秦海鵬，王 博，廖栩崢，胡世康，趙吉臣，何子豪，楊世平，孫成波

(廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江，524088)

生物絮團(tuán)技術(shù)(BFT)具有降低飼料系數(shù)、提高養(yǎng)殖動(dòng)物存活率并能減少養(yǎng)殖污水排放等特點(diǎn)，可以有效解決當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展所面臨的飼料成本和環(huán)境污染等問題[1]。BFT能在零或低水交換率的條件下改善養(yǎng)殖水體有毒有害無機(jī)氮的積累[2]。氨氮脅迫對(duì)生物絮團(tuán)模式的養(yǎng)殖功效的影響，證實(shí)了生物絮團(tuán)具有清潔水質(zhì)、促進(jìn)蝦生長(zhǎng)和生理健康的作用[3]。不同蛋白水平對(duì)生物絮團(tuán)模式的養(yǎng)殖有不同的功效，生物絮團(tuán)可以顯著提高養(yǎng)殖系統(tǒng)中對(duì)蝦的生理健康水平，減少病害的爆發(fā)，阻絕病害的傳播等[4-5]。養(yǎng)殖水體菌群組成直接影響對(duì)蝦的生長(zhǎng)發(fā)育和健康狀態(tài)[6-7]，在物質(zhì)循環(huán)、拮抗病原、調(diào)節(jié)水質(zhì)與維持育苗系統(tǒng)穩(wěn)定等方面發(fā)揮積極作用[8-9]。生物絮團(tuán)模式的養(yǎng)殖水體中微生物群落與活性污泥的微生物群落會(huì)受到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、溫度、鹽度、化學(xué)需氧量和溶氧的影響[10]。目前，國(guó)內(nèi)應(yīng)用BFT進(jìn)行水產(chǎn)養(yǎng)殖的研究開始由試驗(yàn)階段過渡到中試規(guī)模的養(yǎng)殖試驗(yàn)[11-12]。盡管生物絮團(tuán)被廣泛應(yīng)用在零換水工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖模式中，但其仍存在不少問題，其作用機(jī)理尚不明確，與生物絮團(tuán)系統(tǒng)的微生物結(jié)構(gòu)與多樣性的動(dòng)態(tài)變化相關(guān)的研究不足。高通量測(cè)序技術(shù)可以靈敏地探測(cè)環(huán)境微生物多樣性，實(shí)現(xiàn)宏基因組水平上多重樣品間的平行比較研究[13]，全面地指示對(duì)蝦健康狀態(tài)與菌群特征關(guān)系[14-16]。通過高通量測(cè)序分析生物絮團(tuán)系統(tǒng)在氮轉(zhuǎn)化過程中微生物多樣性的變化，旨在為生物絮團(tuán)系統(tǒng)在工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)在設(shè)有防逃網(wǎng)的0.3 m3的藍(lán)色塑料桶中進(jìn)行，水體體積250 L，生物絮團(tuán)從鹽度25的養(yǎng)殖池中用200目的篩絹網(wǎng)撈取。經(jīng)過1周時(shí)間暫養(yǎng)的日本對(duì)蝦，體長(zhǎng)(9.20±0.04) cm，體質(zhì)量(9.53±0.71)g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院東海島海洋生物研究基地進(jìn)行。將日本對(duì)蝦隨機(jī)分為2個(gè)試驗(yàn)組，每組3個(gè)重復(fù)，飼養(yǎng)密度250 尾/m3；對(duì)照組水體為清潔的消毒海水，日換水量20%。試驗(yàn)組在消毒海水中加入初始量為20 mL/L的生物絮團(tuán)，試驗(yàn)周期為30 d，24 h連續(xù)充氣。

1.3 水樣收集

在30 d試驗(yàn)期間，每天測(cè)定氨氮，亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮，水質(zhì)生化分析收集的水樣(100 mL)在真空壓力下通過0.45 μm GF/ C濾紙過濾。

