李鳳麗　石素華　李?lèi)?ài)芹　王興軍　趙術(shù)珍

摘要：CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated protein 9）是近年發(fā)現(xiàn)的繼ZFNs和TALENs兩種基因編輯技術(shù)之后的一種新型基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)。本研究分別從CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、類(lèi)別、作用機(jī)制、相關(guān)應(yīng)用以及存在問(wèn)題等方面進(jìn)行綜述，旨在為相關(guān)領(lǐng)域研究提供參考。

關(guān)鍵詞：基因組編輯;CRISPR/Cas9;sgRNA;研究進(jìn)展

中圖分類(lèi)號(hào)：S-1：Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2020）04-0164-09

Abstract The CRISPR/Cas9 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein 9） is a novel genomic editing technology discovered in recent years following the two gene editing technologies of ZFNs and TALENs. In this article， the structure， category， mechanism of action， application and present problems of the CRISPR/Cas9 system were summarized in order to provide references for relevant researches.

Keywords Genome editing; CRISPR/Cas9; sgRNA; Research progress

CRISPR/Cas9系統(tǒng)最初在細(xì)菌免疫系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)人為改造，可對(duì)真核細(xì)胞的基因組進(jìn)行特異編輯。該系統(tǒng)通過(guò)特異性的單向?qū)?RNA（single guide RNA， sgRNA）序列，引導(dǎo)?Cas9 蛋白特異結(jié)合到靶序列處行使?DNA 切割功能。然后利用細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制對(duì)切割后的?DNA 進(jìn)行插入、缺失或替換等修飾。相比于ZFNs和TALENs兩種傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有簡(jiǎn)單、高效和低成本等優(yōu)勢(shì)，在植物、動(dòng)物及人類(lèi)中的應(yīng)用日趨廣泛。因此，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)探究植物基因功能等相關(guān)問(wèn)題將成為推動(dòng)植物學(xué)研究的一個(gè)重要方法。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)

1.1 CRISPR系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)

1987年，Ishino等[1]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中負(fù)責(zé)編碼堿性磷酸酶同工酶的iap基因存在特殊的重復(fù)間隔序列，但在當(dāng)時(shí)并未引起廣泛關(guān)注。直到2000年，人們?cè)诩?xì)菌、古細(xì)菌及線粒體基因組中發(fā)現(xiàn)一系列規(guī)則間隔重復(fù)序列，并命名為規(guī)則的短間隔重復(fù)序列（short regularly spaced repeats，SRSRs）。2002年，Jansen等[2]在細(xì)菌與古細(xì)菌等原核生物基因組中發(fā)現(xiàn)一系列新的重復(fù)序列（長(zhǎng)度為25～37 bp），根據(jù)其重復(fù)基因座家族的結(jié)構(gòu)特性，命名為規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs）。同年，Makarova等[3]通過(guò)對(duì)原核生物基因組中保守基因的系統(tǒng)性研究，預(yù)測(cè)CRISPRs與嗜熱細(xì)菌及古細(xì)菌的DNA修復(fù)系統(tǒng)有關(guān)。2005年，Bolotin等[4]發(fā)現(xiàn)在CRISPRs中，間隔區(qū)基因與噬菌體和質(zhì)粒已知基因具有同源性，并提出CRISPRs結(jié)構(gòu)的形成涉及cas基因介導(dǎo)的DNA片段化，鑒于其在細(xì)菌基因組中的穩(wěn)定性和廣泛性，推測(cè)它可能是細(xì)菌對(duì)抗外源DNA入侵的一種保護(hù)機(jī)制。隨后有研究[5]認(rèn)為，CRISPR間隔區(qū)存在于已知的噬菌體和接合質(zhì)粒序列、染色體或遺傳元件，且這些序列未能感染特定的間隔載體菌株，這意味著CRISPR與靶DNA的免疫有關(guān)。Makarova等[6]通過(guò)分析CRISPR和cas基因，提出CRISPR/Cas系統(tǒng)（CASS）是一種防御噬菌體和質(zhì)粒入侵機(jī)制的假設(shè)，其功能類(lèi)似于真核生物的RNA干擾（RNAi）系統(tǒng)。Barrangou等[7]揭示了CASS是原核生物的一種DNA修復(fù)機(jī)制，即在被病毒攻擊后，細(xì)菌可以整合來(lái)自噬菌體基因組序列的新間隔區(qū)，通過(guò)去除或添加特定間隔區(qū)來(lái)改變細(xì)胞的噬菌體抗性。因此，細(xì)菌中CRISPR與相關(guān)cas基因共同通過(guò)間隔區(qū)（噬菌體序列）相似性確定抗性特異性，進(jìn)而提供對(duì)噬菌體的抗性。2008年，Marraffini等[8]發(fā)現(xiàn)CASS干擾的靶標(biāo)是DNA。2011年，Makarova等[9]通過(guò)對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)的序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，揭示Cas蛋白之間存在同源性，并首次披露CRISPR/Cas系統(tǒng)的分子機(jī)制。同年，Makarova等[10]進(jìn)一步分析了CRISPR/Cas系統(tǒng)和Cas蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系，并將該系統(tǒng)分為三種主要類(lèi)型。2013年，張鋒課題組通過(guò)設(shè)計(jì)兩種不同的Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)來(lái)誘導(dǎo)人和小鼠細(xì)胞內(nèi)源基因組位點(diǎn)的精確切割，將多個(gè)指導(dǎo)序列編碼成單個(gè)CRISPR陣列，同時(shí)編輯了哺乳動(dòng)物基因組內(nèi)的幾個(gè)位點(diǎn)，并證明RNA引導(dǎo)的基因編輯技術(shù)存在廣泛適用性[11]。Jiang等[12]利用與雙RNA復(fù)合CRISPR/Cas9，對(duì)肺炎鏈球菌和大腸桿菌的基因組進(jìn)行精確編輯，表明該技術(shù)可應(yīng)用于細(xì)菌基因組研究。

