徐 蕊，高仕謙，吳友誼*，毛宇成

(1.蘇州科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215009；2.江蘇省環(huán)境科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215009)

含有糖和蛋白質(zhì)的食品在高溫(>120 ℃)加熱期間(例如烘烤、油炸、燒烤等)會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)(褐變反應(yīng))[1]，其中間產(chǎn)物丙烯酰胺(Acrylamide，AA)和5-羥甲基糠醛(5-Hydroxymethylfurfural，5-HMF)由于在食品中廣泛存在且毒理效應(yīng)顯著而倍受關(guān)注。據(jù)報(bào)道[2]，AA具有神經(jīng)、肝和基因毒性作用；5-HMF對(duì)人類和動(dòng)物有染色體致突變性和致癌性。我國(guó)食用植物油生產(chǎn)多以含有大量蛋白質(zhì)和糖類(或稱碳水化合物)的油籽為原料。AA和呋喃類有害物質(zhì)會(huì)在高溫焙炒(150～180 ℃)油籽的過(guò)程中產(chǎn)生[3-4]，但目前有關(guān)AA和5-HMF的分析研究中，樣品基質(zhì)集中于谷物類(如麥片、面包、薄脆餅干)、奶粉、牛奶、咖啡和馬鈴薯類等產(chǎn)品，食用油基質(zhì)中此兩種目標(biāo)物的研究非常缺乏。且現(xiàn)有植物油中對(duì)5-HMF進(jìn)行分析研究[5-7]的實(shí)驗(yàn)均需使用大量正己烷等有機(jī)溶劑，不環(huán)保且操作復(fù)雜。已有專利[8]利用油脂受熱誘導(dǎo)所產(chǎn)生的物質(zhì)如丙烯酰胺、糠醛、呋喃類等的含量區(qū)分商品植物油、地溝油、煎炸老油，但尚未發(fā)現(xiàn)食用油中AA的相關(guān)檢測(cè)研究。因此建立食用油中AA和5-HMF的分析檢測(cè)方法對(duì)食用油質(zhì)量管控、食用油安全和營(yíng)養(yǎng)健康等具有非常重要的實(shí)際意義。

目前常用的檢測(cè)AA和5-HMF的方法包括高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法，但操作均較為復(fù)雜、檢測(cè)成本高，并且難以對(duì)復(fù)雜樣品基質(zhì)中的微痕量目標(biāo)物進(jìn)行快速準(zhǔn)確檢測(cè)[9]。近年來(lái)，毛細(xì)管電泳(Capillary electrophoresis，CE)因具有分析速度快、分離效率高、環(huán)境友好(試劑消耗微量)和檢測(cè)成本低等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是食品科學(xué)領(lǐng)域高效的分析工具[10]。食用油基質(zhì)復(fù)雜，需要前處理以富集和凈化。常用的AA和5-HMF的前處理技術(shù)，如固相萃取[11]、液液萃取[12]、液液微萃取[7]等方法或多或少會(huì)使用有機(jī)溶劑且耗時(shí)，因而開發(fā)簡(jiǎn)捷且環(huán)保的方法極為必要。分散液液微萃取(Dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME)相比于傳統(tǒng)方法具有簡(jiǎn)單、快速、成本低、回收率高等優(yōu)點(diǎn)，自2006年被提出后倍受關(guān)注[13-14]，且已成功應(yīng)用于各種基質(zhì)中痕量污染物的分析。然而，DLLME的萃取劑和分散劑大多采用有機(jī)溶劑，限制了其發(fā)展應(yīng)用[15]。而離子液體(Ionic liquid，IL)由于低揮發(fā)性和低毒性被越來(lái)越多地用作DLLME的萃取溶劑[16]。IL-DLLME融合了以上兩者的優(yōu)點(diǎn)，而且IL可有效吸收微波能量，采用微波輔助(Microwave assistant，MA)將更有利于IL萃取分析物[17]。另外，該方法無(wú)需分散劑，只需借助微波儀自帶的磁力攪拌作用即可達(dá)到較好分散效果，且開發(fā)免分散劑的DLLME方法也將是未來(lái)發(fā)展的一種趨勢(shì)[16,18]。

本研究將結(jié)合IL-DLLME、MA以及CE的優(yōu)勢(shì)，建立一種基于離子液體和免分散劑的微波輔助萃取結(jié)合毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(MEKC)同時(shí)分析檢測(cè)食用油中AA和5-HMF的簡(jiǎn)捷、綠色的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

