陳雪燕 劉艷艷 譚晴晴 任金瑞 姜欣欣 姜秀梅 劉中華 張全芳

(1山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心/山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院應(yīng)用生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100；2 山東濟(jì)南梅園鐵皮石斛種植有限公司，山東 濟(jì)南 250100；3山東沃森農(nóng)業(yè)科技有限公司，山東 德州 255039)

鐵皮石斛(Dendrobium officinaleKimura et Migo)系蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)植物[1-2]，主要分布在我國(guó)的南方區(qū)域，喜溫暖濕潤(rùn)氣候，長(zhǎng)于密林樹(shù)干或巖縫中。 鐵皮石斛為我國(guó)傳統(tǒng)貴細(xì)藥材，常以干燥莖或楓斗入藥，在中國(guó)許多著名醫(yī)書(shū)上均有用藥記載，具有生津益胃、養(yǎng)陰清熱、潤(rùn)肺益腎之功效。 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，鐵皮石斛中含有的多糖、石斛酚、石斛堿、聯(lián)芐類和菲類等化合物均與消化系統(tǒng)、衰老、免疫力、腫瘤、血糖、白內(nèi)障、心腦血管系統(tǒng)疾病的治療有關(guān)[3-4]。 2018年，國(guó)家衛(wèi)計(jì)委建議將鐵皮石斛列為藥食兩用原料名單，其藥用、食用價(jià)值的應(yīng)用將更為廣泛。 在鐵皮石斛行業(yè)的發(fā)展迎來(lái)新機(jī)遇的同時(shí)，也遇到了新的挑戰(zhàn)，隨著市場(chǎng)需求量的增大，野生資源的稀缺，供需關(guān)系矛盾導(dǎo)致市場(chǎng)上出現(xiàn)各種各樣的“鐵皮石斛”，加工出的楓斗更是真假難辨，大量的混淆品和偽品嚴(yán)重影響了鐵皮石斛作為名貴藥材的品質(zhì)和價(jià)值。 如何保障鐵皮石斛種質(zhì)資源的真實(shí)性以及鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展顯得尤為重要。

藥用石斛品種鑒定工作最早始于20 世紀(jì)30年代，日本學(xué)者木村康一對(duì)搜集來(lái)自中國(guó)、日本等不同產(chǎn)地中藥石斛和楓斗進(jìn)行了詳細(xì)記述和生藥學(xué)研究，可簡(jiǎn)單鑒別出鐵皮石斛和其他石斛屬植物。 此后，由于鐵皮石斛的藥用價(jià)值引起不少學(xué)者關(guān)注，鑒定鐵皮石斛的研究方法也越來(lái)越多，主要有原植物鑒定、性狀顯微鑒定、色譜鑒定、光譜鑒定、液相鑒定以及分子標(biāo)記鑒定等技術(shù)。 傳統(tǒng)方法存在局限性、準(zhǔn)確性低、儀器配套成本高、操作復(fù)雜等問(wèn)題，分子標(biāo)記法以不同物種遺傳物質(zhì)DNA 的差異來(lái)進(jìn)行鑒定，不受物種個(gè)體形態(tài)、發(fā)育等的影響，具有用樣量少、簡(jiǎn)便易行、準(zhǔn)確性和多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于鐵皮石斛的鑒定研究，如RAPD 標(biāo)記[5-7]、ISSR[8-9]、SSR 標(biāo)記[10-12]、AFLP 標(biāo)記[13-14]、SRAP 標(biāo) 記[15-17]、SCAR 標(biāo) 記[18]、EST[19-20]標(biāo)記以及DNA 條形碼(DNA barcoding)[21]的研究均有報(bào)道。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)融合了核酸擴(kuò)增、酶動(dòng)力學(xué)、光譜分析技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，在中醫(yī)領(lǐng)域的中醫(yī)診斷、中藥藥理、證實(shí)質(zhì)、針刺作用機(jī)制研究等方面發(fā)揮了作用[22-23]。 目前該技術(shù)在基原鑒定方面還應(yīng)用于動(dòng)物、西紅花、川貝母等研究[24-25]，而在鐵皮石斛的基原鑒定上鮮有報(bào)道，尤其是TaqMan探針?lè)ǜr見(jiàn)報(bào)道。 本研究探討了DNA 條形碼技術(shù)和TaqMan 探針?lè)ㄔ阼b定鐵皮石斛以及石斛屬植物研究中的應(yīng)用，以期為鐵皮石斛的資源保護(hù)與利用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為蘭科植物15 個(gè)物種，其中石斛屬14個(gè)、蝴蝶蘭屬1 個(gè)，共101 個(gè)樣本，分別由山東沃森農(nóng)業(yè)科技有限公司、濟(jì)南梅園鐵皮石斛種植有限公司和山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉所提供(見(jiàn)表1)。 其中14 種石斛屬植物由山東省百味堂中藥飲片有限公司質(zhì)量總監(jiān)葛付存鑒定，憑證樣本保存于樣品采集基地。

