李思頡，楊勇，李海燕，高晨，任長虹*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，低氧適應(yīng)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室,北京 100053; 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方劑教研室,北京 100029)

腦中風(fēng)以其高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率、高死亡率及逐年遞增的防治費用成為危害我國居民健康最為嚴重的疾病之一，其人群的疊加效應(yīng)和快速增長給社會、家庭造成巨大的經(jīng)濟負擔(dān)和精神壓力，已成為嚴重影響國計民生的重要公共衛(wèi)生問題[1-2]，因此探討有效的治療藥物，積極改善患者的預(yù)后，意義重大。

當(dāng)歸芍藥散(DSS)對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用已得到共識[3]，當(dāng)歸芍藥散全方六味藥分為兩組，一是以當(dāng)歸、芍藥、川芎調(diào)肝理血；一是以白術(shù)、茯苓、澤瀉健脾調(diào)津。全方三血三水之品相濟并用，共奏調(diào)肝健脾，活血利水之功。當(dāng)歸芍藥散發(fā)揮其治療作用，是與其獨特的配伍結(jié)構(gòu)和活血利水的功效不能分割的。我們前期研究結(jié)果顯示，當(dāng)歸芍藥散原方配伍可以增加缺血性腦卒中小鼠的神經(jīng)再生[4]。本研究采用小鼠遠端大腦中動脈結(jié)扎模型(dMCAO)，探討當(dāng)歸芍藥散活血、利水不同配伍對腦缺血損傷神經(jīng)保護及神經(jīng)再生的貢獻度，以期從微觀層次上解讀中藥復(fù)方的效應(yīng)機制，豐富中醫(yī)活血利水法在缺血性腦血管病治療的內(nèi)涵，并為當(dāng)歸芍藥散在臨床的優(yōu)化配伍及用于缺血性腦血管病的治療提供理論和實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級C57/BL6雄性小鼠，體質(zhì)量20～24 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，SCXK(京)2007-0001。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實驗動物中心，溫度(22±2)℃，相對濕度(45±5)%，日照時間12 h。小鼠分籠喂養(yǎng)，每5只1籠，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

當(dāng)歸芍藥散組成(當(dāng)歸、川芎、白芍、澤瀉、茯苓、白術(shù)，當(dāng)歸、川芎、白芍、澤瀉、茯苓、白術(shù))，飲片購自同仁堂，采用醇提水沉法提取各個樣品，按照1∶5 w/v的比例加入95%乙醇室溫過夜，然后煮沸2次，每次2 h。過濾離心后留取提取液，剩余藥物殘渣加入蒸餾水(1∶4 w/v)煮沸兩次，每次1 h。過濾離心留取提取液，將兩次的提取液混合測濃度，調(diào)至1 g/mL，4 ℃冷藏。

1.3 主要試劑

恩氟烷(河北九派制藥)，水合氯醛(化學(xué)純，天津大茂化學(xué)試劑廠)，2,3,5氯化三苯基四氮唑藍(TTC，Sigma公司)，抗BDNF抗體及抗CXCR4抗體(Cells Signaling Technology公司)，抗DCX抗體(Santa Cruze公司)，抗BrdU抗體(Sigma公司)，免疫熒光二抗(Lifetechnologies公司)。

1.4 主要實驗器材

小動物肛溫檢測儀器(上海生物技術(shù)儀器有限公司)，手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械公司)。

2 實驗方法

2.1 大腦中動脈遠端阻塞模型(dMCAO)

小鼠稱體質(zhì)量后，面罩吸入1%～2%恩氟烷于30%O2和70%N2O的混合氣體中維持麻醉，術(shù)中監(jiān)測肛溫，維持在(37±0.2)℃。將右側(cè)頭部及頸部腹側(cè)的毛發(fā)剃除。局部皮膚用0.5%聚烯吡酮磺和75%乙醇消毒。將雙側(cè)頸總動脈與周圍組織分離出來，并用顯微彎鑷將雙側(cè)頸總動脈挑起。小鼠呈右側(cè)位放置，在左側(cè)眼外眥至外耳道之間作一長約0.5 cm切口。暴露顳肌，在顯微鏡下小心剪開顳肌，此時能隱約看到顱骨下的大腦中動脈皮層的分支，用顱骨鉆輕輕鉆一個小口，直徑約2 mm，暴露皮層支，用顯微彎鑷鉤住大腦中動脈并將其電凝阻斷。用小血管動脈夾阻斷雙側(cè)頸總動脈，15 min后松開并去除小血管夾，在切口處噴灑0.05 mL 0.25%布比卡因，縫合傷口。此模型具有與人的腦缺血發(fā)病模式較為近似的臨床特點。

