溫 波 王亞蘭 何麗麗 張 峰 Yaowapa Boon-Ek 柳士勇

(1安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，安徽 合肥 230036；2安徽省六安市果樹研究所，安徽 六安 237000)

桃[Prunuspersica(L.) Batsch]果實味道甜美，且富含維生素和抗氧化性物質(zhì)，深受廣大消費者的喜愛[1]。 根據(jù)成熟過程中不同的果實質(zhì)地變化，桃主要分為硬質(zhì)型桃和溶質(zhì)型桃兩大類[2-3]。 溶質(zhì)型桃在成熟過程中一般會釋放大量的乙烯，導(dǎo)致桃果實在短時間內(nèi)快速軟化；而硬質(zhì)型桃在成熟過程中呼吸躍變不明顯，乙烯釋放量很少，果實軟化緩慢[4-6]。 細胞壁的降解是導(dǎo)致果實軟化的主要原因[7]。 細胞壁中的果膠是維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要物質(zhì)之一，隨著果膠的降解，細胞壁開始解離，果實發(fā)生軟化[2，8]。 植物細胞壁中的果膠根據(jù)其結(jié)構(gòu)可以分為同型半乳糖醛酸聚糖(homogalacturonan，HG)、鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ(rlaamngalacturonanⅠ，RGI)和鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅱ(rhamngalacturonanⅡ，RGⅡ)等。 不同果膠鏈之間相互連接，形成了復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 細胞壁中果膠的降解也是由多種結(jié)構(gòu)酶共同作用的結(jié)果。 如果膠甲酯酶(pectin methylesterase，PME)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalactusidase，PG)、果膠裂解酶(pectate lyase，PL)、β 半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-Gal)等共同作用的結(jié)果。 前期研究表明，內(nèi)多糖半乳糖醛酸酶(Endo-PG)在硬質(zhì)型桃中低表達且在整個軟化過程中表達恒定，而在溶質(zhì)型桃中軟化前表達較低，隨著軟化進程的推進，表達量顯著升高[5]。 進一步研究發(fā)現(xiàn)，Endo-PG 蛋白可以被定位到桃果實細胞中層，其表達與細胞之間黏著力的失去相關(guān)[6]。 綜上表明endo-PG表達與桃果實的軟化高度相關(guān)。

PL 又稱果膠酸裂解酶，其可以通過β-消除方式隨機斷裂多聚半乳糖醛酸鏈上的β-1，4 糖苷鍵，產(chǎn)生含不飽和C4-C5 鍵的寡聚半乳糖醛酸，從而降解果膠[9-10]。 PL 作為多基因家族在植物中廣泛存在，在已完成基因組測序的植物，如番茄[11]、擬南芥[12]、菁蕪菁[13]、楊樹[14]中都鑒定出了多個PL基因。 關(guān)于PL與果實成熟與軟化的關(guān)系，前人已經(jīng)進行了一系列的研究。 Dominguez-Puigjane 等[15]從香蕉果實cDNA 文庫中克隆了一個果膠裂解酶基因Ban17。 Northern 分析表明，Ban17 在呼吸躍變早期的果實中開始表達，在躍變峰處達到最大值，隨后在過熟期表達下降；外源乙烯可以顯著誘導(dǎo)該基因mRNA 的積累，推斷Ban17 可能在果實成熟軟化過程中發(fā)揮作用。 草莓果實中利用反義基因沉默PL基因后，果膠的溶解性降低，果實的硬度顯著提高[16-17]。 在番茄中沉默表達果膠裂解酶基因SLPL降低了水溶性果膠的含量，顯著提高了果實的硬度，延長了果實的貯藏期[11]。 研究還發(fā)現(xiàn)，PL可能通過降解三細胞連接處和中間層中的交聯(lián)果膠聚合物，使細胞壁中的果膠多糖能夠被PG 等酶降解，從而導(dǎo)致果實快速軟化[11，18]。 這些證據(jù)都表明，PL 是導(dǎo)致果實軟化的原因之一。 但有關(guān)PL 在桃果實軟化中的作用鮮有報道。 本研究擬對桃PL 基因家族進行生物信息學(xué)分析，探究該家族基因的序列特征及遺傳進化關(guān)系，并鑒定在溶質(zhì)型桃和硬質(zhì)型桃果實之間差異表達的基因，以期為進一步研究PL在桃果實成熟軟化過程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及前處理