表1 本研究的樣品信息Table 1 Sample information for this study

1.2 主要儀器與設(shè)備

QuantStudioTM7 Flex 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific；T100PCR 儀、Tanon3500 凝膠成像儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；5424 D 高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司； UV3600 紫外分光光度計(jì)，日本島津；3730XL 測(cè)序儀，美國(guó)ABI 公司。 高效植物基因組DNA 提取試劑盒[DP350，天根生化科技(北京)有限公司]，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。 2×TaqMan Master Mix，上海DBI Bioscience 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA 提取、PCR 擴(kuò)增及測(cè)序 稱取樣本鮮葉0.1 g，在液氮下研磨至粉末。 使用植物基因組DNA提取試劑盒提取總基因組DNA，提取的DNA 經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280值，PCR 擴(kuò)增體系(25 μL):2×Taq mastermix 12.5 μL、10 μmol·L-1正反向引物各取1 μL，DNA 模板2 μL、ddH2O 8.5 μL。 擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50～55℃退火30 s(不同引物及退火溫度見(jiàn)表2)，72℃延伸45 s，40 個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳、純化，測(cè)序由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心完成。

表2 ITS、psbA-trnH、matK 及rbcL 基因引物序列及退火溫度Table 2 The primer sequences and annealing temperature of ITS、psbA-trnH、matK and rbcL gene

1.3.2 序列比對(duì)與分析 所測(cè)DNA 序列使用SeqMan 程序拼接、序列比對(duì)和人工校正，去除低質(zhì)量峰區(qū)序列；在Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載15 種石斛屬植物序列，序列信息見(jiàn)表3。 使用MEGA7.0 計(jì)算DNA 條形碼中ITS、psbA-trnH、matK及rbcL4 個(gè)基因在鐵皮石斛種內(nèi)與14 種石斛植物種間變異，采用相似性搜索法(BLAST1)、K2P(Kimura2-parameter)雙參數(shù)遺傳距離分析鑒定能力，構(gòu)建Neighbor-joining(NJ)進(jìn)化樹(shù)評(píng)估4 個(gè)基因在石斛屬之間的親緣關(guān)系。

表3 本研究使用的石斛類GenBank 登錄號(hào)Table 3 GenBank accession numbers of Dendrobium species

1.3.3 PCR 引物及TaqMan 探針的設(shè)計(jì) 綜合分析結(jié)果，選擇最優(yōu)的DNA 條形碼ITS 作為靶基因，利用Primer 5.0 分別設(shè)計(jì)鐵皮石斛特異引物(TP)和特異性探針(TPP)，設(shè)計(jì)石斛屬通用引物(USH)及通用探針(USHP)。 引物及探針修飾見(jiàn)表4。