2.2 動物分組及給藥

實驗分為7組，Sham組、空白對照組、原方組、活血2組、利水2組、活血倍量組、利水倍量組。每組按照以下藥物比例配伍：原方組：當(dāng)歸、川芎、白芍、澤瀉、茯苓、白術(shù)分別為68.3 mg/kg、68.3 mg/kg、363.8 mg/kg、181.9 mg/kg、91.0 mg/kg、91.0 mg/kg；活血組2組：當(dāng)歸、川芎、白芍分別為136.6 mg/kg、136.6 mg/kg、727.6 mg/kg；利水組2組：澤瀉、茯苓、白術(shù)分別為363.8 mg/kg、180.2 mg/kg、180.2 mg/kg；活血倍量組：當(dāng)歸、川芎、白芍、澤瀉、茯苓、白術(shù)分別為136.6 mg/kg、136.6 mg/kg、727.6 mg/kg、181.9 mg/kg、91.0 mg/kg、91.0 mg/kg；利水倍量組：當(dāng)歸、川芎、白芍、澤瀉、茯苓、白術(shù)分別為68.3 mg/kg、68.3 mg/kg、363.8 mg/kg、363.8 mg/kg、180.2 mg/kg、180.2 mg/kg；Sham組及空白對照組只灌注等體積的生理鹽水。dMCAO手術(shù)后立即灌胃給予DSS，每日1次直到取材。

2.3 神經(jīng)功能評分

采用兩種神經(jīng)功能評分方法。圓筒實驗：將小鼠放入高25 cm，直徑8 cm的透明圓筒中，記錄10 min內(nèi)小鼠患側(cè)(C)、健側(cè)(I)及雙前肢(B)觸碰圓筒壁的次數(shù)。計算公式為[I/(I+C+B)]-[C/(I+C+B)]×100%。貼條去除實驗：從籠子中取出動物，使用長0.4 cm寬0.3 cm的長方形粘性標簽粘貼在動物的兩個前肢，而后將動物置于直徑10 cm、高30 cm的透明圓筒中。分別記錄動物的嘴觸碰到貼條的時間，以及動物從每一個前肢上扯掉貼條所需的時間，允許扯掉貼條所需的時間最多為2 min。實驗的前3 d進行訓(xùn)練以篩選實驗動物，每天每只動物進行3次訓(xùn)練。

2.4 免疫熒光化學(xué)染色

小鼠深麻醉，使用生理鹽水由心臟灌注固定，取腦后固定于4% PFA，放在4 ℃冰箱，經(jīng)30%蔗糖脫水，至腦組織自然沉淀，冰凍切片20 μm。用5% BSA-PBST，室溫封閉60 min。甩去封閉液，滴加一抗，濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。PBS洗3次，3×10 min。二抗用Alex488或Alex594標記。不加一抗作為陰性對照，以確認抗體免疫反應(yīng)特異性。室溫避光孵育1 h。PBS洗3次，3×10 min。用含有DAPI的封片劑封片，用激光共聚焦顯微鏡(Biorad, Hertfordshire, UK)觀察。用Image Pro Plus V5進行病理學(xué)分析。BrdU染色，在加一抗之前用3N 鹽酸在37℃孵育30 min，然后用0.5 M硼酸洗10 min。

2.5 蛋白免疫印跡(Western blot)分析

小鼠10%水合氯醛腹腔麻醉，生理鹽水灌注后斷頭取腦，放入冰盒內(nèi)，將大鼠腦組織表面的血管絲剝離干凈。將鼠腦腹面朝上，去除腦干、雙側(cè)嗅腦及小腦，迅速置于液氮中速凍后，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱備用。腦組織稱重，按照腦重量(mg)/裂解液體積(mL)=1∶3的比例用RIPA蛋白裂解液(加入10 mM PMSF)，用玻璃勻漿器在冰上研磨后，靜置30 min；將研磨后的組織勻漿4 ℃，14 000 rpm，離心30 min；吸取上清，分裝后儲存于-80 ℃冰箱；酶標儀測定蛋白濃度。取60 μg蛋白樣品加5×上樣緩沖液，100℃沸水浴變性5 min，置于冰上驟冷。根據(jù)蛋白分子量配置相應(yīng)濃度的聚丙烯酰胺凝膠分離膠，5%積層膠。60 μg蛋白上樣，電泳轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，PVDF膜放入雜交袋中加入一抗，封口，4 ℃過夜；棄去一抗，TBST洗膜3×10 min，搖晃，室溫；加入二抗，封于雜交袋中，置于搖床上搖動，室溫下1 h；棄去二抗，TBST洗膜3×10 min，TBS洗膜1×10 min；將膜放入ECL化學(xué)發(fā)光試劑中孵育1 min后在化學(xué)發(fā)光儀上曝光拍照。使用Image J軟件進行半定量分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 DSS活血利水不同配伍對神經(jīng)功能的影響

