胡雪梅，朱正耀，唐中生，朱世杰，范瑞娟，謝高宇

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是腦血管疾病引起的缺血性或出血性損傷而導(dǎo)致的以認(rèn)知功能障礙等為主要癥狀的臨床綜合征[1]。大腦出血性或缺血性損害會導(dǎo)致腦組織的炎癥，尤其對海馬CA1區(qū)影響較為明顯，從而影響人的學(xué)習(xí)記憶能力。研究表明，前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)/環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)信號通路參與多種疾病的炎癥反應(yīng)過程，在腦卒中引發(fā)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，并加重炎癥的發(fā)生。在正常組織中，COX-2表達(dá)較少，炎癥發(fā)生后COX-2的表達(dá)增加，并加重氧化應(yīng)激反應(yīng)，催生前列腺素等促炎因子，從而加重炎癥反應(yīng)，COX-2表達(dá)后催化花生四烯酸生成PGE2[2-3]。PGE2是關(guān)鍵的促炎因子，在調(diào)節(jié)炎癥中起著核心作用。穴位埋線是一種在中醫(yī)學(xué)和針灸學(xué)理論指導(dǎo)下，按照《實(shí)驗(yàn)動物穴位圖譜》將可吸收性外科縫線置入穴位內(nèi)，埋在穴位內(nèi)的可吸收外科縫線可對穴位產(chǎn)生持續(xù)性刺激以防治疾病的方法[4]。穴位埋線療法可活血化瘀，從而減輕炎癥，改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[5]，但其機(jī)理尚不明確?；诖?，本課題從炎癥因子的角度，研究穴位埋線治療后VD大鼠海馬CA1區(qū)COX-2以及血清中PEG2的變化及該變化與大鼠學(xué)習(xí)記憶改善的關(guān)系，以此揭示穴位埋線治療VD可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

健康雄性SD大鼠80只，體重250～300 g，清潔級，由重慶滕鑫比爾實(shí)驗(yàn)動物銷售有限公司提供，許可證號：SCXK(渝)2012-0005，實(shí)驗(yàn)動物常規(guī)飼養(yǎng)1周。

1.2 動物模型的建立

將80只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、VD模型組、VD尼莫地平組、VD穴位埋線組，除假手術(shù)組外，其他3組采用改良Pulsinelli’s 4血管阻斷法建立VD大鼠模型。采用3%戊巴比妥鈉(1 mL/100 g)腹腔麻醉，將麻醉后的大鼠固定，用手術(shù)剪將大鼠頸部的毛剪掉，碘伏消毒大鼠頸部皮膚，先行背側(cè)頸正中切口，用電凝針燒灼雙側(cè)第1頸椎翼小孔內(nèi)的椎動脈，造成永久性閉塞。再行腹側(cè)頸正中切口，鈍性分離皮下結(jié)構(gòu)，充分暴露頸總動脈，用玻璃分針將雙側(cè)頸總動脈與迷走神經(jīng)剝離，穿線備用。24 h后用微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈5 min，5 min后取開動脈夾。間隔1 h后，繼續(xù)微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈5 min，5 min后取下。共重復(fù)3次。大鼠在4條血管阻斷后1～2 min內(nèi)，翻正反射消失且虹膜變白及瞳孔散大，視為造模成功。保證每組至少10只。

1.3 治療

VD穴位埋線組：術(shù)后第7天后開始治療，整個治療周期只埋線一次，選擇百會、膈俞、氣海、三陰交、膻中五穴，膈俞(雙穴)和三陰交(雙穴)，選穴及定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6]提供的方法，并模擬人體腧穴骨度分寸法量取。治療方法：將大鼠麻醉后固定，將可吸收性外科縫線剪成若干段，每段1～2 cm，消毒備用。使用鑷子將剪好的可吸收外科縫線裝入埋線針具。穴位皮膚消毒，將埋線針具刺入穴位，然后將羊腸線推入穴內(nèi)。

