李媛媛 劉 曄 柳麗娜 趙 爽 陳素梅 房偉民 陳發(fā)棣 管志勇

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部景觀設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095)

菊花(Chrysanthemum morifoliumRamat.)為菊科菊屬宿根性草本植物，是中國十大名花之一，其栽培歷史悠久，除用于觀賞外，還有藥用、飲用、食用等多種價(jià)值。 菊花茶氣味芳香，消暑生津，利血脈，除濕痹，養(yǎng)肝明目[1-3]。 長期飲用菊花茶能調(diào)節(jié)心肌功能，降低膽固醇[4]。 近年來，隨著生活水平的不斷提高，人們對茶用菊的需求量日益增加。

枯萎病是由尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)引起的一種土傳性病害[5-8]，而茶用菊枯萎病常造成植株死亡，嚴(yán)重影響茶用菊安全生產(chǎn)，是茶用菊生產(chǎn)的主要限制因子之一[9-13]。 尖孢鐮刀菌從根部入侵[8-12]，造成植株生長緩慢，葉片黃化、脫落，莖部維管束變褐腐爛，植株矮化，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植株死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[14]。 茶用菊常連作栽培，枯萎病更易頻發(fā)，嚴(yán)重影響了茶用菊的產(chǎn)量與品質(zhì)。 目前，在菊花枯萎病防治中，主要措施是輪作換茬、采用抗性砧木嫁接[15-16]。 但嫁接存在費(fèi)工、費(fèi)時(shí)育苗效率不高的問題，在生產(chǎn)上大面積推廣尚有難度；輪作換茬防治茶用菊的枯萎病效果明顯，但限制了茬口的安排，兩者在生產(chǎn)推廣使用中存在一定局限性[17-20]。 種質(zhì)資源作為育種的基礎(chǔ)，其抗病性往往能影響育成品種的抗病水平[21]。優(yōu)異抗病茶用菊種質(zhì)資源的發(fā)掘?qū)ν苿硬栌镁栈ǚN質(zhì)資源創(chuàng)新和新品種選育具有重要意義。 廣泛收集種質(zhì)資源并進(jìn)行抗病性鑒定是抗病遺傳育種工作的重要內(nèi)容，采用科學(xué)合理的鑒定方法是先決條件[22]。 開展茶用菊資源品種的抗病性評價(jià)，從而篩選出抗病資源用于抗病育種，可極大提高育種效率。 因此，本研究主要通過采集發(fā)病茶用菊，在枯萎病病原菌分離、鑒定和致病力研究的基礎(chǔ)上，開展茶用菊資源苗期枯萎病人工接種鑒定，旨在篩選出優(yōu)良的枯萎病抗性品種，同時(shí)為茶用菊枯萎病抗性基因的挖掘與利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

31 個(gè)茶用菊品種由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中國菊花種質(zhì)資源保存中心提供；病株采自湖北省麻城市福田河鎮(zhèn)福白菊生產(chǎn)田。 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)與馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基(potato dextrose water，PDW)培養(yǎng)基均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離、純化和保存 采用組織塊分離法分離病原菌，即取病株莖基部的病健交界處，先用自來水沖洗干凈，再將其分解成小的組織塊，用流水沖洗15 min，隨后用70%酒精表面消毒30 s，再用15%H2O2消毒15 min，反復(fù)3 次，再用無菌水沖洗4 次，并用滅菌濾紙吸干水分，接種在固體PDA 培養(yǎng)基上[23]。25℃暗培養(yǎng)4 d，從培養(yǎng)基上長菌植物材料周圍，挑選單個(gè)菌落邊緣轉(zhuǎn)接到新的PDA 培養(yǎng)基上3 次，單孢菌株培養(yǎng)至純化。 保存時(shí)，沿菌落邊緣打直徑約5 mm的菌塊3 塊，置于裝有30%甘油的2 mL 離心管中，保存于-80℃冰箱中備用[24]。

1.2.2 病原菌鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定:將分離得到的菌株接種在PDA 培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落形狀、顏色、大小等形態(tài)特征，并觀察菌絲和分生孢子的顯微形態(tài)特征。

分子生物學(xué)鑒定:應(yīng)用真菌18S rDNA/ITS 進(jìn)行鑒定。 采用真菌DNA 提取試劑盒(Fungal DNA Kit，OMEGA，Bio-Teck，美國)提取真菌的基因組DNA。采用ITS1-F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′引物對病原菌的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 產(chǎn)物通過20 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠、純化后，由思普金生物公司進(jìn)行測序。 采用NCBI-BLAST 進(jìn)行序列比對，采用Mega 5.05 軟件利用Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 病原菌致病力鑒定