1.2 CRISPR/Cas結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和作用原理

CRISPR/Cas系統(tǒng)是大多數(shù)細(xì)菌和古細(xì)菌中存在的一種獲得性免疫系統(tǒng)。Jansen等[13]比較了不同原核物種CRISPR基因座側(cè)翼的四種基因（cas1～cas4），表明該類(lèi)CRISPR相關(guān)基因具有同源性;cas3基因含有超家族2的解旋酶特征基序，cas4基因存在RecB核酸外切酶家族基序，可參與DNA的代謝或表達(dá);但沒(méi)有CRISPR的原核生物中不存在這些基因。因此，CRISPR和cas基因具有空間連貫性，這引起科研人員對(duì)該類(lèi)基因起源及生物學(xué)功能的極大興趣。Pourcel等[14]在鼠疫耶爾森氏菌基因組三個(gè)不同位點(diǎn)處發(fā)現(xiàn)3個(gè)CRISPR元件，其中1個(gè)具有高度多態(tài)性;對(duì)109個(gè)與三種鼠疫桿菌CRISPR相關(guān)等位基因進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，共存在29個(gè)新間隔區(qū)，且大多數(shù)屬于一種株系;在9株假結(jié)核耶爾森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）中共發(fā)現(xiàn)132個(gè)間隔區(qū)，僅有3個(gè)是鼠疫桿菌不同株系的共有區(qū)域。此外，他們?cè)跂|方鼠疫桿菌中觀察到基序缺失，但插入基序現(xiàn)象更為普遍，其中基序缺失發(fā)生在三個(gè)不同位點(diǎn)，缺失后的間隔片段在基因組的另一基因座處存在同源物;而對(duì)間隔片段進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，它們可能是某些入侵遺傳元件在細(xì)菌內(nèi)的殘留，可為細(xì)菌提供一種抵御外源DNA入侵的特異性免疫。該研究首次揭示了CRISPR元件中間隔片段的起源。Kunin等[15]對(duì)從195個(gè)微生物基因組中鑒定出的CRISPR重復(fù)序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，它們可分成多個(gè)簇，一些簇呈現(xiàn)穩(wěn)定性，存在高度保守的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，而另一些則不具有保守結(jié)構(gòu)域。Bhaya等[16]發(fā)現(xiàn)R環(huán)結(jié)構(gòu)中的單DNA鏈?zhǔn)荂as3核酸酶活性的靶標(biāo)，可以導(dǎo)致原型間隔區(qū)中的單鏈斷裂。其具體作用機(jī)制為，在完成第一條DNA鏈切割后，Cas3解旋酶可能取代cascade-crRNA復(fù)合物對(duì)第二條DNA鏈進(jìn)行切割，而靶DNA的切割干擾了病毒復(fù)制和質(zhì)粒功能。