溶質(zhì)型桃品種黃金蜜3 號(Gold honey 3)和硬質(zhì)型桃品種有名(Yu myeong)，采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所桃育種圃。 采集時間為第2 次膨大期(S3)和生理成熟期(S4Ⅰ、S4Ⅱ、S4Ⅲ)共4 個時期，分別為花后110、115、122 和127 d。 各時間點對應(yīng)的果實硬度和乙烯釋放量測定方法參照Pan 等[19]的報道。

溶質(zhì)型桃品種湖景蜜露(Hujing Milu)和硬溶質(zhì)型桃夏之夢(Xia Zhimeng)，合肥市桃蹊水果農(nóng)場。 于果實成熟期采摘大小一致、無病蟲害的果實，采摘后立即運回實驗室，剔除機械損傷的材料并用冷水清洗表面灰塵和田間微生物，再用0.02%NaClO 浸泡2 min。 常溫(25±2℃)放置于實驗室工作臺，每隔1 d 測量硬度指標并收集樣品，所有樣品用液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。

1.2 桃PpPL 家族成員的序列分析和進化樹的構(gòu)建

利用 phytozome 基因組數(shù)據(jù)庫(http:/ /www.phytozome.net/search.php)，選擇Prunuspersica v2.1 檢索，以番茄PL 蛋白序列為模板[18]，BLAST 獲得桃基因組[20]已注釋的PpPL 蛋白序列，并記錄氨基酸長度和染色體位置；PL 蛋白的分子量(molecular weight，MW)和等電點(isoelectric point，pI) 采用ExPASY Compute pI/MW 在線程序[21](http:/ /web.expasy.org/protparam)進行分析；利用GSDS 2.0[22](http:/ /gsds.cbi.pku.edu.cn/)對基因結(jié)構(gòu)進行分析；采用DNAMAN 8.0 對桃蛋白家族及其他物種蛋白序列進行比對；使用MEGA 7.0[23]軟件，采用Neighbor-Joining 法[24]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其他參數(shù)為系統(tǒng)默認值。 以擬南芥[12]、番茄[11]和香蕉(NCBI 登錄號:CAA63496)[15]作為參比序列。

1.3 桃PpPL 基因在不同溶質(zhì)型桃果實中的表達分析

通過分析Pan 等[19]RNA-seq 數(shù)據(jù)來研究PL 家族基因在不同溶質(zhì)型桃果實中的表達差異。 基因的量化以RPKM (reads per kilobase of exon model per million mapped read) 表示。 使用HemI 1.0 軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行層次聚類分析，并繪制熱圖。

1.4 熒光定量PCR(q-PCR)檢測

桃果實組織總RNA 提取采用植物RNA 快速提取試劑盒CW2598(康為世紀生物科技有限公司，合肥)的方法。 采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(NO. 6110A)(TaKaRa，日本)獲得cDNA 第一鏈，并以此為模板，使用CFX96 熒光定量儀(Bio-Rad，美國)進行q-PCR 檢測。 采用SYBR Premix EX Taq(NO.RR820A)試劑盒(TaKaRa，日本)進行擴增，反應(yīng)總體積為10 μL，包含SYBR Premix Ex Taq 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。 反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。 每個樣品3 次重復(fù)，采用Primer Premier 5.0 設(shè)計特異性引物(表1)，引物由合肥通用生物技術(shù)公司合成。 選取Actin(Prupe.1G510100)作為內(nèi)參基因[25]，采用2-△△Ct法計算基因相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃PpPL 基因家族的全基因組鑒定