1.2.3.1 病原菌孢子懸浮液的制備 將保存的尖孢鐮刀菌菌株在PDA 平板上活化，25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)5～10 d，再轉(zhuǎn)至PDW 液體培養(yǎng)基中，于180 r·min-1、25℃振蕩培養(yǎng)3 d。 將培養(yǎng)好的菌液用無菌雙層紗布過濾，用16×25 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并將孢子懸浮液濃度調(diào)至成1×106個(gè)·mL-1的孢子濃度懸浮液備用。

1.2.3.2 病原菌致病性鑒定 應(yīng)用1.2.3.1 中制備的孢子懸浮液對福白菊進(jìn)行苗期人工接種，以不接種植株為對照，試驗(yàn)各處理重復(fù)3 次，通過統(tǒng)計(jì)病株，計(jì)算發(fā)病率以及病情指數(shù)。

取生長狀態(tài)一致的福白菊插穗，扦插于穴盤(長12 cm、寬6 cm)中，待其生根后，移栽至營養(yǎng)缽中，缽內(nèi)基質(zhì)為草炭和珍珠巖(質(zhì)量比為3 ∶1)，培養(yǎng)5 d 后，即為供試福白菊幼苗。 選取健壯且長勢一致的福白菊幼苗，將幼苗隨機(jī)分成3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 株，以不接種植株為對照。 接種植株在進(jìn)行傷根處理后采取灌根法接種植株，每株幼苗每克土定量灌注1×106個(gè)·mL-1孢子濃度的懸浮液1 mL。 接種當(dāng)天不澆水，第2 天開始正常的栽培管理。

病情調(diào)查與統(tǒng)計(jì):接種后第7、第14、第21、第28、第35 天調(diào)查發(fā)病率與病情指數(shù)。 枯萎病病情分級標(biāo)準(zhǔn)、抗病類型分別見表1 和表2[21，25-26]。 病情指數(shù)(disease severity index，DSI)計(jì)算公式如下:

DSI=[∑(每級病株數(shù)×相應(yīng)級數(shù))×100/(調(diào)查總株數(shù)×最高病級)]。

表1 接種尖孢鐮刀菌病菌后病情的分級標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The grading standards of disease severity after inoculation with F. oxysporum

表2 病情指數(shù)的抗病評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The equivalence of disease severity index

1.2.4 不同茶用菊材料的抗性鑒定 根據(jù)1.2.3 中的試驗(yàn)結(jié)果，篩選出致病力較強(qiáng)的一株菌株，對31 個(gè)茶用菊品種進(jìn)行苗期人工接種鑒定，接種后35 d 統(tǒng)計(jì)并計(jì)算發(fā)病率與病情指數(shù)。 人工接種方法，病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)與計(jì)算方法同1.2.3.2。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 利用Microsoft Office Excel 2003、SPSS 20.0 以及Mega 5.05 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離及鑒定

從福白菊病株分離純化得到2 個(gè)病原菌菌株，分別命名為M15 和M16。 2 個(gè)菌株在PDA 培養(yǎng)基上的菌落均為圓形，菌落呈淺粉色至粉色，菌絲呈絨毛狀(圖1)。 菌株M15 背面顏色較淺，且正面有白色絮狀突起(圖1-A、B)；菌株M16 背面顏色較深，正面無白色絮狀(圖1-C、D)。 分生小孢子呈卵形、橢圓形或腎形；分生大孢子呈鐮刀形，略彎曲(圖2)。 根據(jù)上述結(jié)果，初步判斷 2 個(gè)菌株均為尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)，但屬不同的生理小種。

為了進(jìn)一步確定菌株種類和分類學(xué)地位，提取菌株的基因組DNA，應(yīng)用真菌18S rDNA/ITS 對2 個(gè)菌株進(jìn)行片段擴(kuò)增以及測序。 測序結(jié)果與NCBI 核苷酸序列比對，該菌株與尖孢鐮刀菌相似度達(dá)99%以上，且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一支(圖3)，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征，確定該菌株為尖孢鐮刀菌。

