王 婷

（上海泊燊醫(yī)療器械有限公司，上海201807）

納米脂質(zhì)體藥物載體具有尺寸小， 生物相容性好， 毒副性小，選擇性高，細胞親和性強等特點，被廣泛用于如蛋白質(zhì)藥物、抗腫瘤化療、靶向治療藥物、抗病毒藥物以及基因藥物、疫苗等的體內(nèi)傳輸[1]。 以脂質(zhì)體為載體的各類納米藥物，藥物靶向性、延長藥效、降低藥物毒性、提高療效、改變給藥途徑等優(yōu)點，從而受到科研者的廣泛關(guān)注，在醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用，擁有廣闊的發(fā)展前景。

1 納米藥物載體優(yōu)點分析

近年來，治療藥物與納米技術(shù)交叉學科領(lǐng)域發(fā)展迅速，納米藥物傳輸系統(tǒng)的優(yōu)勢逐漸凸顯。 其是通過以高分子納米粒、納米球、 納米囊等載體與藥物結(jié)合在一起制成藥物， 其粒徑在100～500nm 之間[1-3]，將藥物包封于微粒中，可調(diào)節(jié)釋藥的速度，增加生物膜的透過性，提高利用率，降低藥物毒副作用，增加藥物體內(nèi)循環(huán)時間，減少藥物用量。 相比傳統(tǒng)的藥物載體，納米載體還可對其表面進行功能化修飾[2]，從而提高其靶向性及特異性識別性[3]，提高裝載藥物的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)釋放的速度能等。 納米藥物載體可以制成注射液進行靜脈給藥（ 伊立替康、阿霉素、長春新堿、伊馬替尼等納米脂質(zhì)體藥物），或經(jīng)膠囊后制成口服藥進行口服給藥（ 如口服胰島素）等多種給藥途徑。

2 脂質(zhì)體系統(tǒng)

2.1 脂質(zhì)體

脂質(zhì)體是一種由仿細胞膜結(jié)構(gòu)的磷脂雙分子層自主裝形成的中空球囊結(jié)構(gòu)，其粒徑尺寸可在20nm-2000nm 可調(diào)[1-2]。 構(gòu)成脂質(zhì)體的磷脂分子為細胞膜的主要成分，因此脂質(zhì)體具有優(yōu)異的生物相容性。 特殊的中空球囊結(jié)構(gòu)能很好的起到保護被包封的藥物活性，控制藥物釋放的作用，實現(xiàn)藥物的緩釋，對人體腸胃刺激性小，且脂質(zhì)體的大小在納米尺寸，這種小尺寸顆粒易于被細胞攝取， 能夠被體內(nèi)分解酶代謝降解， 有利于藥物的吸收。 此外，脂質(zhì)體作為藥物載體能靶向傳輸藥物，提高藥物的治療效果，降低毒副作用，被廣泛的應(yīng)用在抗癌納米藥物的開發(fā)中[4]， 在癌癥治療中的優(yōu)勢日益凸顯。 自Ryman 等科學家在1971年提出了將脂質(zhì)體用于藥物載體以來，這方面的研究成為熱點，相關(guān)理論及技術(shù)也得到突破，多種納米脂質(zhì)體藥物產(chǎn)品上市，或已進入臨床階段。

2.2 一般合成工藝

脂質(zhì)體的粒徑大小、 分布均勻、 包封率及穩(wěn)定性是關(guān)鍵因素。不同的制備方法會對其粒徑、結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生影響。通常脂質(zhì)體的常用的合成方法有薄膜分離法、微射流法[5]、超聲冷凍干燥法[6]等。 薄膜分散法又稱Bangham 法，是將脂溶性藥物[7-8]和脂類材料溶解于有機溶劑中，除去有機相后，形成薄膜，加入水相從而形成脂質(zhì)體混懸液， 該方法為最早應(yīng)用最廣泛的方法。 微射流法是一種新興的制備技術(shù)， 其將粗脂質(zhì)體懸浮液經(jīng)過動態(tài)高壓微射流，通過多次液體的高速撞擊、氣蝕、高頻剪切、高頻振動、瞬間壓降等綜合作用， 得到粒度分布均勻的納米脂質(zhì)體其包封率也得到適當?shù)奶岣摺?超聲冷凍干燥法是利用超聲破壞懸浮顆粒，得到粒徑較小的脂質(zhì)體，在極低壓力下除冰凍狀態(tài)下的脂質(zhì)體中的水分，將其分散到水性介質(zhì)中，最終獲得重建后的脂質(zhì)體懸液。