AA標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.8%，阿拉丁公司)；5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%，阿法埃莎公司)；1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([C2MIM][BF4])、溴化 1-丁基-3-甲基咪唑([C4MIM]Br)、溴化1-己基-3-甲基咪唑([C6MIM]Br)、溴化1-辛基-3-甲基咪唑([C8MIM]Br)(純度均為99%，上海成捷化學(xué)有限公司)；甲醇(色譜純，美國(guó)Sigma公司)；氫氧化鈉、鹽酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)、四硼酸鈉(分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司)。

P/ACETMMDQ毛細(xì)管電泳儀配PDA檢測(cè)器(美國(guó)貝克曼公司)；UWave-2000 多功能微波合成萃取儀(上海新儀微波化學(xué)科技有限公司)；KQ-300E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司)；SK-1快速混勻器(金壇市科析儀器有限公司)；TGL-16C 臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；AL204 電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；高溫鼓風(fēng)干燥箱(上海姚氏儀器設(shè)備廠)；PHS-3C臺(tái)式pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；熔融石英毛細(xì)管(河北銳灃色譜器件有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取25 mg AA和5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容后得到1 000 μg/mL的混標(biāo)儲(chǔ)備液，密封儲(chǔ)存于-4 ℃下待用。各濃度混標(biāo)使用液由儲(chǔ)備液加甲醇稀釋得到。

1.2.2 樣品采集芝麻油、金龍魚大豆油(精煉一級(jí))和菜籽油購(gòu)自校園周邊超市，其中大豆油不含AA和5-HMF，作為樣品空白?；ń酚蛠?lái)自校園周邊餐館自制，煎炸老油來(lái)自校園周邊炸串小吃攤，廢餐廚油粗制品為蘇州某餐廚油脂回收公司回收的廢棄餐廚油經(jīng)分選、濕熱分解后得到的油。

1.2.3 樣品前處理在2 mL油中，加180 μL的[C8MIM]Br離子液體和一個(gè)小磁子，于70 ℃下微波輔助分散液液微萃取12 min，置于-4 ℃冰箱中冷凍5 min，用磁體沿管壁緩慢取出轉(zhuǎn)子，以10 000 r/min高速離心5 min。定量移取160 μL下相后，加硼砂溶液(20 mmol/L，pH 9.7)使溶液總體積為400 μL，渦旋混勻1 min，10 000 r/min高速離心5 min后取下相，經(jīng)0.22 μm針式PVDF濾頭(天津市津騰試驗(yàn)設(shè)備有限公司)過(guò)濾，進(jìn)CE分析。加標(biāo)樣品的處理與上述步驟相似，但需先在油樣中加入一定量的混標(biāo)。

1.2.4 膠束電動(dòng)色譜條件實(shí)驗(yàn)使用未涂覆的熔融石英毛細(xì)管(內(nèi)徑50 μm，總長(zhǎng)度49.2 cm，有效長(zhǎng)度38.5 cm)進(jìn)行電泳分離。所有溶液均經(jīng)0.22 μm濾頭過(guò)濾。每天進(jìn)樣前，依次用1 mol/L NaOH、水、運(yùn)行緩沖液(BGE)沖洗毛細(xì)管 8、5、6 min；兩次運(yùn)行間用BGE沖洗2 min。分離電壓為12 kV；0.5 psi(3 447.39 Pa)壓力下進(jìn)樣6 s；檢測(cè)波長(zhǎng)為202 nm；溫度25 ℃；緩沖溶液：含130 mmol/L SDS的20 mmol/L硼砂溶液(pH 9.7)。

2 結(jié)果與討論

2.1 膠束電動(dòng)色譜條件的優(yōu)化

毛細(xì)管電泳條件的優(yōu)化因子包括緩沖液pH值和濃度、十二烷基硫酸鈉(SDS)的濃度、分離電壓、進(jìn)樣時(shí)間和毛細(xì)管柱溫。

2.1.1 緩沖液pH值及濃度考察了硼砂和磷酸鹽緩沖液對(duì)目標(biāo)物分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)磷酸鹽的電流相對(duì)較大且目標(biāo)物響應(yīng)和分離效果欠佳。因此，選擇硼砂緩沖液并考察了其pH值的影響，結(jié)果顯示，在pH 9.2～10.8范圍內(nèi)，隨著pH值的增加，目標(biāo)物遷移時(shí)間延長(zhǎng)，峰形變寬；當(dāng)硼砂緩沖液為pH 9.7 時(shí)，兩目標(biāo)物的響應(yīng)和分離效果最好，因此選擇pH 9.7進(jìn)行后續(xù)研究。在0～20 mmol/L范圍內(nèi)，硼砂溶液濃度越大，目標(biāo)物遷移時(shí)間越長(zhǎng)，目標(biāo)物峰面積越大，當(dāng)硼砂濃度大于20 mmol/L后，電導(dǎo)率增加，基線不穩(wěn)，致使目標(biāo)物響應(yīng)重現(xiàn)性變差，因而采用 20 mmol/L硼砂溶液作為緩沖溶液。