表4 引物與探針序列Table 4 Primers and probe sequences

1.3.4 多重?zé)晒釶CR 檢測(cè)方法的建立 以野生鐵皮石斛的基因組DNA 為模板，上、下游引物濃度以1.0 ～10.0 μmol·L-1為區(qū)間，以2.0 μmol·L-1濃度梯度遞增；探針濃度以1.0 ～5.0 μmol·L-1為 區(qū) 間，以1.0 μmol·L-1梯度遞增；退火溫度以56 ～64℃為區(qū)間，以2℃逐漸遞增，每次試驗(yàn)采取等量DNA 模板，設(shè)置一個(gè)變量，每個(gè)反應(yīng)條件重復(fù)試驗(yàn)3 次。 對(duì)擴(kuò)增所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以閾值(Ct 值)最小、熒光信號(hào)強(qiáng)度最高和Ct 值標(biāo)準(zhǔn)偏差最小為依據(jù)，同時(shí)保證擴(kuò)增效率和探針的特異性等，最終確定最佳退火溫度。 通過(guò)對(duì)單一熒光定量PCR 反應(yīng)體系中的Taq 酶用量、引物濃度、探針濃度和退火溫度的優(yōu)化，建立鐵皮石斛的單重?zé)晒舛縋CR 方法。

在單一熒光PCR 建立的最優(yōu)體系和確保試驗(yàn)特異性及穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，在同一反應(yīng)體系中分別加入鐵皮石斛特異引物、特異探針，石斛屬通用引物和通用探針，并根據(jù)Ct 值和熒光增量，對(duì)各引物、探針濃度及循環(huán)參數(shù)進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化，最終確定多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系和方法。

1.3.5 多重實(shí)時(shí)熒光PCR 方法特異性和靈敏度檢測(cè) 在供試的14 種石斛屬植物各自樣本DNA 中，分別隨機(jī)選取1 份作為模板，按照上述優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)引物和探針的特異性。 將鐵皮石斛的基因組DNA 定量到5 ng·μL-1，按照5 倍逐級(jí)稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品。 每個(gè)反應(yīng)加量為2 μL，各濃度梯度樣品均設(shè)置3 次重復(fù)，使用優(yōu)化好的多重實(shí)時(shí)熒光PCR 體系及條件進(jìn)行擴(kuò)增，評(píng)價(jià)鐵皮石斛特異引物和探針的靈敏度。

1.3.6 實(shí)際樣品檢測(cè) 將供試的14 種石斛屬植物各自樣本DNA 分別隨機(jī)選取1 份作為模板，使用優(yōu)化后的多重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法測(cè)試實(shí)際樣品，與測(cè)序方法對(duì)比，并驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性、可行性，每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品序列比對(duì)、遺傳變異、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

DNA 條形碼中ITS、psbA-trnH、matK及rbcL的PCR 產(chǎn)物經(jīng)正反方向測(cè)序后，利用MEGA7.0 軟件比對(duì)序列和分析，將所測(cè)100 份樣品石斛屬植物序列和Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)下載的相關(guān)序列進(jìn)行種間、種內(nèi)差異分析。 結(jié)果顯示，ITS 區(qū)序列G+C 平均含量53.9%，均高于其他3 個(gè)基因；ITS、psbA-trnH、matK及rbcL基因變異位點(diǎn)數(shù)分別為為417、124、110、43，鑒定效率分別達(dá)到100%、92.85%、46.15%和14.28%(表5)。 在物種水平上通過(guò)BLAST1 分析，結(jié)合雙參數(shù)遺傳距離發(fā)現(xiàn)，ITS 基因在類群種間和種內(nèi)差異最大，psbA-trnH次之，matK和rbcL最小。

將所測(cè)100 份樣品石斛屬植物的ITS 序列和Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)下載的相關(guān)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，測(cè)序得到的不同屬石斛ITS 條形碼序列與下載的同屬石斛序列分別準(zhǔn)確的聚在一起，同源性達(dá)99%。表明ITS 條形碼在本研究的鐵皮石斛及其他石斛屬聚類分析效果上具有準(zhǔn)確、容易區(qū)分的特點(diǎn)(圖1)。 綜上，ITS基因作為石斛屬最理想的DNA 條形碼，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