3 藥物載體開發(fā)實驗

3.1 實驗材料與儀器設(shè)備

3.1.1 實驗材料

雷帕霉素（ 阿拉丁試劑）、1,2- 二硬脂?；?sn- 丙三基-3-磷酸膽堿（ 阿拉丁試劑），膽固醇（ 阿拉丁試劑），無水乙醇（ 國藥集團），去離子水（ 北京索萊科技有限公司），甲醇（ 國藥集團）。

3.1.2 實驗儀器

馬爾文Zetasizer/Nano 納米電位粒徑分析儀（ 英國馬爾文儀器有限公司，ZCEC），冷凍離心機（ Cence 儀器， H1850R），高效液相色譜儀（ 美國沃特世儀器，Waters Breeze2），細胞粉碎機（ 新芝生物，JY92-II N），透析袋（ 美國MYM 生物技術(shù)公司，分子量30000）、超聲清洗機（ 深圳得康生物有限公司），恒溫搖床（ 無錫久平儀器，Cos-111B）。

3.2 納米脂質(zhì)體的制備

3.2.1 脂質(zhì)體制備過程

將一定摩爾比的1,2- 二硬脂?；?sn- 丙三基-3- 磷酸膽堿和膽固醇（ 25 mg)稱于1.5 ml 塑料離心管中，加入100μl 雷帕霉素乙醇溶液，溶解。將1ml 去離子水快速加入上述脂材和藥物的溶液中,然后將該懸浮液置于細胞破碎機，功率為100W，超聲20min，用離心機離心5min（ 3000RPM），去除雜質(zhì)，上清液轉(zhuǎn)移至超濾離心管中，離心超濾30min（ 4000r/min），最后將離心管中溶液轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，即得到雷帕霉素納米脂質(zhì)體。

3.2.2 脂質(zhì)體粒徑及電位測試

對上述制備的脂質(zhì)體采用馬爾文Zetasizer/Nano 納米電位粒徑分析儀進行粒徑和電位分析， 這兩個測試均在室溫下將脂質(zhì)體溶液用去離子水稀釋10 倍后進行測試。

3.2.3 包封藥物濃度及包封率測定

對其包封的雷帕霉素采用HPLC 測定其藥物濃度。 HPLC 采用的流動相為甲醇和水的混合物， 流速為0.75ml/min， 觀察278nm 處 的 出 峰 位 置， 在PTFE （ 聚 四 氟 乙 烯） 膜 中 過 濾（ 0.22μm）后進樣，進樣體積為100μl。通過超濾離心過程，除去未結(jié)合的藥物后，脂質(zhì)體中剩余的藥物被認為是封裝藥物。 通過將脂質(zhì)體溶解在流動相中并通過HPLC 方法對其進行分析來測量包封率（ EE）。 封裝效率通過以下公式[9-10]計算：

3.2.4 模擬環(huán)境中的藥物釋放[11]

將500μl 的雷帕霉素脂質(zhì)體樣品放入透析袋（ 分子量：30,000） 中， 然后將其懸浮在裝有250mL 去離子水的有蓋燒杯中。 然后將燒杯放入溫度控制（ 37°C）的恒溫水浴搖床中，搖動速率為每分鐘50 次。 在不同的時間間隔， 從燒杯中取出2mL水，并通過HPLC 方法分析藥物含量。在燒杯中重新加入2ml 去離子水以保持固定的體積。

4 結(jié)果分析

4.1 制備工藝參數(shù)的影響

在脂材摩爾比為7：3，總質(zhì)量為25mg，不加藥物，按照上述制備方法制備空白脂質(zhì)體， 通過采用不同的超聲功率和時間，考察超聲參數(shù)對脂質(zhì)體粒徑的影響。 功超聲功率為100w、50w、25w，超聲時間為20min，15min，測試脂質(zhì)體的粒徑，其結(jié)果如下表1 所示。