1.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用原理

Bhaya等[16]于2011年得出CRISPR/Cas系統(tǒng)作用機(jī)制，包括①CRISPR間隔區(qū)獲得：當(dāng)外源基因侵入宿主時(shí)，激活CRISPR/Cas9系統(tǒng)并發(fā)揮免疫活性，靶向分解外源DNA序列并將原型間隔序列（protospacer）整合到宿主基因組CRISPR位點(diǎn)的5′端;②CRISPR表達(dá)：pre-CRISPR-derived RNA（pre-crRNA）從前導(dǎo)區(qū)轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步切割成較小的crRNA，同時(shí)合成Cas9蛋白;③CRISPR干擾：crRNA和Cas9蛋白在tracrRNA的指導(dǎo)下形成核蛋白復(fù)合物，特異性識(shí)別外源基因并發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性，分解外源遺傳物質(zhì)，賦予宿主免疫力。

1.4 CRISPR/Cas系統(tǒng)分布與分類(lèi)

根據(jù)Cas蛋白的不同，可將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為三類(lèi)。類(lèi)型Ⅰ含6個(gè)Cas蛋白，數(shù)量最多，也最復(fù)雜，其中Cas3蛋白最具特征性，具有解旋酶和核酸酶雙重功能，在CRISPR干擾階段發(fā)揮主要作用。Sinkunas等[17]通過(guò)對(duì)嗜熱鏈球菌Cas3基因的克隆、表達(dá)、蛋白純化和體外功能分析，認(rèn)為其具有單鏈DNA刺激的ATPase活性，可與DNA/DNA和RNA/DNA雙鏈體的解旋結(jié)構(gòu)相結(jié)合，此外，Cas3的HD結(jié)構(gòu)域還具有ATP非依賴(lài)性核酸酶活性，優(yōu)選單鏈DNA作為底物。因此，該課題組提出Cas3 ATPase/解旋酶結(jié)構(gòu)域充當(dāng)運(yùn)動(dòng)蛋白，有助于將核酸酶活性傳遞至cascade-crRNA復(fù)合物以靶向外源DNA。類(lèi)型Ⅱ主要特征是包含一個(gè)標(biāo)志蛋白，即Cas9蛋白，該蛋白參與crRNA的成熟以及對(duì)入侵DNA或外源質(zhì)粒進(jìn)行降解[18]。類(lèi)型Ⅲ包含特征性的Cas10蛋白，其具有RNA酶活性和類(lèi)似于類(lèi)型Ⅰ的cascade功能[19]，主要參與crRNA的成熟和剪切入侵的外源DNA。類(lèi)型Ⅰ和類(lèi)型Ⅲ在細(xì)菌和古細(xì)菌中均有發(fā)現(xiàn)，類(lèi)型Ⅱ僅存在于細(xì)菌。與Ⅰ、Ⅲ相比，類(lèi)型Ⅱ僅需要Cas9蛋白對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行剪輯，Cas9蛋白則僅需要一個(gè)gRNA引導(dǎo)，而Ⅰ、Ⅲ依賴(lài)于復(fù)雜的蛋白質(zhì)復(fù)合體及tracrRNA-crRNA的引導(dǎo)。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用

