臧穎超,朱慧敏,范夏瓊,張志敏,盧紅梅
(中南大學(xué) 化學(xué)化學(xué)工學(xué)院,湖南 長沙 410083)
法莫替丁(FMD)是第三代H2受體拮抗劑,對胃酸分泌有明顯的抑制作用,臨床上主要用于治療十二指腸潰瘍和上消化道出血[1]。目前,法莫替丁的檢測方法主要有高效液相色譜法[2-4]、氣相色譜法[5]、伏安法[6]和分光光度法[7]等,其中,色譜法需昂貴的儀器設(shè)備,且前處理復(fù)雜、費時,不能實現(xiàn)對大量樣本的快速檢測;而伏安法和分光光度法雖然前處理簡單,但其抗干擾能力較低。因此,有必要開發(fā)簡便、快速、靈敏的法莫替丁檢測方法。
表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)因具有無損、快速、高靈敏度和高選擇性等特點,廣泛應(yīng)用于藥物[8]、生物[9]、環(huán)境[10]和食品[11]等領(lǐng)域,其基底是影響SERS信號增強(qiáng)效果的一個重要因素。銀納米粒子(AgNPs)和金納米粒子(AuNPs)是常用的SERS基底。AgNPs具有較好的SERS活性,但不穩(wěn)定,易在空氣中被氧化。AuNPs雖具有良好的穩(wěn)定性,但增強(qiáng)效果比AgNPs弱。因此,探究同時具有高SERS活性和較好穩(wěn)定性的納米材料非常必要。由于金和銀具有晶格相匹配的特性,以金-銀核殼納米材料作為SERS的基底近年來受到關(guān)注[12]。與單獨的AuNPs或AgNPs相比,核殼Au@Ag納米粒子(Au@AgNPs)既保持了AgNPs良好的SERS活性,又具有AuNPs的穩(wěn)定性和均勻的形貌[13]。本文通過種子生長的方法合成Au@AgNPs,并將其作為表面增強(qiáng)拉曼光譜的基底用于檢測法莫替丁,為藥物檢測提供了快速、簡便的新方法。
UV-1800紫外可見吸收光譜儀(島津公司);S-4800場發(fā)射電子顯微鏡(SEM)(日立公司);透射JEM-1400 Plus電子顯微鏡(JEOL公司);Empyrean銳影X射線衍射儀(帕納科公司);i-Raman便攜式拉曼儀器(B & W Tek公司);原子型1810a摩爾超純水機(jī)(上海摩勒科學(xué)儀器有限公司)。
硝酸銀、氯金酸、檸檬酸三鈉和法莫替丁購自中國上海Sigma-Aldrich公司;抗壞血酸和羅丹明6G(R6G)購自上海泰坦科技有限公司;所用化學(xué)試劑均為分析純。實驗用水為自制超純水(18.2 MΩ·cm)。
圖1 Au@AgNPs的合成及對法莫替丁的檢測Fig.1 Synthesis of Au@AgNPs and its detection for famotidine
通過種子介導(dǎo)的方法合成了Au@AgNPs[14]。AuNPs種子的合成:將125 μL(0.1 mol/L)的HAuCl4稀釋至50 mL水中,加熱至沸騰,攪拌并快速加入750 μL(1%)檸檬酸三鈉溶液,繼續(xù)加熱攪拌30 min,獲得金種子溶液。Au@AgNPs的制備:取3 mL AuNPs作為種子溶液,加入450 μL抗壞血酸溶液(0.1 mol/L),邊攪拌邊逐滴加入1.35 mL AgNO3溶液(10 mmol/L)。在此過程中,可觀察到溶液的顏色由酒紅色變?yōu)槌壬?,表明金核的外層已成功地生長了一層銀。Au@AgNPs的合成及對法莫替丁的檢測見圖1。
標(biāo)準(zhǔn)溶液:取一定量法莫替丁標(biāo)準(zhǔn)品用水配成濃度為1×10-2mol/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,再逐級稀釋為1×10-7~1×10-4mol/L系列濃度的法莫替丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。
血漿樣品:先用水稀釋血漿以減少基質(zhì)效應(yīng)的干擾,然后向稀釋后的血漿中加入不同濃度的法莫替丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,配成不同濃度的法莫替丁(0.45~250 μmol/L)血漿樣本。
將100 μL法莫替丁標(biāo)準(zhǔn)溶液與100 μL的Au@AgNPs溶液混合,取一定量混合液滴于硅膠板上,調(diào)節(jié)合適的激光和待測樣表面距離以得到理想的光譜。光譜采集參數(shù):激光波長785 nm,積分時間為30 s,物鏡倍數(shù)20倍,光譜采集范圍為200~4 000 cm-1。
