1),并得到網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練、測試和驗證的MSE和R(表4)。

表4 棉稈在纖維素酶中水解的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的MSE和R值

由表4可知,棉稈在纖維素酶中酶解糖化的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的MSE較小,R趨向于1。這表明模型的預(yù)測準確性較好,可以用于預(yù)測稀H2SO4處理棉稈在纖維素酶中酶解的還原糖產(chǎn)率。

表5是優(yōu)化后神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的權(quán)重和偏差。基于表3中棉稈在纖維素酶中水解的數(shù)據(jù),利用表5中網(wǎng)絡(luò)模型的連接參數(shù),采用文獻[14,16]中方法對棉稈酶解的還原糖產(chǎn)率進行再次預(yù)測，同時采用文獻[10]中方法計算本文研究4種輸入?yún)?shù)對棉稈酶解產(chǎn)糖的貢獻率,結(jié)果見表6。

表5 棉稈在纖維素酶中水解的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的優(yōu)化參數(shù)(權(quán)值和閾值)

表6 酶解參數(shù)對棉稈酶解產(chǎn)糖的貢獻率

由表6可知：酶解溫度、纖維素酶用量、pH和水解時間對稀H2SO4處理棉稈酶解產(chǎn)糖的貢獻率不同,其中,纖維素酶用量對H2SO4處理棉稈酶解產(chǎn)糖的影響最大,且貢獻率順序為纖維素酶用量>酶解溫度>水解時間>pH。

圖3是棉稈在纖維素酶中水解得到的還原糖產(chǎn)率的實驗值與模型預(yù)測值的線性回歸圖。通過線性分析可知:R為0.9246,接近1,表明網(wǎng)絡(luò)模型可用于預(yù)測稀H2SO4處理棉稈在纖維素酶中水解的還原糖產(chǎn)率。利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對棉稈在纖維素酶中的水解過程進行優(yōu)化,得到酶解的最優(yōu)條件如下:當(dāng)酶解溫度為45.32 ℃,纖維素酶用量為434.23 FPU,pH為4.98,水解時間為68.37 h時,酶解得到的還原糖產(chǎn)率最大,為72.93%。

圖3 棉稈酶解的還原糖產(chǎn)量的實驗值與模型預(yù)測值

2.5 木聚糖酶添加量對棉稈在纖維素酶中水解產(chǎn)糖的影響

為了進一步提高稀H2SO4處理棉稈的產(chǎn)糖率,將木聚糖酶添加到不同濃度的纖維素酶溶液中,初步探究木聚糖酶添加量對棉稈在纖維素酶中水解產(chǎn)糖的影響,結(jié)果見圖4。

圖4 棉稈在纖維素酶/木聚糖酶中水解的還原糖產(chǎn)率

由圖4可知：

(1)當(dāng)固定纖維素酶用量為150、300、450 FPU時,稀H2SO4處理棉稈的產(chǎn)糖率隨木聚糖酶添加量增大呈先增加后降低的趨勢,且當(dāng)木聚糖酶添加量為125 IU時,稀H2SO4處理棉稈的還原糖產(chǎn)率達到最大,分別為92.42%、70.06%和71.82%。

(2)當(dāng)木聚糖酶添加量大于125 IU和纖維素酶用量為300、450 FPU時,還原糖產(chǎn)率均低于纖維素酶用量為150 FPU的產(chǎn)率,可知當(dāng)木聚糖酶含量增加到一定程度時,增大纖維素酶用量對稀H2SO4處理棉稈的還原糖產(chǎn)率影響不大。這可能是由于酶溶液中纖維素酶濃度較高,不利于木聚糖酶吸附于半纖維素表面,導(dǎo)致半纖維素的降解減少,還原糖產(chǎn)率降低。

(3)當(dāng)纖維素酶用量為150 FPU、木聚糖酶的添加量為125 IU時,稀H2SO4處理棉稈的還原糖產(chǎn)率最高,可達92.42%,顯著高于最優(yōu)條件下棉稈在纖維素酶中酶解的還原糖產(chǎn)率(72.93%)。

3 討論

新疆棉稈資源豐富,將其轉(zhuǎn)化為糖類中間體,有利于棉稈的高值化利用。棉稈等秸稈類物質(zhì)是木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的一種,主要是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成,其中纖維素被半纖維素和木質(zhì)素包裹和纏繞,若直接進行酶解反應(yīng),還原糖產(chǎn)率較低[3-4]。為了提高木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)中纖維素的水解率,在纖維素酶解之前,需通過預(yù)處理打破包裹纖維素的屏障,增加孔隙率,增大纖維素酶與底物的接觸面積[9,15]。