1.4 水體菌群取樣和DNA提取

根據(jù)水質(zhì)測(cè)定結(jié)果取試驗(yàn)組第1天、第10天和第30 天水樣(分別標(biāo)記為Cb、Zb和Qb)，水樣使用無菌瓶收集，通過0.2 μm孔徑的聚碳酸酯過濾器(Millipore Corporation，USA)過濾100 mL的混合物以獲得微生物樣品。使用Omega EZNA Water DNA試劑盒(Omega Bio-Tek，USA)從微生物樣品中提取總基因組DNA。通過使用特異性引物擴(kuò)增16S rRNA基因的V4區(qū)：515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806R(5'-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3')。將PCR產(chǎn)物(320～350 bp)再循環(huán)以構(gòu)建擴(kuò)增子文庫(kù)，然后在Miseq平臺(tái)(Illumina，USA)上進(jìn)行測(cè)序。

1.5 序列數(shù)據(jù)分析

根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，對(duì)樣品的reads進(jìn)行拼接，經(jīng)過過濾操作，得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)(Clean Tags)。基于Clean Tags進(jìn)行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類(OTU分析)[17]。根據(jù)OTUs聚類結(jié)果，一方面對(duì)每個(gè)OTU的代表序列做物種注釋，得到對(duì)應(yīng)的物種注釋信息和基于物種的豐度分布情況。同時(shí)，對(duì)OTUs進(jìn)行豐度(統(tǒng)計(jì)，可視化)、Alpha多樣性分析等，以得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息等[18-19]。

1.6 水質(zhì)測(cè)定方法與數(shù)據(jù)分析

氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮質(zhì)量濃度根據(jù)《養(yǎng)殖水環(huán)境化學(xué)實(shí)驗(yàn)》測(cè)定[15]。所有數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism8.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，用SPSS 19.0進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物絮團(tuán)系統(tǒng)養(yǎng)殖過程中的氮轉(zhuǎn)化

氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮在系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)化過程如圖1所示。

圖1 生物絮團(tuán)系統(tǒng)中氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮的變化

在試驗(yàn)過程中，對(duì)照組的水體微生物無法有效轉(zhuǎn)化多余的殘飼糞便，無機(jī)氮逐漸累積[20-21]。隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，水體中的氨氮呈先升高后降低的趨勢(shì)。對(duì)照組氨氮始終高于試驗(yàn)組，試驗(yàn)組氨氮在第5天達(dá)到最大質(zhì)量濃度(2.99 mg/L)，之后在第9天降低至趨于0 mg/L；對(duì)照組在第9天達(dá)到最大質(zhì)量濃度(7.51 mg/L)，之后在第26天降低至趨于0 mg/L。表明生物絮團(tuán)能促進(jìn)水體中的氮轉(zhuǎn)化進(jìn)程[22]。亞硝酸鹽氮在試驗(yàn)組中產(chǎn)生和去除的時(shí)間少于對(duì)照組，試驗(yàn)組在第17天達(dá)到最大質(zhì)量濃度(12.54 mg/L)，之后在第28天降低至趨于0 mg/L；對(duì)照組的亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度在試驗(yàn)周期30 d內(nèi)呈不斷升高的趨勢(shì)，在第30天達(dá)到13.42 mg/L。氨氮與亞硝酸鹽氮在水體中呈先升高后降低的趨勢(shì)，這與其他相關(guān)研究結(jié)果[4]相同。氨氮的累積快于亞硝酸鹽氮的累積，更快于硝酸鹽氮[23]，分析水體中氨化細(xì)菌的繁殖要快于亞硝化細(xì)菌與硝化細(xì)菌[24]。試驗(yàn)組的硝酸鹽氮質(zhì)量濃度高于對(duì)照組，在第30天兩組分別達(dá)到19.56和6.31 mg/L。據(jù)報(bào)道，在鹽度為35的水體中，斑節(jié)對(duì)蝦對(duì)硝酸鹽氮的耐受性高達(dá)232 mg/L[25-26]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，從第13天到第22天出現(xiàn)的降溫也影響到了氮轉(zhuǎn)化進(jìn)程，水體中氨氮與亞硝酸鹽氮的質(zhì)量濃度均出現(xiàn)停滯，相關(guān)研究[27]也證明了溫度對(duì)生物絮團(tuán)的影響。

