陳 俊 陸園園*

（ 中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京211198）

真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物主要有聚酮類、生物堿類、萜類、肽類和其他類化合物[1]，在不同的發(fā)酵策略下可能會(huì)發(fā)酵不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物。 本研究首次報(bào)道通過(guò)白光光照一株籃狀菌， 可以穩(wěn)定發(fā)酵出一種聚酮化合物Rugulosin，為進(jìn)一步研究其次級(jí)代謝產(chǎn)物生物學(xué)活性以及合成通路提供化合物基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

真菌SP14 由中國(guó)藥科大學(xué)海洋藥學(xué)教研室保存。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)：將馬鈴薯淀粉1g, 葡萄糖4 g 溶于200ml 水中，121℃滅菌20 min。 淺層大米固體培養(yǎng)基：50ml 玻璃錐形瓶中加入10g 大米和10ml 水，121℃滅菌20 min。

1.3 分子學(xué)鑒定

以真菌SP14 基因組DNA 為模板， 使用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3′)擴(kuò)增5.8S rDNA 序列。 PCR 使用50ul 反應(yīng)體系， 反 應(yīng) 條 件 為95℃預(yù) 變 性3min，95℃變 性15s，56℃退 火15s，72℃延伸30s，共35 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR 產(chǎn)物使用2%凝膠電泳驗(yàn)證純化，回收測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast 比對(duì)，使用Mega-X 軟件，采用鄰接法（ Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

挑取活化的真菌SP14 接種到含200ml PDA 的500 ml 錐形瓶中，28℃，200rpm 震蕩培養(yǎng)4 天得種子液，吸取2ml 種子液接種在淺層大米固體培養(yǎng)基上，設(shè)置光照組與避光組。 光照組：每組3 個(gè)平行培養(yǎng)瓶。 避光組：每組3 個(gè)平行培養(yǎng)瓶，使用避光錫箔紙包裹。 將兩組培養(yǎng)瓶置于28℃恒溫光照培養(yǎng)箱中，每24小時(shí)觀察取樣，HPLC 檢測(cè)，第三天至至七天每天取樣，第7 天至第17 天間隔取樣。光照培養(yǎng)箱的光照功率為48w。HPLC 分析條件為：流速為1ml/min，流動(dòng)相乙腈和水分別添加0.1%甲酸。梯 度 洗 脫 程 序 為：0-5 min，5%乙 腈；5-25min，5-100%乙 腈；25-26min，100-5%乙腈；26-30min，5%乙腈（ 下同）。

1.5 活性產(chǎn)物分離純化

將真菌SP14 種子液接種在1kg 淺層大米固體培養(yǎng)基上，28℃。 光照培養(yǎng)20 天。 發(fā)酵結(jié)束后，使用乙醇超聲提取3 次，合并減壓濃縮得到粗提物浸膏。 粗提浸膏經(jīng)過(guò)大孔吸附樹脂柱層析粗分， 依次用純水，20%，40%，60%，80%，100%乙醇水梯度洗脫，HPLC 檢測(cè)其主要富集在60%組分（ 1.036g）；將60%組分減壓濃縮后使用ODS 層析柱分離， 依次用20%，40%，60%，80%，100%甲醇水梯度洗脫，HPLC 檢測(cè)其主要在80%-2 組分（ 47.8mg）；將上述組分減壓濃縮后使用Sephadex LH-20 凝膠分離，流動(dòng)相為甲醇，用試管分管收集后使用HPLC 檢測(cè)純度后合并減壓濃縮得黃色化合物(17.6mg)。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌種屬鑒定

PCR 產(chǎn)物條帶單一，經(jīng)測(cè)序，其分子量大小為580bp。將序列上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast 比對(duì)，選取同源性較高的7 條序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，真菌SP14 與兩株籃狀菌聚為一支且這兩支分支的同源性較高， 確定真菌SP14 為Talaromyces Rugulosin SP14（ 圖1，2）。

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

在以活性為指標(biāo)的真菌篩選中，發(fā)現(xiàn)Talaromyces Rugulosin SP14 上下層培養(yǎng)基顏色不一（ 上黃下青），推測(cè)光照可能影響了真菌SP14 的次級(jí)代謝產(chǎn)物譜。 以光照為變量，進(jìn)行光照和避光培養(yǎng)。 結(jié)果顯示， 光照組于第三天觀察到黃色化合物， 同時(shí)HPLC 顯示，與避光組相比，在保留時(shí)間22.3 min 處，光照組檢測(cè)出一個(gè)特征峰， 且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而變成主要次級(jí)代謝產(chǎn)物，而避光組在此保留時(shí)間則沒有特征峰出現(xiàn)，結(jié)合培養(yǎng)基顏色狀態(tài)及HPLC 檢測(cè)曲線，確定該黃色化合物為活性化合物（ 圖3）。