2.2 引物探針設(shè)計(jì)及多重?zé)晒釶CR 檢測(cè)方法的建立

將比對(duì)后的ITS 區(qū)域序列作為靶基因，在可變區(qū)

設(shè)計(jì)鐵皮石斛特異性引物和TaqMan 探針(圖2)。 通過(guò)對(duì)引物濃度和探針濃度優(yōu)化，確定最佳引物混合物終濃度為5.0 μmol·L-1，總反應(yīng)體系為20 μL，包括2×Taqman Master mix 10.0 μL、10.0 μmol·L-1Primer Mix 1.0 μL、2.0 μmol·L-1Probe Mix 1.0 μL、1～20 ng·μL-1DNA 模板2.0 μL，ddH2O 6.0 μL。 PCR 反應(yīng)最佳反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，65℃退火35 s，40 個(gè)循環(huán)，收集信號(hào)。 待測(cè)樣本檢測(cè)結(jié)果判定:在同時(shí)進(jìn)行的空白、陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果正常的情況下，被檢測(cè)樣品應(yīng)有相應(yīng)熒光信號(hào)檢出，且相應(yīng)熒光通道出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，Ct 值≤35，說(shuō)明DNA 提取有效。

表5 ITS、psbA-trnH、matK 及rbcL 序列信息Table 5 ITS， psbA-trnH， matK and rbcL sequence information

圖1 基于ITS 序列構(gòu)建的石斛屬及近緣物種NJ 進(jìn)化樹(shù)Fig.1 NJ tree based on ITS sequences from D. officinale and its closely related species

圖2 鐵皮石斛引物和探針設(shè)計(jì)Fig.2 Design the primers and probe of D. officinale

2.3 多重?zé)晒釶CR 特異性試驗(yàn)

按照2.2 的方法針對(duì)鐵皮石斛的引物和特異性探針進(jìn)行特異性驗(yàn)證，當(dāng)羧基熒光素FAM 和羅丹染料ROX 熒光修飾探針有擴(kuò)增曲線時(shí)，且滿足Ct 值≤35說(shuō)明檢出鐵皮石斛成分(圖3)；當(dāng)只有ROX 熒光修飾探針有擴(kuò)增曲線時(shí)，且滿足Ct 值≤35 說(shuō)明未檢出鐵皮石斛成分(圖4)。 表6 中特異性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明鐵皮石斛的引物與探針具有很好的特異性。

圖3 鐵皮石斛探針特異性擴(kuò)增曲線圖Fig.3 The specific amplification curve of D. officinale

2.4 多重實(shí)時(shí)熒光PCR 靈敏度測(cè)試

按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系，將野生鐵皮石斛基因組DNA 濃度定量到5 ng·μL-1，按照5 倍梯度稀釋，共稀釋6 個(gè)梯度，每個(gè)梯度做3 個(gè)重復(fù)，模板量取2 μL，6個(gè)梯度的模板量由高到低依次為10、2、0.4、0.08、0.016 和0.003 2 ng，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)。結(jié)果顯示，本方法的檢測(cè)限可達(dá)到0.016 ng(圖5)，較傳統(tǒng)凝膠PCR 凝膠電泳檢測(cè)靈敏度高很多(圖6)，說(shuō)明本方法具有很高的靈敏度。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

使用優(yōu)化后的多重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)體系進(jìn)行實(shí)際樣品測(cè)試，檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)際樣品有5 份均為鐵皮石斛，14 份檢出非鐵皮石斛源性成分(表7)。 可見(jiàn)，該結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致，可準(zhǔn)確檢測(cè)出鐵皮石斛源性成分，方法具有準(zhǔn)確性和可行性。

表6 鐵皮石斛引物及探針特異性試驗(yàn)Table 6 Primers and probe specificity test of Dendrobium officinale

圖4 其他石斛屬植物探針特異性擴(kuò)增曲線圖Fig.4 The specific amplification curve of Dendrobium species