通過搜索Phytozome 桃基因組數(shù)據(jù)庫共篩選出30個PpPL基因。 剔除8 個重疊基因，2 個不含任何桃PpPL Pec-Lyase-C/Pec-Lyase-N 結(jié)構(gòu)域的基因，最終鑒定出20 個桃PpPL基因(表2)。 20 個PpPL分別分布于8 條染色體上:1 號染色體包含8 個PpPL基因位點；第2、第3 和第4 號染色體上各含2 個；第5 號染色體含有3 個；第6、第7 和第8 號染色體上各含有1 個。20 個PpPL基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)在244～531 aa范圍內(nèi)；分子量介于27 442.44 ～53 577.29 Da 之間，等電點為6.00 ～9.82。 DNAMAN 8.0 比對發(fā)現(xiàn)，所有的PpPL 蛋白都含有Pec-Lyase-C 結(jié)構(gòu)域，但只有PpPL7、PpPL8、PpPL12、PpPL17 包含Pec-Lyase-N 結(jié)構(gòu)域(圖1)。

表1 實時定量PCR 引物Table 1 Quantitative real-time PCR primers

表2 桃基因組中PpPL 蛋白家族的特征Table 2 Characteristics of PpPL proteins family in peach genome

2.2 桃PpPL 基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和基因結(jié)構(gòu)分析

利用MEGA 7.0 軟件對20 個桃PpPL基因構(gòu)建進化樹(圖2)，聚類分析發(fā)現(xiàn)桃PpPL基因可以分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ共5 個亞家族，每個亞家族分別含有7、4、2、5 和2 個PL基因。 基因結(jié)構(gòu)分析表明，各個基因所含有的內(nèi)含子數(shù)從1 到6 不等，桃PpPL基因在Ⅰ亞族都含有7 或4 個外顯子，Ⅱ亞族都含4 個外顯子，Ⅲ和Ⅳ亞族基因缺失了起始的上游序列，含有4 或5 個外顯子，Ⅴ亞族都含有5 個外顯子。

2.3 桃PpPL 基因家族的親緣關(guān)系分析

對桃(20 個)和擬南芥(26 個)、番茄(22 個)、香蕉(1 個)PL 蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖3)，發(fā)現(xiàn)這4 個物種的69 個PL基因可以分為5 個亞家族，分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。 第Ⅰ和第Ⅱ亞族都含有12個PL 蛋白，第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組分別含有9、16、20 個PL 蛋白。 其中，與軟化相關(guān)的番茄SLPL 蛋白和香蕉CAA63496 蛋白都分布在第Ⅰ亞家族。

圖1 桃PpPL 蛋白家族多序列比對Fig.1 Multiple sequence alignments of peach PpPL proteins family

2.4 桃PpPL 基因在溶質(zhì)型和硬質(zhì)型桃果實成熟過程中的表達

由圖4 可知，PpPL基因在桃果實成熟過程的表達差異明顯，根據(jù)其表達量不同可分為3 組，分別為高表達組、次高表達組和低表達組。 高表達組包含的3個PpPL基因分別為PpPL1、PpPL2、PpPL15，其中PpPL2 和PpPL15 在溶質(zhì)型黃金蜜3 號、PpPL1 在硬質(zhì)型桃有名成熟過程中表達量很低，而在溶質(zhì)型桃黃金蜜3 號成熟過程中高表達，說明PpPL1 基因與桃果實的成熟軟化相關(guān)。 次高表達組包含4 個PpPL基因，分 別 為PpPL9、PpPL10、PpPL18 和PpPL19，其 中PpPL9、PpPL10 和PpPL19 在果實成熟過程中表達恒定，不同溶質(zhì)型果實之間未見顯著差異，而PpPL18 在硬質(zhì)型桃有名成熟過程中呈現(xiàn)出更高的表達。 低表達組包含13 個PpPL基因，這些基因在兩種溶質(zhì)型桃果實成熟軟化過程中均低表達。