2.1 模式動(dòng)物中的研究

CRISPR技術(shù)已成功應(yīng)用于果蠅、線蟲(chóng)和斑馬魚(yú)等物種的基因修飾。Gratz等[20]將同源定向修復(fù)（HDR）與雙鏈DNA（dsDNA）供體模板應(yīng)用于果蠅的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，通過(guò)與目標(biāo)DNA序列的精確結(jié)合來(lái)促進(jìn)基因組編輯的順利進(jìn)行，該過(guò)程中可以替換基因或產(chǎn)生條件等位基因，進(jìn)而保證優(yōu)化效率和特異性，最終可獲得表達(dá)Cas9的轉(zhuǎn)基因果蠅;將dsDNA供體和gRNA編碼質(zhì)粒注射到表達(dá)Cas9的果蠅中，可產(chǎn)生最高效率的HDR，并且可選擇靶位點(diǎn)以避免脫靶效應(yīng)。該研究為復(fù)雜的基因組修飾打開(kāi)了大門(mén)，并極大地?cái)U(kuò)大CRISPR技術(shù)在果蠅研究中的應(yīng)用。Zheng等[21]對(duì)弓形蟲(chóng)亮氨酸氨肽酶進(jìn)行研究，證明其在調(diào)節(jié)游離氨基酸水平中發(fā)揮作用，可用作藥物靶標(biāo)的篩選。Shen等[22]通過(guò)操縱RNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas9在秀麗隱桿線蟲(chóng)體細(xì)胞系中的表達(dá)，開(kāi)發(fā)出條件性敲除方法，該技術(shù)可以在不同細(xì)胞的各個(gè)發(fā)育階段進(jìn)行條件性敲除，優(yōu)于體細(xì)胞TALEN技術(shù);而通過(guò)將該技術(shù)與活細(xì)胞成像相結(jié)合發(fā)現(xiàn)，在秀麗隱桿線蟲(chóng)的后胚胎神經(jīng)細(xì)胞遷移與神經(jīng)系統(tǒng)形成過(guò)程中存在與人類(lèi)神經(jīng)功能障礙相關(guān)的胚胎基因，該基因可調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白組織和細(xì)胞形態(tài)。Ghorbal等[23]通過(guò)破壞染色體基因并高效地產(chǎn)生無(wú)標(biāo)記的替代單核苷酸，證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可用于惡性瘧原蟲(chóng)的基因編輯，并闡述了基因組編輯在瘧疾研究中的價(jià)值。Varshney等[24]使用CRISPR/Cas9技術(shù)，對(duì)斑馬魚(yú)的83個(gè)基因進(jìn)行編輯，獲得99%的突變成功率，相比于TALENs和ZFNs，該技術(shù)編輯效率顯著提高，使得基因組的飽和誘變和大規(guī)模表型分析成為可能。

2.2 哺乳動(dòng)物中的研究

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用研究較多，也較為成熟。Fujii等[25]以哺乳動(dòng)物受精卵為材料，利用CRISPR/Cas系統(tǒng)獲得基因組編輯動(dòng)物。Zhou等[26]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，通過(guò)胚胎顯微注射Cas9 mRNA和靶向小鼠B2m、Il2rg、Prf1、Prkdc和Rag1的多種gRNA，成功對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行編輯，并得到不同遺傳修飾和種類(lèi)的免疫缺陷小鼠模型。Mizuno等[27]設(shè)計(jì)并構(gòu)建了Tyr基因的CRISPR/Cas9表達(dá)載體，通過(guò)EGxxFP系統(tǒng)證實(shí)px330-Tyr-M在Tyr基因靶位點(diǎn)處的DNA切割活性，還設(shè)計(jì)了用于同源定向修復(fù)基因編輯的ssDNA供體，該研究預(yù)期CRISPR/Cas9載體和任選的突變ssDNA組合，可有效地產(chǎn)生用于研究人類(lèi)疾病的SNM誘導(dǎo)小鼠模型。Nakagawa等[28]構(gòu)建了三種類(lèi)型的CRISPR/Cas9載體，即gRNA和Cas9核酸酶、兩種gRNA和Cas9切口酶以及兩種gRNA和FokⅠ-dCas9，均靶向相同的基因組基因座，但不同載體對(duì)小鼠基因組的編輯具有不同特點(diǎn)：Cas9核酸酶導(dǎo)致突變率最高，出生率最低;而Cas9切口酶導(dǎo)致出生率最高，突變率最低;FokⅠ-dCas9導(dǎo)致突變率和出生率處于均衡。該研究所構(gòu)建的針對(duì)兩個(gè)不同基因組位點(diǎn)的單一一體化FokⅠ-dCas9載體成功實(shí)現(xiàn)了高效同時(shí)定向編輯。盡管CRISPR/Cas系統(tǒng)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠基因進(jìn)行編輯，但低成功率限制其應(yīng)用。Aida等[29]通過(guò)Cas9蛋白復(fù)合物與雙RNA結(jié)合使編輯小鼠的產(chǎn)生效率高達(dá)50%，相比之下，通過(guò)Cas9 mRNA和gRNA方法敲入小鼠頻率僅為10%。Shi等[30]將CRISPR/Cas9靶向功能基因的外顯子，產(chǎn)生更高比例的無(wú)效突變，成功在小鼠急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞中篩選蛋白結(jié)構(gòu)域，并揭示CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)應(yīng)用于篩選鑒定癌癥和其它疾病治療靶點(diǎn)的可行性。

