陳方園，蔣立勤，劉騰飛，余 靜，孫玉冰，林 瑤

(浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310053)

花生(Arachishypogaea.L)為豆科(Leguminosae)落花生屬植物，是我國(guó)種植非常廣泛的農(nóng)作物，其副產(chǎn)品花生殼占比較大，但資源利用率較低，僅有少量被加工成飼料或用于化工原料的制備[1-2]?；ㄉ鷼ず写罅奎S酮類化合物[3-4]，其中以木犀草素為主，具有抗氧化、抗菌消炎、鎮(zhèn)咳、祛痰平喘、增強(qiáng)免疫和抗腫瘤等作用[5-12]?；ㄉ鷼な悄壳耙阎鞠菟剌^高的可再生、來(lái)源豐富的植物資源，是制備木犀草素的理想原料。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)花生果實(shí)進(jìn)行了一系列研究[13-15]，而對(duì)其莖殼的研究報(bào)道相對(duì)較少。因此，本課題利用高效液相色譜(High performance liquid chromatography，HPLC)檢測(cè)花生殼中木犀草素含量，響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，為花生殼木犀草素的開(kāi)發(fā)利用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

花生果：浙江省臨安市提供，手工剝殼，烘干，粉碎過(guò)60目篩得到花生殼粉末；木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品(98%)：購(gòu)自上海金穗生物公司，批號(hào)：491-70-3。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 FW-135粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；FA2004電子天平，上海市菁海儀器有限公司；GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；B-206電熱恒溫水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠；KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5-A臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；Waterse2695高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司。

1.2.2 試劑 無(wú)水甲醇(分析純)、磷酸(分析純)、甲醇(色譜純)等。

1.3 木犀草素含量測(cè)定[16]

1.3.1 色譜條件 hypersilods2色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸溶液(55∶45)；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg，用適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容后搖勻，制成濃度為0.1 mg/mL的木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.3 線性關(guān)系考察 精密稱取10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL的0.02 mg/mL木犀草素對(duì)照品進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，在HPLC上測(cè)定并記錄木犀草素的出峰時(shí)間及其峰面積，以進(jìn)樣體積為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。

1.3.4 精密度試驗(yàn) 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.02 mg/mL，重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣體積為20 μL，計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.02 mg/mL，分別在制備0、1、2、6、8 h進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為20 μL，計(jì)算峰面積的RSD。

1.3.6 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知木犀草素含量的花生殼樣品1 mg，共9份，3份一組，分別加入0.015、0.030、0.060 mg木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品，按樣品提取方法進(jìn)行提取并測(cè)定含量，計(jì)算木犀草素平均加樣回收率。

1.4 單因素試驗(yàn)[17]

1.4.1 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響 取1 g花生殼粉末，共6份，分別加入60%、65%、70%、75%、80%、90%的甲醇溶液20 mL，置于80 ℃恒溫水浴鍋中提取0.5 h。靜置，待其冷卻，以3 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，取上層清液2 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度線后搖勻，按標(biāo)線測(cè)定的方法進(jìn)樣，平行測(cè)試三組。測(cè)得木犀草素含量與甲醇體積分?jǐn)?shù)的關(guān)系。

1.4.2 料液比對(duì)提取率的影響 取1 g花生殼粉末，共6份，分別以料液比(g/mL)為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40加入80%的甲醇溶液，置于80 ℃的恒溫水浴鍋中提取0.5 h。靜置，待其冷卻，以3 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，取上層清液2 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度線后搖勻，按標(biāo)線測(cè)定的方法進(jìn)樣，平行測(cè)試三組。測(cè)得木犀草素含量與料液比的關(guān)系。

1.4.3 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 取1 g花生殼粉末，共6份，加入80%的甲醇溶液20 mL，置于80 ℃的恒溫水浴鍋中分別提取0.5、1、1.5、2、2.5、3 h。靜置，待其冷卻，以3 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，取上層清液2 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度線后搖勻，按標(biāo)線測(cè)定的方法進(jìn)樣，平行測(cè)試三組。測(cè)得木犀草素含量與提取時(shí)間的關(guān)系。

1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

響應(yīng)面法Design-Expert8.0.5優(yōu)化提取[18-19]，實(shí)驗(yàn)采用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)，按照設(shè)計(jì)所得的方案對(duì)花生殼進(jìn)行提取測(cè)定，并根據(jù)所得的數(shù)據(jù)，采用Design-Expert軟件對(duì)其進(jìn)行回歸擬合，得出木犀草素提取率與三因素之間的回歸方程。進(jìn)而對(duì)方程進(jìn)行回歸分析及方差分析，考察實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)模型的可行性與三因素(甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間)對(duì)響應(yīng)值(木犀草素提取率)之間的相關(guān)性，以期得到花生殼中木犀草素的最佳提取工藝，并通過(guò)HPLC測(cè)定在最佳提取工藝下花生殼中木犀草素的含量。響應(yīng)面分析因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

2 結(jié)果與討論

2.1 木犀草素含量測(cè)定結(jié)果

2.1.1 線性關(guān)系試驗(yàn) 以色譜峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣質(zhì)量(X)進(jìn)行回歸，得到木犀草素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=4E006X+14310，R2=0.999 7，線性范圍在0.2～0.6 μg之間。在本試驗(yàn)的色譜條件下，木犀草素的保留效果較好，基本達(dá)到基線分離，出峰時(shí)間約為7.5 min，分析時(shí)間較短，有利于快速分析。木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜見(jiàn)圖1，花生殼供試樣品的HPLC色譜見(jiàn)圖2。