3 討論

近年來(lái)，由于植物葉綠體基因組具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、相對(duì)保守，易擴(kuò)增和測(cè)序的特點(diǎn)，常用于屬間的分類群研究。 目前，在石斛屬鑒定研究方面，作為DNA 條形碼應(yīng)用較廣泛的有ITS、ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH等基因。 不同的條形碼在不同石斛屬植物中的鑒定效率不同，Asahina 等[29]研究認(rèn)為matK在石斛屬的鑒別中優(yōu)于其他條形碼，更易將各個(gè)種的生物鑒別出來(lái)；付濤等[19]報(bào)道用matK+rbcL搭配petA-psbJ作為鐵皮石斛種質(zhì)資源分子鑒定的條形碼組合。 因此，篩選合適的條形碼作為靶基因?qū)τ阼b定研究顯得尤為重要。 本研究根據(jù)前人的報(bào)道，選出DNA 條形碼中常用的ITS、psbA-trnH、matK和rbcL4 個(gè)基因，分別分析其在供試石斛屬樣品的種間、種內(nèi)差異以及鑒定效率、進(jìn)化關(guān)系，篩選出ITS 基因?yàn)殍b定石斛屬最理想的DNA 條形碼。 這與丁小余等[30]和顧慧芬等[31]報(bào)道的結(jié)果相一致。

圖5 鐵皮石斛特異引物和探針靈敏度擴(kuò)增曲線圖Fig.5 The sensitivity amplification curve of specific primers and prober for D. officinale

表7 實(shí)際樣本檢測(cè)結(jié)果Table 7 The result of actual samples test

圖6 鐵皮石斛普通PCR 凝膠電泳Fig.6 General PCR gel electrophoresis of Dendrobium species

隨著實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)的快速發(fā)展，該技術(shù)也被應(yīng)用到石斛屬的鑒定研究中。 Xu 等[32]曾將實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)(SYBR Green Ⅰ)與ARMS 技術(shù)相結(jié)合，對(duì)25 種石斛屬植物的鮮樣和楓斗進(jìn)行了研究。Dong 等[33]也利用熒光定量技術(shù)建立了熒光熔解曲線分型方法用于石斛的研究。 本研究首次應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 中的TaqMan 探針?lè)ǎ訧TS為靶基因，利用其存在的多態(tài)性，在保守區(qū)設(shè)計(jì)出石斛屬通用引物和探針，可變區(qū)設(shè)計(jì)鐵皮石斛特異性引物和特異探針。通用探針對(duì)整個(gè)PCR 反應(yīng)起到了質(zhì)量控制的作用，使有石斛屬成分的樣品能被檢測(cè)出熒光信號(hào)，從而排除了假陽(yáng)性的存在，而鐵皮石斛的特異引物和探針，保證了僅有鐵皮石斛石斛源性成分的信號(hào)被檢測(cè)出來(lái)。

近年來(lái)諸多研究表明DNA 條形碼在區(qū)別種內(nèi)、種間以及親緣關(guān)系的鑒別方面起到了重要作用，將其作為靶基因具有可靠性。 但針對(duì)使用單一DNA 條形碼鑒別存在的假陽(yáng)性問(wèn)題，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 中的TaqMan 探針?lè)ň哂刑禺愋詮?qiáng)、準(zhǔn)確性和靈敏度高(高出普通PCR 檢測(cè)限100 倍)、重復(fù)性好且高效經(jīng)濟(jì)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其在鐵皮石斛鑒定中的應(yīng)用不僅彌補(bǔ)了該缺陷，同時(shí)節(jié)省了測(cè)序的時(shí)間和費(fèi)用。 該方法的應(yīng)用不僅為鐵皮石斛新品種的鑒定和種質(zhì)資源的利用與保護(hù)提供了科學(xué)依據(jù)，而且將對(duì)鐵皮石斛的臨床療效和用藥安全起到保駕護(hù)航的作用。

4 結(jié)論

本研究探討了DNA 條形碼與TaqMan 探針?lè)ㄔ阼F皮石斛鑒定中的應(yīng)用，以ITS 序列作為靶基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，建立鐵皮石斛多重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)新方法，該方法可對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行準(zhǔn)確、高效地鑒定。