Zhou等[31]應(yīng)用Cas9/gRNA對(duì)豬胚胎成纖維細(xì)胞中的基因進(jìn)行編輯，將突變細(xì)胞集落用作供體，通過(guò)對(duì)單輪體細(xì)胞進(jìn)行核移植，實(shí)現(xiàn)單基因和雙基因的精確編輯，成功獲得15個(gè)酪氨酸酶雙等位基因突變純合豬以及20個(gè)PARK2和PINK1雙基因敲除純合豬。杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥是一種隱性的X連鎖形式的肌營(yíng)養(yǎng)不良癥，由肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因控制，Chen等[32]利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向恒河猴肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因，通過(guò)檢測(cè)編輯效率發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9可使猴肌肉中87%的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白等位基因產(chǎn)生嵌合突變體。

2.3 人類(lèi)細(xì)胞中的研究

β-地中海貧血是世界上最常見(jiàn)的遺傳性疾病之一，是由人類(lèi)血紅蛋白β（HBB）基因突變引起的。Xie等[33]使用CRISPR/Cas9技術(shù)，結(jié)合piggyBac轉(zhuǎn)座子，在患者中利用誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSCs）可有效地糾正HBB突變，且未在校正的iPSC中檢測(cè)到脫靶效應(yīng)，細(xì)胞保持全能性并具有正常核型，這為干細(xì)胞基因治療單基因疾病提供可能。有研究表明，CDK11 mRNA參與調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和存活[34]。Feng等[35]利用CRISPR/Cas9沉默CDK11基因，可導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞系死亡，表明CRISPR-Cas9系統(tǒng)是修飾內(nèi)源性CDK11基因表達(dá)的有效方法，同時(shí)也說(shuō)明，CRISPR/Cas9靶向CDK11敲除在治療骨肉瘤方面具有應(yīng)用前景。

Nihongaki等[36]介紹了一種光活化的Cas9（paCas9），它在人胚腎293T細(xì)胞中表達(dá)過(guò)程中，通過(guò)對(duì)藍(lán)光照射的響應(yīng)，利用非同源末端連接和同源定向修復(fù)途徑誘導(dǎo)靶向基因組序列修飾，可實(shí)現(xiàn)光控制CRISPR/Cas9在人類(lèi)細(xì)胞中的基因編輯。Drost等[37]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)人腸干細(xì)胞中四種最常見(jiàn)的結(jié)腸直腸癌基因（APC、p53、KRAS和SMAD4）進(jìn)行編輯，異種植入小鼠后，四缺突變體鼠產(chǎn)生腫瘤，并認(rèn)為APC和p53的雙重缺失可導(dǎo)致基因組出現(xiàn)廣泛的非整倍性，是腫瘤發(fā)生的標(biāo)志。Merkle等[38]利用CRISPR/Cas9成功編輯hPSC細(xì)胞中的部分位點(diǎn)。Liang等[39]利用三核受精卵研究人細(xì)胞中CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯，發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9可以有效切割血紅蛋白β基因，但該基因的同源定向修復(fù)效率很低，并且編輯的胚胎是嵌合體，而這些胚胎中HBB基因的修復(fù)優(yōu)先以非交叉HDR途徑進(jìn)行。該研究進(jìn)一步突出了提高CRISPR/Cas9技術(shù)的保真度和特異性的迫切需要，這是CRSIPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯在臨床應(yīng)用上的先決條件。Gifford等[40]利用CRISPR-Cas9技術(shù)，通過(guò)對(duì)小鼠中小兒先天性心臟病致病基因的編輯，發(fā)現(xiàn)只攜帶父本的MKL2和MYH7突變或只攜帶母親NKX2突變的小鼠并沒(méi)有表現(xiàn)出任何心臟病的跡象，而三個(gè)基因同時(shí)突變的小鼠卻能顯示出在患者中所觀察到的心臟缺陷，這揭示了小兒先天性心臟病的致病原因。