圖2 金種子(紅線)和金核銀殼納米粒子(黑色)的紫外可見吸收光譜Fig.2 UV-Vis spectra of Au seeds(red line) and core-shell Au@Ag nanoparticles(black line)
由AuNPs和Au@AgNPs的紫外可見吸收光譜圖可見,AuNPs在525 nm處具有很強(qiáng)的吸收峰(圖2)。當(dāng)Ag在Au核上形成Ag殼,得到Au@AgNPs后,金核的吸收峰藍(lán)移至480 nm,并在390 nm處出現(xiàn)了一個銀殼的吸收峰。這是由于Ag和Au具有不同的等離子體共振頻率,兩者間發(fā)生了重疊和耦合。
采用SEM和TEM對合成的Au種子和Au@AgNPs的形貌進(jìn)行了分析(圖3),由圖3(A,B,D,E)可見,AuNPs和Au@AgNPs主要是以球形均勻分布。通過粒徑軟件分析表明Au種子的平均粒徑為27.94 nm(圖3C),金核表面沉積的銀殼平均厚度為8.08 nm(圖3F)。
AuNPs和Au@AgNPs的XRD譜圖見圖4A,圖中38.2°、44.3°、64.5°、77.5°和82.5°分別對應(yīng)于面心立方的(111)、(200)、(220)、(311)和(222)[15]。由于金和銀的晶格常數(shù)相似[16],因此峰的位置相同,很難通過衍射峰的位置比較AuNPs和Au@AgNPs,但可看出Au@AgNPs的峰更強(qiáng)。經(jīng)高分辨率TEM分析可得Au@AgNPs的兩個相鄰晶格的晶面間距為0.234 nm(圖4C),接近Ag的(111)平面晶格,且Ag納米晶體主要沿(111)方向生長[15]。
圖3 AuNPs(A、B、C)和Au@AgNPs(D、E、F)的掃描電鏡、透射電鏡、粒徑統(tǒng)計Fig.3 SEM,TEM and statistical histogram of particle size of AuNPs(A,B,C) and Au@AgNPs(D,E,F)
圖4 AuNPs和Au@AgNPs的XRD及TEM圖Fig.4 XRD and TEM of AuNPs and Au@AgNPsA:XRD of AuNPs and Au@AgNPs;B:TEM diffraction spot of Au@AgNPs;C:high-resolution TEM image taken from the Ag shell area of core-shell Au@AgNPs
圖5 Au@AgNPs(A)和法莫替丁粉末(B)的拉曼光譜及法莫替丁吸附在Au@AgNPs上的SERS光譜(C)Fig.5 Raman spectra of core-shell Au@AgNPs(A) and FMD powder(B),SERS spectrum of FMD adsorbed on the Au@AgNPs substrate(C)
法莫替丁、Au@AgNPs的拉曼光譜以及SRES光譜如圖5所示,其特征峰的歸屬見表1。從圖中可見,法莫替丁的拉曼特征峰主要位于547、685、739、972、1 009、1 122、1 241、1 333、1 435、1 540 cm-1處,與已有文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致[17]。但由于分子和基底之間的取向和作用力的不同,可看到一些峰發(fā)生紅移或藍(lán)移[18]。法莫替丁的主要特征峰歸屬于CN的平面彎曲振動(549 cm-1)、CH2的扭轉(zhuǎn)振動(1 134 cm-1)、CS的拉伸振動和平面振動(1 325 cm-1)、CN的拉伸振動和NH2的形變振動(1 540 cm-1)。法莫替丁分子與Ag殼通過Ag-N鍵之間的相互作用吸附在Ag殼的表面。在入射光激發(fā)下,Au@AgNPs表現(xiàn)出強(qiáng)烈的表面等離子體共振特性,具有很強(qiáng)的局域電場,使得處于該電場中的法莫替丁分子的信號被增強(qiáng)。與常規(guī)的拉曼光譜相比,SERS光譜中1 540 cm-1處的峰信號增強(qiáng)顯著,且受到的干擾小,因此選其為特征峰用于后續(xù)分析。
增強(qiáng)因子(EF)是評價基底的SERS性能的重要因素之一,為了測試Au@AgNPs作為基底的增強(qiáng)性能,以R6G為探針分子,根據(jù)公式[18]計算增強(qiáng)因子:EF=(ISERS×CRaman)/(IRaman×CSERS),式中IRaman和ISERS分別為1 363 cm-1處增強(qiáng)前、后的拉曼強(qiáng)度,CRaman和CSERS為增強(qiáng)前、后R6G的濃度,計算得EF為6.66×105,由此可見,Au@AgNPs有較高的EF值,具有檢測較低濃度法莫替丁的潛力。