圖1 分離的尖孢鐮刀菌株的菌絲體形態(tài)Fig.1 Mycelium of isolated F. oxysporum

圖2 尖孢鐮刀菌孢子形態(tài)Fig.2 Spore morphology of F. oxysporum

圖3 基于ITS 基因序列菌株M15 與M16 的Neighbor-joining 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree of M15 and M16 based on ITS gene sequence

2.2 病原菌致病力鑒定

在福白菊幼苗上人工接種2 個(gè)菌株鑒定其致病力。由表3 可知，福白菊在接種2 種菌株后14 d 時(shí)開始發(fā)病。 接種菌株M15 的福白菊在14 d 時(shí)，發(fā)病率為100%，而接種菌株M16 的發(fā)病率只有33.33%；接種菌株M15 的福白菊在28 d 時(shí)的病情指數(shù)為56.67，比接種菌株M16 的福白菊的病情指數(shù)高25。

表3 不同尖孢鐮刀菌致病力鑒定Table 3 The pathogenicity evaluation of different F. oxysporum

由圖4 可知，福白菊在接種菌株M15 14 d 時(shí)，基部葉片已經(jīng)變黃，而接種菌株M16 14 d 時(shí)無明顯發(fā)病癥狀。 因此認(rèn)為菌株M15 和M16 均為引起茶用菊枯萎病的致病菌株。 綜合上述致病力的檢測結(jié)果可知，菌株M15 的致病力較菌株M16 強(qiáng)。 根據(jù)科赫氏法則，將接種菌株M15 和M16 的發(fā)病植株重新分離病原菌，再次獲得與原分離菌一致的菌株M15 和M16。

圖4 接種病原菌后植株生長情況Fig.4 The growth of plants were inoculated with F. oxysporum

2.3 不同茶用菊品種抗病性鑒定

應(yīng)用致病力檢測中篩出的強(qiáng)致病尖孢鐮刀菌菌株M15 對31 個(gè)茶用菊品種進(jìn)行苗期人工接種鑒定，結(jié)果顯示(表4)，31 個(gè)茶用菊品種中有1 份高抗材料，即七月白(圖5-A、B)，病情指數(shù)為8.34；9 份抗病材料，包括休寧藥菊、射陽大白菊等；17 份中抗材料，包括蘇菊13 號、九月菊等；3 份感病材料，包括福白菊、蘇菊6 號和小黃菊；1 份高感材料，即皇菊(圖5-C、D)，病情指數(shù)為73.34(表4)。 對2 次鑒定試驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析，2 次試驗(yàn)顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.860(表5)。

3 討論

3.1 引起茶用菊枯萎病病原菌的分離及鑒定

田間土壤、發(fā)病植株中同時(shí)存在多種病原，分離病原菌并確定致病病原菌，是抗病鑒定的關(guān)鍵[27-28]。18S rDNA/ITS 具有序列片段小等優(yōu)點(diǎn)，能夠反映出屬間以及差異菌株間堿基對的差異，并且可以從相對較小的序列中獲得足夠的遺傳信息[29]，廣泛應(yīng)用于真菌的屬種間及部分種內(nèi)組群水平的系統(tǒng)學(xué)研究[30-32]。本研究首次從連作多年的福白菊生產(chǎn)田群體發(fā)病的病株上分離病原菌，根據(jù)科赫氏法則，運(yùn)用形態(tài)學(xué)與18S rDNA/ITS 分子生物學(xué)的鑒定，綜合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，2 個(gè)致病菌株被鑒定為尖孢鐮刀菌。 表明引起福白菊枯萎病的主要致病菌為尖孢鐮刀菌，小種類型有待確定。

表4 茶用菊資源枯萎病抗性鑒定Table 4 Identification results on resistance to F.oxysporum M15 in Chrysanthemum for tea resources