VD尼莫地平組：尼莫地平按20 mg/(kg·d)用量，每天上午9∶00-11∶00進(jìn)行灌胃治療，連續(xù)治療15天。

假手術(shù)組和VD模型組：蒸餾水1 mL/100 g灌胃，連續(xù)15天。

1.4 各組大鼠Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力檢測

Morris水迷宮為圓形水池，直徑100 cm，深50 cm，水深30 cm，水溫(24±2)℃，將水池分為四個象限，不同象限壁上放置不同圖型標(biāo)志物，第三象限放置一個無色透明的逃生平臺，沒入水下2 cm左右，直徑6 cm，高28 cm。先進(jìn)行定向航行實(shí)驗(yàn)：將大鼠從第一象限池壁放入水中，測定大鼠找到逃生平臺的時間，記錄大鼠從水中爬上站臺所需時間為逃避潛伏期。大鼠90 s內(nèi)找到逃生平臺，并在平臺上停留(2～3 s)，視為找到平臺，連續(xù)6天。第7天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)：將大鼠從第一象限入水點(diǎn)放入水池，記錄90 s內(nèi)大鼠在第Ⅲ象限游泳時間和穿越站臺次數(shù)。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 ELISA檢測血清中PGE2含量 采集各組大鼠血清標(biāo)本，購買相應(yīng)試劑盒，按照說明書進(jìn)行操作。

1.5.2 Western blotting檢測各組大鼠海馬CA1區(qū)COX-2蛋白表達(dá) 稱取海馬組織加入適量RIPA(細(xì)胞裂解液)提取液提取蛋白離心，收集上清液，再按細(xì)胞蛋白提取試劑盒說明進(jìn)行蛋白提取，檢測蛋白濃度。將制備好的蛋白樣品加入凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜，取膜。一步法快速WB試劑盒將其加入封閉液中，用蒸餾水將一步法試劑盒中的10×洗液稀釋為1×洗液；將二抗HRP放入離心管，使一抗與二抗充分混勻，于室溫條件下孵育。漂洗去掉抗體混合液，洗液清洗3次，每次洗液漂洗。在反應(yīng)盒內(nèi)加入高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒A液及B液，混勻，放入PVDF膜，使膜表面與試劑充分接觸5 min，放于凝膠成像儀中，選擇化學(xué)發(fā)光，開始曝光。照相并保存，用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)軟件進(jìn)行圖像分析，采用目的蛋白與內(nèi)參的比值來表示蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮行為學(xué)檢測結(jié)果

相比于假手術(shù)組，VD模型組平均逃避潛伏期延長(P<0.01)，第3象限活動時間縮短，穿越平臺次數(shù)減少(P<0.01)；相比于VD模型組，VD穴位埋線組平均逃避潛伏期縮短(P<0.05)，第3象限活動時間延長、穿越站臺次數(shù)增多(P<0.05)，表明穴位埋線能夠改善大鼠認(rèn)知狀況和記憶能力，見表1。

組別平均逃避潛伏期(S)第3象限活動時間(S)穿越平臺次數(shù)VD模型組84.98±18.83▲19.57±9.19▲0.66±1.21▲VD穴位埋線組48.98±14.69△40.31±8.97△2.50±1.04△VD尼莫地平組30.97±10.96△57.03±11.88△3.33±2.16△假手術(shù)組23.98±11.5868.15±13.046.00±1.41

注：與假手術(shù)組比較，▲P<0.01；與VD模型組比較，△P<0.05。

2.2 ELISA檢測VD大鼠血清PGE2水平

相比于假手術(shù)組，VD模型組大鼠血清中PGE2表達(dá)升高(P<0.05)；相比于VD模型組，穴位埋線組大鼠血清中PGE2表達(dá)水平降低(P<0.05)。PGE2作為非常關(guān)鍵的促炎因子，其表達(dá)降低提示VD大鼠腦組織中炎癥減輕。穴位埋線以及尼莫地平都可以降低PGE2的表達(dá)，見表2。

2.3 Western-blot檢測 VD大鼠海馬CA1區(qū)中COX-2蛋白表達(dá)量的變化

相比于假手術(shù)組，VD模型組海馬CA1區(qū)中COX-2表達(dá)上升(P<0.05)；相比于VD模型組，穴位埋線組大鼠海馬CA1區(qū)COX-2表達(dá)水平降低(P<0.05)。COX-2高表達(dá)能促進(jìn)炎性細(xì)胞因子生成，加重炎癥反應(yīng)，其表達(dá)降低揭示了VD大鼠組織中炎癥減輕。穴位埋線以及尼莫地平都可以降低CA1區(qū)COX-2的表達(dá)，見表2，圖1。

組別血清PGE2含量(pg/mL)CA1區(qū)COX-2表達(dá)假手術(shù)組190.77±6.83864.96±83.35VD模型組545.59±31.42▲2352.95±230.35▲VD穴位埋線組362.56±23.66△1562.97±194.19△VD尼莫地平組246.92±17.81△1101.42±165.80△