我們采用兩種神經(jīng)功能評分方法評估小鼠的神經(jīng)功能(見表1及表2)。結(jié)果顯示，采用圓筒實驗評估神經(jīng)功能，與空白組比較，原方組改善了神經(jīng)功能，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而活血倍量組與空白組比較顯著改善了神經(jīng)功能(P<0.01)，與原方組比較更進一步改善了神經(jīng)功能，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。貼條實驗評估神經(jīng)功能，與空白組比較，原方組P<0.05，活血倍量組P<0.01；與原方組比較，活血倍量組更進一步改善了神經(jīng)功能，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3.2 DSS活血利水不同配伍對神經(jīng)再生的影響

見圖1及表3。圖1為各組SVZ區(qū)DCX及BrdU染色。由表3可見，與空白組比較，原方組DCX陽性細胞數(shù)以及DCX+/BrdU+細胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，活血倍兩組也顯著增加(P<0.01)，與原方組，活血倍量組更進一步增加了DCX陽性細胞數(shù)以及DCX+/BrdU+細胞數(shù)(P<0.01)。

表1 DSS活血利水不同配伍的圓筒實驗神經(jīng)功能結(jié)果比較

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與原方組比較，#P<0.05

表2 DSS活血利水不同配伍的貼條實驗神經(jīng)功能結(jié)果比較

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與原方組比較，#P<0.05

表3 SVZ區(qū)DCX陽性細胞數(shù)及BrdU+/DCX+細胞數(shù)

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與原方組比較，#P<0.05

3.3 DSS活血倍量組對BDNF、CXCR4的影響

根據(jù)我們前期免疫組織熒光實驗篩選出活血倍量組能夠顯著促進神經(jīng)再生(見圖1)。因此，我們選取3組動物：Sham組、dMCAO組、活血倍量組，在缺血后第7天取缺血半球SVZ區(qū)，采用Western blot檢測了與神經(jīng)再生相關(guān)因子BDNF(成熟及非成熟片段)、CXCR4。實驗結(jié)果顯示，活血倍量配伍顯著增加了成熟型BDNF片段的水平及CXCR4的表達(見圖2及表4)。

注：圖片為SVZ區(qū)DCX以及BrdU免疫熒光染色代表圖圖1 當(dāng)歸芍藥散活血利水不同配伍對神經(jīng)再生的影響

注：A.在缺血后第7天取缺血半球腦組織，采用Western blot分析DSS活血倍量組對BDNF的影響;B.采用Western blot分析DSS活血倍量組對CXCR4的影響圖2 DSS活血倍量組對BDNF及CXCR4表達的影響

表4 各組SVZ中BDNF的相對含量

注：與Sham組比較，☆P<0.05,☆☆P<0.01;與dMCAO組比較，△△P<0.01

表5 各組SVZ中CXCR4的相對含量

注：注：與Sham組比較，☆P<0.05,☆☆P<0.01;與dMCAO組比較，△△P<0.01

4 討論

DSS為醫(yī)圣張仲景創(chuàng)立，具有通調(diào)血脈、祛濕健脾之能，凡肝郁血虛、脾虛濕困、氣血不和、沖任失調(diào)等所致婦科病證，皆可辨證應(yīng)用。自當(dāng)歸芍藥散創(chuàng)立以來，歷代醫(yī)家多從仲景之說，以本方治婦人諸腹痛，亦間有醫(yī)家及方書依據(jù)本方調(diào)肝理脾，活血利水的組成結(jié)構(gòu)對其主治功用有所增益，《三因極一病證方論》記述本方“常服通暢血脈, 不生癰瘍”；《蘭臺軌范》、《赤水玄珠》均載其不僅能治妊娠腹中絞痛，心下急痛，及療產(chǎn)后血暈，崩中，久痢；考歷代醫(yī)籍對本方諸藥用量，治腹痛者，多以仲景《金匱要略》為藍本，以芍藥用量最大，而《證治摘要·卷上·眩暈》以此方治眩暈，當(dāng)歸芍藥散中，三倍芎歸煎服，頭痛者，亦以本方治之[4-5]。