圖1 Lane1：2 K Marker; Lane2：5.8S rDNA

圖2 SP14 系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 光照與避光組HPLC 檢測(cè)曲線（ D-Dark L-Light）

2.3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

黃色化合物：固體，易溶于DMSO，分子式為C30H22O10。1H-NMR (500MHz，DMSO-d6)，δ：14.60(2H，brs，1-OH，1'-OH)，2.76(2H，d，J=5.17Hz，H-2，H-2')，4.41(2H，s，H-3，H-3')，5.40(2H，brs，3-OH，3'-OH)，3.38(2H，brs，H-4，H-4')，7.45(2H，d，J=1.2Hz，H-6，H-6')，7.18 (2H，d，J=1.2Hz，H-8，H-8')，11.58 (2H，s，9-OH，9'-OH)，2.42 (6H，s，H-15，H-15')。 13C-NMR (500MHz，DMSO-d6)，δ：186.0(C-1，C-1')，58.4(C-2，C-2')，68.5(C-3，C-3')，47.8 (C-4，C-4')，55.6 (C-5，C-5')，120.4 (C-6，C-6')，147.4(C-7，C-7')，123.9 (C-8，C-8')，160.2 (C-9，C-9')，114.2(C-10，C-10')，180.6(C-11，C-11')，106.0(C-12，C-12')，194.0(C-13，C-13')，131.9(C-14，C-14')，21.4(C-15，C-15')。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中[2]報(bào)道基本一致，確定其為Rugulosin。

3 討論

本文研究了從南極海泥中分離篩選出來(lái)的一株籃狀菌Talaromyces Rugulosin SP14， 通過(guò)白光光照穩(wěn)定了活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵并從其固體發(fā)酵物中分離出來(lái)一種活性次級(jí)代謝產(chǎn)物Rugulosin，文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，該化合物對(duì)MRSA 有比較好的抑菌活性[2]，其MIC 值為0.125ug/ml。 Rugulosin 最先自Penicillium rugulosum 菌中分離出來(lái)，前期研究顯示，Rugulosin 對(duì)HIV 病毒有抑制作用[3]，并且對(duì)鏈球菌及棒狀桿菌有很強(qiáng)的抑制活性，并能引起枯草芽孢桿菌DNA 損傷，但對(duì)革蘭氏陰性菌抑制作用較小[4]，對(duì)大鼠肝臟和大腸桿菌的核糖核酸聚合酶以及大鼠肝臟和梨形四膜蟲的核糖核酸酶H 也有比較強(qiáng)烈的抑制作用[5]。 部分研究顯示，真菌來(lái)源的Rugulosin 對(duì)熱休克蛋白90(Hsp90)的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性有較強(qiáng)的抑制作用，分子對(duì)接顯示，Rugulosin 與Hsp90 N 端之間存在較強(qiáng)的相互作用，二者通過(guò)氫鍵形成靜態(tài)復(fù)合物同時(shí)可以使Hsp90 N 端的α- 螺旋含量下降3.4%，從而使Hsp90 N 端的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[6]。 在一些腫瘤細(xì)胞中，Hsp90 可以維持較高的表達(dá)量，繼而影響多種腫瘤相關(guān)蛋白，如Bcr-abl，Akt，C-Raf，CDK4 以及Her2 等的表達(dá)[7]，所以Hsp90 抑制劑可以作為抗腫瘤細(xì)胞的先導(dǎo)化合物，因此有潛力進(jìn)一步將Rugulosin 開發(fā)成為分子探針去研究與Hsp90 相關(guān)的信號(hào)通路[8]。 此外Rugulosin 作為一種真菌毒素，已被ABcam公司開發(fā)為RNA 聚合酶的小分子抑制劑。 在農(nóng)業(yè)應(yīng)用上，Rugulosin 具有抗菌和殺蟲活性，在一些植物內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物中也發(fā)現(xiàn)有Rugulosin 的存在，因此將其用作一種生物殺蟲劑，以減少化學(xué)殺蟲劑的使用，是一種環(huán)境友好型的生物殺蟲劑[9]。

本研究首次報(bào)道了白光光照對(duì)籃狀菌屬真菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響， 將避光粗提物置于光照培養(yǎng)箱中光照刺激，HPLC沒有檢測(cè)出Rugulosin 的存在， 說(shuō)明其并不是光照催化而形成的，而是由真菌自身代謝形成，其中可能涉及到一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的參與。 真菌可能為適應(yīng)極地極晝極夜環(huán)境而進(jìn)化演變出獨(dú)特的對(duì)光敏感的次級(jí)代謝機(jī)制，光照因素也為今后研究極地海洋真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物提供一個(gè)新的思路和依據(jù)。