2.2 水體菌群豐度和多樣性

如圖2所示，利用 16S rRNA 基因 V3+V4 區(qū)域 illumina 測(cè)序從水體微生物群落中獲得了3 500個(gè)OUT(操作分類單元)，Cb、Zb和Qb分別為1 932、2 209和2 023個(gè)OUT，3個(gè)試驗(yàn)組之間具有907(25.9%)個(gè)共同的OUT。采用 ace、chao1和observed otus計(jì)算了基于OUT的菌群豐度指數(shù)，并采用shannon和simpson評(píng)估菌群多樣性指數(shù)，ace、chao1、observed otus和simpson的豐度隨養(yǎng)殖周期的增加均顯著增加，shannon多樣性在Zb期最高，Cb期最小，不同時(shí)期差異顯著(表1)。

圖2 不同時(shí)期的水體菌群韋恩圖

表1 不同時(shí)期的水體菌群多樣性指數(shù)

注：同列中標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性(P>0.05)

2.3 不同時(shí)期的水體菌群組成差異

共鑒定出23個(gè)門549個(gè)屬。如圖3A所示，在門水平上，變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)是主要的細(xì)菌，在試驗(yàn)周期中變形菌門(Proteobacteria)相對(duì)豐度隨時(shí)間增加而降低，擬桿菌門、綠彎菌門、放線菌門相對(duì)豐度隨時(shí)間增加而增加。如圖3B所示，在屬水平上，Ardenscatena、冷蛇菌屬(Psychroserpens)、Inquilinus和Marinicella是最主要的細(xì)菌，三價(jià)鐵和硝酸鹽還原細(xì)菌、冷蛇菌屬和Marinicella相對(duì)豐度隨時(shí)間增加而增加。如圖3C所示，與氮轉(zhuǎn)化有關(guān)的主要的菌有Ardenscatena、硝化螺旋菌(Nitrospiraceae)、亞硝化單胞菌(Nitrosomonadaceae)、Ardenscatena、Nitrospiraceae和Nitrosomonadaceae相對(duì)豐度隨時(shí)間增加而增加，氨氧化古菌相對(duì)豐度隨時(shí)間增加而降低。其中，Ardenscatena屬內(nèi)菌種，能夠?qū)⑾跛猁}氮還原至亞硝酸鹽氮，參與水體氮循環(huán)過程。氨氧化古菌屬的分類歸于古生菌，可以將氨氧化成亞硝酸鹽氮[28]。在上述菌屬協(xié)同作用下，生物絮團(tuán)能有效調(diào)控水體中的氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮[29]。與氮轉(zhuǎn)化有關(guān)的菌的豐度隨水體中氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮的質(zhì)量濃度變化而變化。生物絮團(tuán)系統(tǒng)在培育過程的不同時(shí)期既存在著共有種屬，同時(shí)也存在著各自獨(dú)特的微生物種屬，微生物種屬之間的協(xié)同和競(jìng)爭(zhēng)作用，形成了特定的生態(tài)位群落結(jié)構(gòu)[30]。