隨著中醫(yī)臨床實踐的發(fā)展和基礎(chǔ)研究的深入，DSS被越來越多的應(yīng)用于內(nèi)科疾病，泌尿系統(tǒng)疾病如腎病綜合征、膜性腎病、腎性高血壓及慢性腎功能衰竭等；消化系統(tǒng)疾病如脂肪肝、潰瘍性結(jié)腸炎等；近年來本方還被用于腦血管疾病，如血管性癡呆，腦梗死等[6]。當(dāng)歸芍藥散主治證的演化和增益，與其調(diào)肝理脾的配伍結(jié)構(gòu)，活血利水的雙重功效不可分割，特別是其用于治療腦血管疾病方面，有其深刻的中醫(yī)理論內(nèi)涵。腦在中醫(yī)屬奇恒之府，腦絡(luò)是腦神的功能和結(jié)構(gòu)載體，具有貫通營衛(wèi)、環(huán)流經(jīng)氣、滲透氣血、互化津血的生理功能。脾失健運、水濕內(nèi)停、上犯腦絡(luò)、肝失疏泄、血瘀絡(luò)阻均可影響腦絡(luò)，而致腦絡(luò)受損，神機失養(yǎng)，造成神機運動物質(zhì)基礎(chǔ)匱乏，臟腑形骸信息聯(lián)絡(luò)欠暢。如果損傷日久，濕聚成痰，瘀久生熱，甚至化火動風(fēng)，則腦中風(fēng)的發(fā)生在所難免。而水津失調(diào)，瘀血阻絡(luò)無疑是中風(fēng)的基礎(chǔ)病機。因此，活血和利水是腦中風(fēng)的重要治法，而具有活血利水作用的DSS具有治療腦血管病的基礎(chǔ)優(yōu)勢，是防治腦缺血的有效方劑。因此我們根據(jù)DSS的活血利水不同配伍，將實驗設(shè)計7組：正常對照的Sham組、單純模型給與生理鹽水的空白組、原方配伍比例(當(dāng)歸、川芎、白芍、澤瀉、茯苓、白術(shù)比例為3∶3∶16∶8∶4∶4)的原方組、在原方基礎(chǔ)上，將活血的三味藥加倍的活血倍量組、將利水的三味藥加倍的利水倍量組、僅有活血的三味藥且加倍的活血2組，以及僅有利水的三味藥且加倍的利水2組。我們的結(jié)果顯示，原方雖然對神經(jīng)再生具有促進作用，但是活血倍量組對神經(jīng)再生的貢獻度最大，說明在腦中風(fēng)后神經(jīng)功能恢復(fù)期，活血調(diào)肝的治法可能對神經(jīng)功能恢復(fù)更有裨益。但是活血2組對神經(jīng)功能的改善以及神經(jīng)再生都沒有顯著影響，說明單純活血調(diào)肝的治法不如在活血調(diào)肝基礎(chǔ)上佐以利水。以上研究目前只限于實驗研究，有待進一步臨床試驗。

腦中風(fēng)后，腦組織中的神經(jīng)干細胞增殖，這些新生細胞能夠遷移到缺血區(qū)域并分化為成熟的神經(jīng)元，這種神經(jīng)再生機制對腦中風(fēng)患者的預(yù)后特別是腦高級神經(jīng)功能的恢復(fù)有著重要作用[7]。在局灶性腦缺血動物模型中，SVZ 神經(jīng)干細胞早在48 h即開始增殖，1～2周后達到高峰，3～4周后恢復(fù)到未增殖前的水平[8]。我們檢測了dMCAO模型后第7天SVZ區(qū)神經(jīng)前體細胞即DCX陽性細胞的數(shù)量，同時檢測了DCX與細胞增殖標志物BrdU雙陽性細胞數(shù)。結(jié)果顯示，在活血倍量組，這兩種細胞數(shù)都顯著高于原方組，說明活血倍量組對促進神經(jīng)再生貢獻度最大。我們進一步探討了活血倍量配伍促進神經(jīng)再生的分子機制。研究報道BDNF及CXCR4在神經(jīng)再生中具有重要調(diào)節(jié)作用[9-10]。成熟 BDNF(mBDNF)由前體 BDNF(Pro-BD-NF) 轉(zhuǎn)變合成，Pro-BDNF 分子量為35kD，mBDNF為14kD。我們的研究發(fā)現(xiàn)，活血倍量組顯著增加了mBDNF蛋白的表達。研究報道CXCR4在活化神經(jīng)干細胞中高表達，抑制CXCR4顯著降低神經(jīng)干細胞的增殖[11]，我們發(fā)現(xiàn)活血倍量配伍顯著增加了CXCR4的表達。以上研究結(jié)果表明，DSS活血倍量配伍可能通過增加mBDNF、CXCR4的表達促進神經(jīng)再生，從而促進神經(jīng)功能恢復(fù)。