圖1 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜

圖2 花生殼供試樣品的HPLC色譜

2.1.2 精密度試驗(yàn) 測(cè)得木犀草素的峰面積RSD為2.20%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 測(cè)得木犀草素的峰面積RSD為2.80%，表明儀器進(jìn)樣穩(wěn)定性良好。

2.1.4 加樣回收試驗(yàn) 測(cè)得木犀草素的平均回收率為99.2%，RSD為0.48%，表明本方法具有良好的準(zhǔn)確性。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響 木犀草素的提取率依次為27.6、35.2、35.4、37.1、53.8、32.5 μg/g。甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)木犀草素提取率達(dá)到最大，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)升為90%時(shí)，木犀草素提取率反而下降，故選取80%甲醇為最佳濃度，結(jié)果見(jiàn)圖3a。

2.2.2 料液比對(duì)提取率的影響 木犀草素的提取率依次為38.4、37.9、47.0、43.5、36.3、42.2 μg/g。料液比為1∶25時(shí)木犀草素提取率達(dá)到最大，且當(dāng)料液比繼續(xù)增大時(shí)，木犀草素提取率反而下降，故選取1∶25為最佳料液比，結(jié)果見(jiàn)圖3b。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 木犀草素的提取率依次為43.2、43.3、43.3、45.5、53.2、36.1 μg/g。提取時(shí)間較短時(shí)，木犀草素提取率較為平穩(wěn)，當(dāng)提取時(shí)間為2.5 h時(shí)，木犀草素提取率達(dá)到最大，且當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)增大時(shí)，木犀草素提取率反而變小，故選取2.5 h為最佳提取時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)圖3c。

圖3 甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間對(duì)木犀草素提取率的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面數(shù)值分析 響應(yīng)面分析方案與響應(yīng)值結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用Design-ExpertV8.0.5軟件對(duì)其進(jìn)行回歸擬合，得到的木犀草素提取率(Y)對(duì)甲醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)的回歸方程：Y=30.63+0.093A+0.053B-0.065C-0.51AB-0.052AC-2.27BC-1.33A2-1.57B2-1.43C2。

2.3.2 回歸方程各項(xiàng)方差分析 響應(yīng)面回歸方程模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)木犀草素提取率有非常顯著的影響，提取時(shí)間和液料比有顯著影響，提取時(shí)間和液料比交互作用時(shí)，對(duì)木犀草素提取率具有極明顯的影響。模型P值<0.000 1，響應(yīng)回歸模型具有極顯著性，失擬項(xiàng)P>0.05，表明失擬不顯著，說(shuō)明該回歸模型擬合程度較好，可用于花生殼中木犀草素的提取工藝的理論預(yù)測(cè)。

表2 響應(yīng)面分析方案與響應(yīng)值結(jié)果

表3 響應(yīng)面回歸方程模型的方差分析結(jié)果

注：***P<0.001為極顯著，**P<0.01為非常顯著，*P<0.05為顯著。

2.3.3 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面圖[20]能夠非常直觀明確地反映出各單因素之間的交互作用以及對(duì)響應(yīng)值的影響，響應(yīng)曲面越陡，表明該因素條件對(duì)響應(yīng)值的影響越大，反之，響應(yīng)曲面越平穩(wěn)，表明該因素條件對(duì)響應(yīng)值的影響越小。圖4為回歸模型的響應(yīng)面分析圖，由圖4可知，A(甲醇體積分?jǐn)?shù))和B(料液比)、B(料液比)和C(提取時(shí)間)存在顯著的交互作用，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面呈現(xiàn)出高度扭曲；A(甲醇體積分?jǐn)?shù))和C(提取時(shí)間)的交互作用不顯著，表現(xiàn)為曲面扭曲程度較低。采用SAS工具箱對(duì)回歸方程進(jìn)行一階求偏導(dǎo)，得到響應(yīng)值(Y)處于最大值時(shí)的A、B、C的編碼值分別為：A=0.02，B=0.07，C=-0.08。即花生殼木犀草素的最佳提取工藝為甲醇體積分?jǐn)?shù)81.6%，料液比1∶26.75，提取時(shí)間2.3 h。在此工藝下，木犀草素提取率理論值為30.64 μg/g。

圖4 甲醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)與木犀草素提取率的響應(yīng)面分析

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在試驗(yàn)得出的最佳花生殼木犀草素提取條件下，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)重復(fù)3次。得到的木犀草素提取率的平均值為30.38 μg/g，RSD值為1.34%。理論預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值的相對(duì)誤差為0.26 μg/g，可見(jiàn)該模型具有較強(qiáng)的預(yù)測(cè)性，優(yōu)選的花生殼中木犀草素提取工藝準(zhǔn)確可靠、合理可行。

3 結(jié)語(yǔ)

利用高效液相色譜法可以高效準(zhǔn)確地測(cè)定出花生殼中木犀草素的含量，并結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化花生殼中木犀草素的提取工藝，確定了最佳提取方案為甲醇體積分?jǐn)?shù)81.6%，料液比1∶26.75，提取時(shí)間2.3 h。在此工藝下，木犀草素提取率為30.64 μg/g。經(jīng)驗(yàn)證該方法穩(wěn)定可行，為花生殼的綜合利用、木犀草素的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供了理論和實(shí)踐依據(jù)。