將桃PpPL1 蛋白序列與番茄SLPL 蛋白序列進行對比，發(fā)現(xiàn)桃PpPL1 與經(jīng)過功能驗證的果實軟化相關(guān)的番茄SLPL 序列相似度高達72.8%，都包含了完整的PL 蛋白結(jié)構(gòu)域Pec-Lyase-C，且2 個蛋白都含有5個相同的β-螺旋結(jié)構(gòu)(圖5)。

圖2 桃PpPL 的進化關(guān)系和基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Gene structure and phylogenetic relationship of peach PpPL

圖3 桃和其他物種PL 蛋白家族的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic analysis of PL proteins family from peach and other species

2.5 桃PpPL1 基因在桃果實成熟軟化過程中的表達分析

以溶質(zhì)型桃黃金蜜3 號和硬質(zhì)型桃有名在不同成熟期的果實為試驗材料，采用q-PCR 對PpPL1 基因表達進行驗證。 由圖6 可知，在桃果實成熟過程中，PpPL1 基因在硬質(zhì)型桃有名中的表達量均遠低于在溶質(zhì)型黃金蜜3 號中的表達量，這與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。

為進一步驗證PpPL1 基因與桃成熟軟化的關(guān)系，本試驗選取溶質(zhì)型桃湖景蜜露和硬溶質(zhì)型桃夏之夢為試驗材料，檢測了桃果實采后軟化過程中的質(zhì)地變化及PpPL1 在對應(yīng)期間的表達變化。 由圖7 可知，隨著采后貯藏時間的延長，硬質(zhì)型桃夏之夢的硬度下降緩慢，與之相對應(yīng)PpPL1 基因在整個貯藏過程中的表達量都很低；而溶質(zhì)型桃湖景蜜露果實在采后2 d 開始急劇軟化，與此相關(guān)的PpPL1 基因在軟化開始前呈現(xiàn)出高表達，此后相對表達量開始下降，貯藏4 d 以后表達量變化不明顯。

圖4 桃PpPL 基因在黃金蜜3 號和有名桃果實各成熟階段的表達量分析Fig.4 Expression of PpPL genes in Gold honey 3 and Yu myeong peach fruits at the different maturity stages

圖5 桃PpPL1 與番茄SLPL 蛋白多序列比對及二級結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Multiple sequence alignments and secondary structure of peach PpPL1 and tomato SLPL proteins

圖6 PpPL1 基因在黃金蜜3 號和有名桃果實不同發(fā)育期的表達Fig.6 Expression profile of peach PpPL1 gene during fruit ripening of Gold honey 3 and Yu myeong peach fruits were sampled at the different development stages

3 討論

圖7 采后貯藏過程中湖景蜜露和夏之夢果實硬度變化和PpPL1 基因的表達Fig.7 Firmness and PpPL1 gene expression of Hujing Milu and Xia Zhimeng during postharvest storage

本研究通過對桃基因組進行分析，共分離鑒定出20 個PL基因。 序列分析發(fā)現(xiàn)，所有的PL 蛋白都含有Pec-Lyase-C 結(jié)構(gòu)域，但只有PpPL7、PpPL8、PpPL12 和PpPL17 含有Pec-Lyase-N 結(jié)構(gòu)域，說明Pec-Lyase-N結(jié)構(gòu)域可能是執(zhí)行果膠裂解功能所必須的功能團，而Pec-Lyase-C 結(jié)構(gòu)域可能與執(zhí)行某些特異性的功能有關(guān)。 此外，20 個桃PL基因被不均勻地分布在8 條染色體上。 系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析表明，桃PL 蛋白可以分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ共5 個亞家族，每個亞家族的基因結(jié)構(gòu)具有相似性，這與其他植物亞家族分類特性相同[17，26]，揭示了PL基因在植物進化過程中的保守性和基因功能上的多樣性。