2.1.2 SDS濃度在分離過(guò)程中，由SDS形成的膠束可通過(guò)與目標(biāo)物之間的疏水和靜電相互作用改善目標(biāo)物的響應(yīng)和分離情況。本文考察了緩沖液中不同濃度(10～150 mmol/L)的SDS對(duì)目標(biāo)物分離的影響。發(fā)現(xiàn)高濃度的SDS可改善目標(biāo)物的分離情況，但也導(dǎo)致焦耳熱增加，使得信噪比和重現(xiàn)性變差，最終選擇含有130 mmol/L SDS的20 mmol/L硼砂溶液(pH 9.7)作為最佳緩沖液。

2.1.3 分離電壓考察了分離電壓在10～20 kV范圍內(nèi)對(duì)各組分遷移時(shí)間的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著電壓的增加，遷移時(shí)間因電滲流(EOF)的增加而減小。然而，由于較高電壓下的焦耳熱顯著，導(dǎo)致目標(biāo)物響應(yīng)不佳以及基線漂移。綜合考慮后選擇12 kV作為分離電壓。

2.1.4 進(jìn)樣時(shí)間在進(jìn)樣壓力為0.5 psi(3 447.39 Pa)條件下，考察了進(jìn)樣時(shí)間在2～10 s范圍內(nèi)的影響。當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間為6 s時(shí)，得到分析物最佳的峰面積和重現(xiàn)性，當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，僅觀察到峰高略有增加，且峰寬變寬，峰形尖銳性變差。因此最終選擇6 s為進(jìn)樣時(shí)間。

2.1.5 毛細(xì)管柱溫考察了毛細(xì)管柱溫(15、20、25、30 ℃)對(duì)分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)柱溫對(duì)目標(biāo)物的分離效果影響相對(duì)較小。隨著柱溫升高，溶液粘度降低，出峰時(shí)間縮短，電滲流加快，影響準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，因此選擇25 ℃為最佳柱溫。

2.2 萃取條件的優(yōu)化

為了獲得最佳的萃取效果，通過(guò)單因子優(yōu)化考察評(píng)估了一系列變量，包括離子液體的種類和體積、微波輔助萃取條件和樣品油體積，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