表1 不同制備工藝參數(shù)下脂質(zhì)體的粒徑和粒徑分布

通過對數(shù)據(jù)進行方差分析，p＜0.05，各組數(shù)據(jù)有顯著性差異，在工藝參數(shù)為功率100w，時間20min 下制備的脂質(zhì)體粒徑最小，因此在載藥實驗中采用此組參數(shù)進行載藥研究。

4.2 納米脂質(zhì)體表征

選取1,2- 二硬脂酰基-sn- 丙三基-3- 磷酸膽堿和膽固醇的總量為25mg，其摩爾比分別為8：2，7：3， 6：4，超聲參數(shù)為功率100W，時間20min，不添加藥物，進行初步實驗，按照上述方法準備空白脂質(zhì)體，對不同脂材量進行比較。 實驗中發(fā)現(xiàn)摩爾比為8：2 的脂材，有分層現(xiàn)象，脂質(zhì)體不能成功制備，這意味著膽固醇的含量太低，不能穩(wěn)定脂質(zhì)體，因此可認為膽固醇含量對于脂質(zhì)體的穩(wěn)定性很重要。 因此，隨后的實驗是使用摩爾比為7：3 和6：4 的脂材進行實驗。 投入藥物含量分別為10 mg/ml, 5mg/ml, 2.5 mg/ml 雷帕霉素溶液，參數(shù)采用功率100w，時間20min。 具體配方見表2。 對制備出的脂質(zhì)體進行粒徑、電位及藥物濃度的測試，見表3。

表2 不同脂質(zhì)體配比及雷帕霉素藥物濃度

表為磷酸膽堿和膽固醇脂材的摩爾比，雷帕霉素藥物濃度單位為mg/ml。

表3 雷帕霉素載藥脂質(zhì)體表征結(jié)果

從表3 看出，制備出的脂質(zhì)體粒徑均在200nm 以下，脂質(zhì)體中雷帕霉素的包埋量隨膽固醇和磷脂的摩爾比的變化略有不同， 數(shù)據(jù)表明膽固醇增加會減少脂溶性藥物在脂質(zhì)體中的包裹，這是因為膽固醇分子將其自身定位在脂質(zhì)雙層之間以賦予結(jié)構(gòu)剛性和穩(wěn)定性，且雷帕霉素為親脂性藥物[12]，優(yōu)先夾在雙層中，因此隨著膽固醇含量的增加，脂質(zhì)體中的藥物載量下降，脂材摩爾比為6：4 的包封率較7：3 的低。

4.3 模擬環(huán)境中的釋放性能

通過模擬體外環(huán)境進行藥物釋放性能的研究， 如圖1 所示結(jié)果可以看到其釋放速度非常慢，24 小時后從各組配方中均釋放出約7%的包埋藥物， 表明雷帕霉素藥物分子駐留在脂質(zhì)體的雙層中而不在脂質(zhì)體的表面上。

圖1 隨著時間變化的藥物釋放百分比

5 結(jié)論

本文采用一步超聲法制備納米脂質(zhì)體， 此方法制備過程較傳統(tǒng)制備方法更簡單，得到的納米脂質(zhì)體粒徑小，分布小，脂質(zhì)體濃度高，載藥量大，整個制備工藝都是在水溶液體系中進行，環(huán)境友好。 通過實驗我們可以看到膽固醇對納米脂質(zhì)體的形成極其重要，工藝參數(shù)對粒徑和粒徑分布影響顯著，不同的脂材比和藥物濃度添加量可得到74%-93%范圍不等的包封率，結(jié)果表明，在超聲功率為100w，時間20min 下，脂材摩爾比為7：3，藥物濃度為5%，制備出的納米脂質(zhì)體，包封率最高，粒徑小，分布窄， 藥物釋放緩慢。 該方法下制備的納米脂質(zhì)體濃度高達25mg/ml，每1ml 脂質(zhì)體溶液，含0.37-0.46mg 雷帕霉素，較其他傳統(tǒng)的制備方法達到了較高的脂質(zhì)體濃度以及藥物含量。