表1 法莫替丁的拉曼光譜和SERS光譜中主要特征峰的歸屬Table 1 Band assignment of major peaks in the normal Raman spectrum and SERS spectrum of FMD
-:no data
圖6 不同濃度法莫替丁的SERS光譜Fig.6 SERS spectra of FMD with different concentrations
以Au@AgNPs為基底,檢測了不同濃度(0、0.4、0.5、1.0、2.5、5.0、10、25、50、100 μmol/L)的法莫替丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,由其SERS光譜圖可知,隨著法莫替丁濃度的降低,1 540 cm-1處特征峰的強(qiáng)度也隨之降低(圖6),當(dāng)濃度低至0.4 μmol/L時,仍可看到明顯的特征峰。由于法莫替丁中不同的官能團(tuán)在基底表面的吸附和取向不同,隨著法莫替丁濃度的降低,不同特征峰的強(qiáng)弱變化不同。法莫替丁濃度的對數(shù)(x)在0.5~50 μmol/L范圍內(nèi)和1 540 cm-1處峰強(qiáng)度的對數(shù)(y)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性方程為y=4.720 5x+0.249 1,相關(guān)系數(shù)(r2)為0.978,以公式LOD=3Sb/b[19]計算檢出限(LOD),其中Sb為特征峰1 540 cm-1處空白樣SERS強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差,b為建立的校準(zhǔn)曲線的斜率,計算得到LOD為4.18×10-8mol/L。
為評估本方法在實際樣本中的可行性,將法莫替丁溶液加入稀釋的血漿樣品中,然后與Au@AgNPs混合,考察了稀釋血漿中不同濃度(0、0.45、2.5、4.5、25、45、250 μmol/L)法莫替丁的SERS光譜。結(jié)果顯示,空白血漿光譜中無組分干擾法莫替丁的識別,稀釋血漿中法莫替丁的SERS光譜強(qiáng)度(1 540 cm-1)隨其濃度的降低逐漸減弱,峰強(qiáng)度的對數(shù)(y)與對應(yīng)濃度的對數(shù)(x)在0.45~250 μmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,線性方程為y=4.331 8x+0.218 8,r2=0.975,計算得LOD(3Sb/b)為1.11×10-7mol/L。由此可見,制備的Au@AgNPs可用于血漿中法莫替丁的快速檢測。
向血漿中加入一定量法莫替丁考察方法的準(zhǔn)確性,加標(biāo)濃度為2.5、25、250 μmol/L,每個濃度平行實驗3次,在優(yōu)化條件下測定。計算得3個加標(biāo)濃度下法莫替丁的回收率為91.6%~122%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為6.6%~12%,方法準(zhǔn)確可靠,可滿足血漿中法莫替丁的測定要求。
SERS信號的重現(xiàn)性是評價基底性能和SERS方法實際應(yīng)用的一個因素,實驗隨機(jī)檢測了12批次法莫替丁,計算得其在1 540 cm-1處強(qiáng)度的RSD為9.5%,表明Au@AgNPs作為SERS基底檢測法莫替丁具有良好的重現(xiàn)性[15],可用于實際樣品檢測。
本文建立了以Au@AgNPs為SERS基底的快速靈敏檢測法莫替丁的方法。結(jié)果表明,以Au@AgNPs檢測法莫替丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,方法在0.5~50 μmol/L范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系,r2為0.978,LOD為4.18×10-8mol/L。使用Au@AgNPs對稀釋血漿中的法莫替丁進(jìn)行SERS檢測,線性范圍為0.45~250 μmol/L,r2為 0.975,LOD為1.11×10-7mol/L,加標(biāo)回收率為91.6%~122%。所建立的方法可用于生物樣品中法莫替丁的快速靈敏檢測。