圖1 離子液體種類對(duì)萃取效果的影響Fig.1 Effect of ionic liquid types on extraction recovery

2.2.1 離子液體種類IL通常由相對(duì)較大的有機(jī)陽(yáng)離子和單個(gè)或復(fù)雜的陰離子組成。IL的結(jié)構(gòu)對(duì)其理化性質(zhì)有重要影響，例如密度、粘度、在樣品溶液中的溶解度等，這些性質(zhì)會(huì)強(qiáng)烈影響目標(biāo)分析物的提取效率。本研究對(duì)4種咪唑類IL，包括[C2MIM][BF4]、[C4MIM]Br、[C6MIM]Br和[C8MIM]Br進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)[C2MIM][BF4]對(duì)5-HMF無(wú)提取能力。其它3種IL具有相同陰離子但陽(yáng)離子(主要是烷基鏈長(zhǎng)度)不同。有研究表明，離子液體的疏水性主要取決于其陽(yáng)離子的性質(zhì)，即烷基鏈長(zhǎng)度越長(zhǎng)疏水性越好[18]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)表明，[C4MIM]Br、[C6MIM]Br和[C8MIM]Br 3種IL對(duì)兩種目標(biāo)物的提取能力順序?yàn)镃8>C4>C6，提取效率并未隨著離子液體中陽(yáng)離子的烷基鏈長(zhǎng)度增加而增加。Raj[19]和Sankaran[20]等在研究IL的理化特性時(shí)也發(fā)現(xiàn)了[C6MIM]Br類似的異常結(jié)果(親水性順序?yàn)镃6≥C4>C8)。另外，Zhang等[21]為提高IL對(duì)丙烯酰胺的選擇性制備了含有辛基側(cè)鏈的IL([OMIM]Br)，并發(fā)現(xiàn)具有類似結(jié)構(gòu)的[C8MIM]Br對(duì)AA有良好的萃取能力，且其萃取原理為[C8MIM]Br能破壞目標(biāo)物分子間和分子內(nèi)的氫鍵并在目標(biāo)物的羥基質(zhì)子和IL陰離子之間形成新的氫鍵[22]。由于本實(shí)驗(yàn)需要從油樣品基質(zhì)中提取極性化合物，所以要求萃取劑IL兼溶于水和油，綜上，選擇[C8MIM]Br進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2.2 離子液體體積萃取溶劑的體積直接影響DLLME的萃取效率。本實(shí)驗(yàn)考察了[C8MIM]Br體積(60、90、120、150、180、210 μL)對(duì)萃取效果的影響。如圖2所示，在60～180 μL范圍內(nèi)，AA和5-HMF的萃取回收率分別增大至78.9%和68.9%，這是因?yàn)檩^多的IL可以有效吸收和轉(zhuǎn)移微波能量[17]，有利于萃取的傳質(zhì)過(guò)程；但當(dāng)萃取劑體積大于180 μL后，回收率開始降低，這是因?yàn)榉治鑫飶娜芤旱轿⒌蔚臄U(kuò)散速率與兩相之間的界面面積有關(guān)[23]，隨著萃取溶劑總體積增大，溶劑在樣品溶液中的擴(kuò)散性可能會(huì)變差，有些溶劑無(wú)法很好地分散到樣品溶液中，導(dǎo)致萃取回收率降低。另一方面，當(dāng)離子液體體積為180 μL時(shí)萃取達(dá)到平衡。根據(jù)以上結(jié)果，選擇180 μL [C8MIM]Br進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2.3 微波條件相比于常規(guī)DLLME方法，微波輔助可以促使IL和樣品充分混合均勻。由于微波能量會(huì)顯著影響目標(biāo)化合物與IL之間的分子相互作用，因此需要對(duì)微波功率、微波輔助萃取時(shí)間和溫度進(jìn)行優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)更好的萃取效果。微波功率太低，IL不能很好地分散到樣品溶液中，而微波功率過(guò)高則可能會(huì)導(dǎo)致分析物的降解。適當(dāng)?shù)靥岣咻腿囟葧?huì)降低IL的粘度，提高IL在油中的溶解性和分散性，從而有助于更好地形成乳濁液。隨著微波功率從200 W增加到300 W，萃取效率迅速增加，當(dāng)微波功率高于300 W時(shí)，萃取效率略有下降。因此，選擇300 W的微波功率。通過(guò)考察不同的微波輔助萃取時(shí)間發(fā)現(xiàn)，在2 ～12 min萃取時(shí)間內(nèi)，目標(biāo)分析物的回收率逐漸增加，當(dāng)萃取時(shí)間超過(guò)12 min后回收率降低。因此，選擇12 min為最佳萃取時(shí)間。

適當(dāng)?shù)母邷赜欣贗L的分散和萃取傳質(zhì)，通過(guò)考察不同溫度對(duì)萃取效果的影響發(fā)現(xiàn)，在25～70 ℃溫度范圍內(nèi)，萃取回收率隨著微波溫度的升高而快速增長(zhǎng)，回收率從31.0%增加至85.0%；繼續(xù)升溫后萃取回收率開始下降，可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高會(huì)導(dǎo)致樣品基質(zhì)發(fā)生變化，目標(biāo)物熱分解等。因此，選擇70 ℃為最佳萃取溫度。

2.2.4 樣品油體積在DLLME過(guò)程中，樣品體積是影響萃取效果最重要的研究參數(shù)之一。在控制加標(biāo)油濃度不變的條件下，考察了不同大豆油體積(0.5、1、2、3、4 mL)對(duì)萃取效果的影響，發(fā)現(xiàn)萃取回收率隨著油樣體積從0.5 mL 到2 mL逐漸增加，當(dāng)樣品體積為2 mL時(shí)，AA和5-HMF的萃取回收率分別為95.8%和89.6%；當(dāng)樣品體積大于2 mL后，隨著樣品體積的增長(zhǎng)，萃取回收率開始略微下降，這可能由于，一方面受樣品中復(fù)雜基質(zhì)的影響，另一方面，萃取已逐漸達(dá)到平衡，因此選擇2 mL為最佳樣品體積。

2.3 方法評(píng)估

通過(guò)在空白大豆油中加入不同濃度的混標(biāo)，制成一系列濃度梯度的加標(biāo)油，然后在優(yōu)化條件下以峰面積(y)對(duì)加標(biāo)油的質(zhì)量濃度(x，μg/mL)制作工作曲線。所建方法的工作曲線、檢出限、定量下限、相關(guān)系數(shù)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表1。兩種目標(biāo)物在線性范圍0.5～50 μg/mL內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r2≥0.997 1)，AA和5-HMF的檢出限(LOD，S/N=3)分別為0.11、0.70 μg/mL，定量下限(LOQ，S/N=10)分別為0.33、2.33 μg/mL。對(duì)樣品進(jìn)行5、10、 20 μg/mL 3個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平平行6次，兩種目標(biāo)物的日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均不大于4.3%，表明方法精密度良好，滿足分析測(cè)定要求。