圖3 不同時(shí)期在門水平(A)、屬水平(B)以及與氮轉(zhuǎn)化(C)相關(guān)的水體菌群相對(duì)豐度

在門水平上變形菌門和擬桿菌門是主要的細(xì)菌，在所有類型的生物絮團(tuán)中占很大比例。這與楊章武等的研究結(jié)果相類似[31]。在試驗(yàn)周期中變形菌門相對(duì)豐度隨時(shí)間增加而降低，擬桿菌門、綠彎菌門和放線菌門相對(duì)豐度隨時(shí)間增加而增加。水體中大多數(shù)變形菌門是養(yǎng)殖系統(tǒng)中的共生細(xì)菌[32]。在生物絮凝物的廢水處理中，變形菌門用于去除有機(jī)物質(zhì)[33-34]。變形菌門在生物絮團(tuán)細(xì)菌組成中起著重要作用[35-36]。因此，在凡納濱對(duì)蝦的生物絮團(tuán)養(yǎng)殖模式下，變形菌門的存在可以有效調(diào)節(jié)水產(chǎn)養(yǎng)殖水體的水質(zhì)。放線菌門是一種常見的益生菌，可以在特定環(huán)境中產(chǎn)生有益物質(zhì)[37]。

2.4 不同時(shí)期水體菌群種類和豐度差異及距離矩陣PCoA

在圖4中根據(jù)加權(quán)和未加權(quán)UniFrac距離矩陣PCoA圖分析，可知同組樣本之間物種可以很好地聚在一起，不同組之間可以清楚地分離出來。

圖4 不同時(shí)期水體菌群的加權(quán)UniFrac距離矩陣PCoA圖

通過LDA值分布柱狀圖分析，得到不同組間微生物分類相對(duì)豐富的差異。如圖5所示，LEfSe的LDA值計(jì)算結(jié)果顯示，具有顯著差異的細(xì)菌群落在Cb組中最多且相對(duì)豐度最大，Zb組最少且相對(duì)豐度最小，菌群豐度隨著時(shí)間的增加，先減少后增加[28-29]?？梢缘贸?，經(jīng)過培養(yǎng)的穩(wěn)定的生物絮團(tuán)系統(tǒng)中，水體菌群的多樣性有所減少、豐度有所增加，這與夏耘等[30]的研究結(jié)果相似。根據(jù)結(jié)果分析， 原因應(yīng)該是穩(wěn)定的系統(tǒng)中水體優(yōu)勢(shì)菌群

圖5 不同時(shí)期水體菌群的LDA值分布柱狀圖

的豐度進(jìn)一步增加，在全部菌群中占據(jù)更大的比例。根據(jù)LDA值分布柱狀圖的結(jié)果可以得出，經(jīng)過培養(yǎng)的穩(wěn)定的生物絮團(tuán)系統(tǒng)中，水體菌群的多樣性更為豐富，穩(wěn)定后的生物絮團(tuán)系統(tǒng)與剛接種時(shí)的生物絮團(tuán)系統(tǒng)相比，水體菌群的結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。

3 結(jié)論

生物絮團(tuán)系統(tǒng)在培育過程中，通過微生物群落間的演替作用，實(shí)現(xiàn)群落類型的穩(wěn)定及自身功能的穩(wěn)定與可持續(xù)。生物絮團(tuán)系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性在水體氮循環(huán)過程中存在變化情況，通過高通量測(cè)序分析生物絮團(tuán)系統(tǒng)在氮轉(zhuǎn)化過程中水體菌群的多樣性變化，結(jié)果顯示，經(jīng)過培養(yǎng)的穩(wěn)定的生物絮團(tuán)系統(tǒng)中，水體菌群的多樣性有所減少、豐度有所增加，菌群涉及氮轉(zhuǎn)化相關(guān)的關(guān)鍵屬在不同時(shí)期具有顯著變化。因此，在生物絮團(tuán)系統(tǒng)養(yǎng)殖模式的應(yīng)用中，穩(wěn)定的生物絮團(tuán)培養(yǎng)需要一定的時(shí)間，從而為水體中與氮轉(zhuǎn)化相關(guān)的水體微生物的演替提供時(shí)間和物質(zhì)環(huán)境的準(zhǔn)備，提高對(duì)生物絮團(tuán)系統(tǒng)的有效利用。

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