表5 2 次試驗(yàn)相關(guān)性Table 5 Correlation between the two experiments

3.2 茶用菊枯萎病抗性評價(jià)體系的建立

種質(zhì)資源的抗性篩選是抗性育種的基礎(chǔ)，抗病性研究應(yīng)基于可靠的抗性鑒定[33]。 在抗病品種改良的全過程中，育種親本的選配、后代群體與新品種(品系)抗性表現(xiàn)的評判都依賴抗性鑒定[34-35]。 抗病鑒定評價(jià)的工作量大、可靠性要求高，建立高效的抗病鑒定評價(jià)體系具有重要意義[36]。 對本試驗(yàn)分離到的2 個(gè)菌株的枯萎病致病力進(jìn)行鑒定后發(fā)現(xiàn)，M15 的致病力較M16 強(qiáng)，且由于在系統(tǒng)發(fā)育樹中沒有聚在一枝，推測2 個(gè)菌株屬于尖孢鐮刀菌的不同生理小種。 病原菌菌株致病力的強(qiáng)弱決定了致病力的效率[37-38]。 本研究采用致病力更強(qiáng)的菌株M15 進(jìn)行人工接種，病情發(fā)展相對適中，鑒定效率高。 田間自然調(diào)查鑒定由于受氣候環(huán)境等因素的制約，發(fā)病具有不確定性，需要多年、多點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)合鑒定，并采取一些栽培調(diào)控措施[22，39-40]。 應(yīng)用苗期接種病原菌鑒定植株病害抗性，周期短，速度快，可節(jié)省人力物力，能快速獲得種質(zhì)的抗性信息。

圖5 接種0、35 d 時(shí)高抗品種七月白與高感品種皇菊的生長情況Fig.5 Highly resistance Qiyuebai and highly susceptible Huangju at 0，35 days post inoculation

許高娟[41]通過離體接種與苗期接種鑒定了33 份菊花近緣種屬植物苗的抗黑斑病抗性；王順利等[42]通過田間調(diào)查結(jié)合人工接種鑒定了47 個(gè)中國傳統(tǒng)菊花品種的白銹病抗性；趙銀平[21]通過田間調(diào)查結(jié)合苗期人工接種鑒定對32 份西瓜種質(zhì)資源進(jìn)行枯萎病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)大田鑒定與苗期人工接種鑒定結(jié)果無顯著差異。 本研究利用建立的茶用菊苗期枯萎病抗性評價(jià)體系，對31 份茶用菊種質(zhì)資源進(jìn)行了2 次枯萎病抗性評價(jià)試驗(yàn)，2 次試驗(yàn)結(jié)果顯著相關(guān)，說明本研究建立的茶用菊品種抗枯萎病的鑒定方法可用于茶用菊枯萎病抗性鑒定。 該方法鑒定周期短，有助于育種工作者快速了解育種材料的抗感性，提高育種工作效率。

3.3 茶用菊枯萎病抗性材料的篩選

品種改良依賴于可靠、客觀的鑒定結(jié)果[33]。 相對于針對個(gè)別資源零星與分散的鑒定，在同一時(shí)間、同一條件下批量進(jìn)行資源抗性鑒定，其結(jié)果更具有可比性，具有篩選優(yōu)異種質(zhì)的實(shí)際意義[43-44]。 目前，針對園藝作物種質(zhì)資源的枯萎病抗性鑒定方面多有報(bào)道[45-48]，并且開展了抗病機(jī)制方面的研究[49-55]。 張慧琴等[56]通過從發(fā)病獼猴桃枝條上分離與鑒定致病菌株，并接種病原菌鑒定了18 份種質(zhì)材料的抗性，最終獲得了2份高抗?jié)儾〉姆N質(zhì)材料；楊宇紅等[45]采用苗期抗性鑒定技術(shù)，從108 份不同來源甘藍(lán)資源中篩選出40 余份抗枯萎病材料。 茶用菊、藥用菊等功能性菊花產(chǎn)業(yè)規(guī)模、栽培面積遠(yuǎn)超觀賞菊。 但有關(guān)其抗病鑒定方面的研究很少，有關(guān)抗枯萎病方面的研究更是鮮見報(bào)道。篩選優(yōu)異抗性資源是抗病育種的基礎(chǔ)工作，因此選育枯萎病高抗品種并推廣是解決茶用菊枯萎病的根本辦法。

4 結(jié)論

本研究從福白菊發(fā)病植株中分離出致病菌株尖孢鐮刀菌，在病原菌鑒定和篩選的基礎(chǔ)上，對31 個(gè)茶用菊品種進(jìn)行了苗期人工接種鑒定。 篩選得到了1 份高抗品種，9 份抗病品種，17 份中抗品種，3 份感病品種以及1 份高感品種，品種群體表現(xiàn)出多層次的抗性水平，為茶用菊抗病性鑒定提供了借鑒。 篩選出的抗性品種，可應(yīng)用于抗病基因的挖掘，或作為潛在的親本用于抗病品種改良。 本研究為茶用菊的抗病機(jī)理研究和抗枯萎病新品種選育奠定了基礎(chǔ)。