研究表明，果膠裂解酶在果實成熟軟化過程中發(fā)揮了重要的作用，在番茄和草莓中通過抑制果膠裂解酶基因表達顯著延緩果實軟化，達到延長果實貯藏期的目的[11，16-18]。 為研究PL基因在桃果實成熟軟化中的作用，本試驗利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較PL基因在溶質(zhì)型桃黃金蜜3 號和硬質(zhì)型桃有名中的表達差異，鑒定出3個高表達PL基因:PpPL1、PpPL2、PpPL15。PpPL2 和PpPL15 在溶質(zhì)型和硬質(zhì)型果實二次快速生長期(S3)和成熟期(S4I、S4Ⅱ和S4Ⅲ)都維持高表達，表明這2 個基因可能主要參與果實的發(fā)育而非軟化過程；PpPL1 基因在溶質(zhì)型桃黃金蜜3 號的快速生長期(S3)高表達，當進入成熟期(S4)后表達雖有下降但仍維持在較高的水平，而該基因只在硬質(zhì)型桃有名快速生長期表達，進入成熟期后表達明顯降低。 果實的發(fā)育過程是細胞分裂與細胞生長共同作用的結(jié)果，在細胞生長發(fā)生之前，首先需要使細胞壁變松散，然后才能完成細胞體積的增長，該過程與果實的軟化類似，都需要細胞壁結(jié)構(gòu)酶的作用。PpPL1 基因在2 種不同溶質(zhì)型桃快速生長期都高表達而在軟化階段顯著差異表達，說明PpPL1 基因可能既參與桃果實早期發(fā)育，又參與成熟后期的軟化過程。 蛋白質(zhì)序列比對揭示PpPL1 與番茄中軟化相關(guān)的果膠裂解酶基因SLPL高度相似(72.8%)，在Pec-Lyase-C 結(jié)構(gòu)域及二級結(jié)構(gòu)上高度保守[27]，而遺傳上PpPL1 與番茄SLPL基因同屬果膠裂解酶Ⅰ亞家族，說明PpPL1 基因可能是參與桃果實成熟軟化的主要基因。 為證明這一推斷，本研究選取溶質(zhì)型桃湖景蜜露和硬質(zhì)型桃夏之夢為試驗材料，驗證PpPL1 基因表達與采后果實軟化過程的相關(guān)性。 結(jié)果表明，PpPL1 在硬質(zhì)桃夏之夢整個采后過程中表達量很低，而在溶質(zhì)型桃湖景蜜露開始軟化前高表達而后降低，表明PpPL1 基因表達與桃軟化高度相關(guān)。

本研究結(jié)果表明，雖然PpPL1 基因在硬質(zhì)型桃有名軟化過程中未表達，但硬質(zhì)型桃仍然有輕微的軟化發(fā)生[19]，表明桃的軟化可能是多種細胞壁結(jié)構(gòu)酶共同作用的結(jié)果。 Endo-PG 被認為是桃軟化的主效基因，Endo-PG 在硬質(zhì)型桃軟化過程中仍然維持了低表達量，而這個低表達量也可能是導(dǎo)致硬質(zhì)型桃輕微軟化的原因[6]。 此外，Zhu 等[28]研究發(fā)現(xiàn)3 個果膠甲酯酶PME和5 個PMEI基因在溶質(zhì)型桃果實中的表達顯著高于硬溶質(zhì)型桃，表明它們可能也與桃果實的軟化相關(guān)。 Hayama 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，乙烯在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控PpPG、PpARF/XYL、PpExp3 等基因的表達，證明這些基因與桃果實成熟軟化高度相關(guān)。 未來將利用外源乙烯及其抑制劑1-MCP 處理，進一步鑒定桃果實中受乙烯調(diào)控表達的PL基因，并通過反義基因沉默或基因編輯技術(shù)來抑制關(guān)鍵PL基因的表達，進而延緩果實軟化進程，延長果實貯藏期。

4 結(jié)論

本研究分離鑒定了20 個桃PL基因，并對其在果實成熟與軟化過程中的表達進行了分析。 結(jié)果顯示，PpPL2 和PpPL15 可能參與了果實的發(fā)育過程，而PpPL1 可能是影響果實軟化的主要基因。