注：與假手術(shù)組比較，▲P<0.05；與VD模型組比較，△P<0.05。

圖1 VD大鼠海馬CA1區(qū)中COX-2蛋白表達(dá)量的變化蛋白電泳

3 討論

血管性癡呆(VD)屬于中醫(yī)學(xué)“呆病”范疇，病位在腦，與五臟六腑的聯(lián)系也非常緊密，病機(jī)多屬本虛標(biāo)實(shí)，氣滯血瘀?！鹅`樞》曰：“腦為髓海，髓海不足則腦轉(zhuǎn)耳鳴，脛酸眩冒，目無所見，懈怠安臥”[7]，認(rèn)為髓海不足是該病最主要的病機(jī)之一?！堆C論》指出：“凡心有瘀血也令人健忘”，闡述了痰瘀互結(jié)，腦絡(luò)不通，髓海失養(yǎng)，從而導(dǎo)致記憶能力下降。針對“呆病”的治療，各派醫(yī)家也有各自的見解，主要從臟腑辨證論治和八綱虛實(shí)辨證論治兩方面辨證治療。治療手段主要為中藥湯劑辨證治療和針灸治療相結(jié)合。研究表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可補(bǔ)氣生血，從而改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[8]。針刺能降低腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損評分，實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)作用[9]。穴位埋線可以調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞代謝，刺激腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞的活躍，減輕神經(jīng)功能受損程度[10]。本課題取百會、膈俞、氣海、三陰交、膻中等穴位，達(dá)到醒神開竅的作用。百會穴位于督脈上，是督脈的第一要穴，是督脈與足太陽膀胱經(jīng)的交會穴。督脈入絡(luò)腦，與“元神”相系，主治神志病，而百會穴為督脈陽氣至盛之穴，故百會可升舉陽氣、開竅醒神，是治療“呆病”的主穴[11]。遠(yuǎn)端取穴法取膈俞、氣海、膻中、三陰交，可補(bǔ)益氣血。諸穴合用，最終達(dá)到補(bǔ)氣生血、開竅醒神的作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，VD是由腦血管病變導(dǎo)致腦組織血液供應(yīng)障礙，腦組織由于缺血導(dǎo)致?lián)p傷，從而導(dǎo)致大量神經(jīng)元受損，最終導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙為主要癥狀的一種疾病。有大量研究表明，腦缺血損傷后會發(fā)生炎性反應(yīng)，炎性反應(yīng)可修復(fù)受損組織，具有神經(jīng)保護(hù)作用，但過度表達(dá)又可加重腦組織損傷。腦缺血再灌注會加重腦部的損傷，加重炎性反應(yīng)。研究表明，COX-2參與多種疾病的炎癥反應(yīng)過程，是導(dǎo)致炎癥性疾病的重要機(jī)制之一，炎癥發(fā)生后COX-2表達(dá)增加，并隨炎癥的加重而增高，而在大腦缺血性損傷的過程中，最容易受損的部位是海馬CA1區(qū)，最終導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙[12]。本實(shí)驗(yàn)通過四血管阻斷法建立VD大鼠模型，研究穴位埋線對VD大鼠海馬CA1區(qū)COX-2水平表達(dá)的影響。結(jié)果提示，穴位埋線可使 COX-2表達(dá)受到抑制。

環(huán)氧化酶是花生四烯酸合成前列腺素類物質(zhì)的重要酶，COX-2表達(dá)增加，使得前列腺素(PG)合成增加[13]。PGE2是關(guān)鍵的促炎因子，在調(diào)節(jié)炎癥中起著核心作用，前列腺素由人體內(nèi)的花生四烯酸經(jīng)過代謝后生成，它在人體內(nèi)具有非常廣泛的生理作用，與人體的炎癥反應(yīng)有密切的關(guān)系，并加重炎癥的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，腦缺血再灌注后VD大鼠血液中PGE2的表達(dá)增加，穴位埋線組以及尼莫地平組大鼠血液中PGE2表達(dá)水平均降低。大鼠經(jīng)過前期的引導(dǎo)學(xué)習(xí)后，根據(jù)水迷宮行為學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，與VD模型組比較，穴位埋線組第3象限活動時間明顯延長、穿越站臺次數(shù)明顯增多。表明穴位埋線可改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上所訴，穴位埋線可能通過抑制VD大鼠腦海馬CA1區(qū)COX-2和血清PGE2的表達(dá)，從而改善VD大鼠腦損傷引起的炎癥反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)作用，提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，但其具體的作用機(jī)制尚未明確，需進(jìn)一步研究。