(1)稀酸可以有效破壞半纖維素分子中的醚鍵,使其降解生成可發(fā)酵糖,同時也能破壞棉稈等生物質(zhì)的緊密結(jié)構(gòu),使纖維素部分暴露出來,與酶的接觸面積增大,促進酶解反應(yīng)的進行[7-9]。Narendra Naik DESHAVATH等[8]采用0.2 mol/L H2SO4在121 ℃對高粱秸稈預(yù)處理120 min,預(yù)處理后高粱秸稈中木聚糖的轉(zhuǎn)化率高達89%。Ioannis A PAPPAS等[9]研究稀H2SO4預(yù)處理對PhalarisaquaticaL.產(chǎn)糖的影響,發(fā)現(xiàn)用2%(w/w)H2SO4在130 ℃對PhalarisaquaticaL.預(yù)處理60 min,葡萄糖產(chǎn)率可達85.05%,稀酸預(yù)處理后酶解生成葡萄糖的量比未處理時高1.7倍。本文研究采用0.3 mol/L H2SO4在150 ℃對棉稈預(yù)處理90 min,與棉稈原料直接酶解產(chǎn)糖相比[15],稀酸預(yù)處理后酶解的還原糖產(chǎn)率增大了2.12倍。由此可知,稀H2SO4預(yù)處理可以有效提高木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中糖類的釋放。

(2)棉稈等生物質(zhì)的水解糖化過程機理非常復(fù)雜,受多種因素的綜合影響,其動力學(xué)過程是非線性的,采用簡單的模型無法準確模擬和解釋酶解過程[2,14]。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是模擬生物神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能和結(jié)構(gòu)的數(shù)學(xué)模型,能較好地用于非線性、復(fù)雜的酶解過程的模擬與優(yōu)化[10-12]。Chenwei CHANG等[10]采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、多元線性回歸和偏最小二乘回歸模擬研究蒸汽爆破預(yù)處理對象草(napiergrass)酶解的影響,發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測性能最好。本文研究表明,當(dāng)中間隱含層的神經(jīng)元個數(shù)為5時,還原糖產(chǎn)率的網(wǎng)絡(luò)輸出值與實驗值之間的誤差最小,從而建立了H2SO4處理棉稈在纖維素酶中水解的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型(4-5-1),模型的MSE較小,R趨向于1,表明建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型可用于預(yù)測棉稈酶解產(chǎn)糖的過程。

(3)半纖維素中存在的木聚糖成分是纖維素酶對木質(zhì)纖維素底物水解的一道天然屏障,限制了纖維素酶與纖維素的結(jié)合[18],添加木聚糖酶能夠進一步對未去除的半纖維素進行水解,同時釋放出木糖。在木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)水解過程中,同時添加纖維素酶與木聚糖酶對水解產(chǎn)糖有顯著的協(xié)同作用。Geisa A L GONCALVES等[17]對乙酸預(yù)處理過后的甘蔗渣進行酶解研究發(fā)現(xiàn),反應(yīng)72 h后添加纖維素酶與木聚糖酶的實驗組水解生成還原糖的濃度比只添加纖維素酶的實驗組升高2.30倍。本文研究表明,在纖維素酶中添加木聚糖酶,可將H2SO4處理棉稈的還原糖產(chǎn)率由72.93%提高至92.42%。因此,木聚糖酶輔助纖維素酶酶解,二者之間的協(xié)同作用可使得在減少纖維素酶用量的前提下,添加較少量的木聚糖酶就可以獲得較高的還原糖產(chǎn)率,從而大幅減少纖維素酶用量,降低酶解成本,以及木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)水解產(chǎn)糖的成本。

4 結(jié)論

(1)研究了稀H2SO4預(yù)處理對棉稈酶解產(chǎn)糖的影響,當(dāng)稀H2SO4濃度為0.3 mol/L,反應(yīng)溫度為150 ℃,反應(yīng)時間為90 min時,棉稈的還原糖產(chǎn)率達到最大,為65.73%。

(2)建立了稀H2SO4預(yù)處理棉稈在纖維素酶中水解產(chǎn)糖的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型(4-5-1),確定纖維素酶用量是影響稀H2SO4預(yù)處理棉稈酶解產(chǎn)糖的主要因素。

(3)向纖維素酶溶液中添加木聚糖酶,可將H2SO4處理棉稈的還原糖產(chǎn)率由在纖維素酶單酶體系中的72.93%增大至92.42%。表明木聚糖酶與纖維素酶有較好的協(xié)同作用,采用混合酶酶解能夠有效提高木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的水解效率。本文的研究為新疆棉稈的高值化利用奠定基礎(chǔ)。