表1 方法的線性回歸方程、檢出限、定量下限、相關(guān)系數(shù)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Linear equations,LODs,LOQs,correlation coefficients and relative standard deviations(RSDs) of the proposed method

2.4 方法對(duì)比

將本方法與近年報(bào)道的食品中AA和5-HMF的分析方法進(jìn)行了對(duì)比，見表2。與本方法類似的使用毛細(xì)管電泳檢測(cè)AA的3種方法[12,24-25]中，均或多或少地使用了有機(jī)溶劑(如正己烷、甲醇、乙腈)，且前處理包括研磨、液液萃取、脫脂除蛋白和旋蒸濃縮等復(fù)雜步驟，不僅前處理時(shí)間長(zhǎng)，而且液液萃取-毛細(xì)管電泳(LLE-CE)[12]和基質(zhì)固相分散-毛細(xì)管電泳(MSPD-CE)[25]兩方法的LOD分別大致高出本方法2倍和5倍；雖然同時(shí)測(cè)定蜂蜜和植物油中呋喃化合物的膠束電動(dòng)色譜法[7]的回收率較高，但其在液液萃取過(guò)程中也使用了正己烷。相比之下，本方法首次使用無(wú)分散劑微波輔助離子液體萃取食用油中AA和5-HMF，且使用了更環(huán)保的IL作為萃取劑，未使用有機(jī)溶劑,同時(shí)各種溶液和試劑的消耗更少，從而更綠色環(huán)保，大大降低了實(shí)驗(yàn)成本；本實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)物AA的分析速度比馮軍等[12]的快一倍，且更簡(jiǎn)單易操作，樣品前處理僅需30 min，兩個(gè)目標(biāo)物在12 min內(nèi)即可完全分離。

表2 本方法與其他方法的比較Table 2 Comparison of the proposed method with other methods

2.5 實(shí)際樣品分析

為評(píng)估本方法的實(shí)用性，在最佳條件下測(cè)試了4種商品食用香油、1種餐館自制花椒油、1種小吃攤煎炸老油、1份廢棄餐廚油粗制品共7個(gè)實(shí)際樣品中的AA和5-HMF。結(jié)果(表3)表明：在3個(gè)品牌芝麻香油和餐館自制花椒油中檢出5-HMF，質(zhì)量濃度分別為3.3、2.2、1.1、1.5 μg/mL，且是首次在花椒油中檢出5-HMF。其他油樣未檢出目標(biāo)分析物。通過(guò)測(cè)定3個(gè)濃度水平(5、10、20 μg/mL)的加標(biāo)大豆油，得到AA和5-HMF的加標(biāo)回收率分別為82.5%～96.2%和77.9%～95.9%，RSD分別為1.3%～5.2%和1.7%～4.9%。圖3為兩種實(shí)際樣品及其在10 μg/mL加標(biāo)水平下的電泳圖。

表3 兩種目標(biāo)物在實(shí)際樣品中的含量、加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 3 Concentrations，spiked recoveries and RSDs of the two analytes in the actual samples(n=3)

“N.D” :not detected or below limit of detection

圖3 兩種實(shí)際樣品及其加標(biāo)樣品電泳圖Fig.3 Electropherograms of two actual samples and spiked samplesA:arowana sesame oil；B:used frying old oil;Ⅰ:unspiked sample；Ⅱ:sample spiked with 10 μg/mL

3 結(jié) 論

本研究結(jié)合IL、無(wú)分散溶劑的DLLME、MA以及CE的優(yōu)勢(shì)，開發(fā)了一種無(wú)需分散劑的微波輔助離子液體分散液液微萃取結(jié)合膠束電動(dòng)色譜分析食用油中AA和5-HMF的方法。方法的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為77.9%～96.2% 和1.3%～5.2%，準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性良好，而且更簡(jiǎn)單、快速、高效、低成本和綠色環(huán)保。利用此方法在實(shí)際樣品芝麻香油和花椒油中檢出5-HMF，含量范圍為1.1～3.3 μg/mL，說(shuō)明本方法適用于食用油中AA和5-HMF的分析測(cè)定。本研究對(duì)于食用油質(zhì)量管控、食用油安全和營(yíng)養(yǎng)健康等有重要的實(shí)際意義。