2.4 單子葉植物中的研究

目前，CRISPR技術(shù)在單子葉模式植物水稻中的應(yīng)用較為廣泛。Yuan 等[41]利用CRISPR/cas9基因編輯技術(shù)，證實(shí)兩個(gè)母本和三個(gè)父本印記基因?qū)ΨN子發(fā)育產(chǎn)生影響，即母本印記基因突變產(chǎn)生小種子，父本印記基因突變導(dǎo)致植株敗育。Zhang等[42]研究表明，miR397能夠正向調(diào)控水稻產(chǎn)量，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR408也能夠正調(diào)控水稻產(chǎn)量，而其靶基因OsUCL8的CRISPR敲除或RNAi植株可表現(xiàn)出與miR408過(guò)表達(dá)相一致的表型。水稻東格魯病毒?。≧TD）是由水稻東格魯桿狀病毒（RTBV）和水稻東格魯球狀病毒（RTSV）復(fù)合感染引起的病害，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量。RTSV抗性是由真核翻譯起始因子4G （eIF4G）控制的隱性性狀，傳統(tǒng)水稻品種中的RTSV抗性可有效地降低RTD發(fā)病率。國(guó)際水稻研究所以RTSV 敏感品種IR64為材料，利用CRISPR/Cas9方法產(chǎn)生新的eIF4G基因突變體，在所獲得的系列突變體中，只有鄰近YVV的?SVLFPNLAGKS殘基發(fā)生移碼突變后才表現(xiàn)RTD抗性[43]。Ren等[44]將多個(gè)sgRNA克隆到載體中，并通過(guò)Gateway反應(yīng)整合到二元載體，開(kāi)發(fā)出在水稻基因組中進(jìn)行CRISPR/Cas9編輯的有效位點(diǎn)。在水稻中，除了廣泛使用的NGG PAM外，Meng等研究發(fā)現(xiàn)，SpCas9本身能夠識(shí)別NAG PAM，在NGA PAM中SpCas9的高效率可能是其蛋白高水平表達(dá)以及sgRNA的修飾所致，也可能由于水稻轉(zhuǎn)化過(guò)程中長(zhǎng)時(shí)間組織培養(yǎng)的緣故，這還需要進(jìn)一步驗(yàn)證，而進(jìn)一步研究NAG PAM位點(diǎn)的脫靶效應(yīng)，將有助于提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率[45]。獨(dú)腳金內(nèi)酯是影響植株結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵激素，類(lèi)胡蘿卜素裂解雙氧酶7（CCD7）是控制其生物合成的關(guān)鍵酶。Butt等[46]在水稻中利用CRISPR/Cas9對(duì)ccd7基因進(jìn)行編輯，發(fā)現(xiàn)ccd7突變體分蘗數(shù)顯著增加且植株變矮，而獨(dú)腳金內(nèi)酯的類(lèi)似物GR24可以恢復(fù)這些表型。開(kāi)花時(shí)間是影響水稻區(qū)域適應(yīng)和產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。OsPHL3是G2-like家族的轉(zhuǎn)錄因子，過(guò)表達(dá)OsPHL3的水稻開(kāi)花時(shí)間延遲，利用CRISPR/Cas9對(duì)OsPHL3進(jìn)行編輯的水稻則提前開(kāi)花[47]。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（AATs）在植物發(fā)育過(guò)程的營(yíng)養(yǎng)分配中起著不可或缺的作用。Lu等[48]發(fā)現(xiàn)在過(guò)表達(dá)OsAAP3的轉(zhuǎn)基因水稻中，Lys、Arg、His、Asp、Ala、Gln、Gly、Thr和Tyr濃度顯著升高，芽生長(zhǎng)和分蘗均被抑制;OsAAP3的RNAi轉(zhuǎn)基因植株中Arg、Lys、Asp和Thr的濃度降低，芽生長(zhǎng)被促進(jìn)，分蘗數(shù)和單株有效穗數(shù)顯著增加，而利用CRISPR技術(shù)在粳稻上敲除OsAAP3，可顯著提高籽粒產(chǎn)量。

小麥作為一種重要的糧食作物，通過(guò)科學(xué)技術(shù)提高產(chǎn)量、改善優(yōu)良性狀具有重要意義。Bhowmik等[49]將CRISPR/Cas9系統(tǒng)與小孢子培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，研發(fā)出一種優(yōu)化的單倍體誘變系統(tǒng)，用以誘導(dǎo)小麥基因組中的遺傳編輯，并利用多個(gè)Cas9和sgRNA構(gòu)建載體，對(duì)外源DsRed基因和兩個(gè)內(nèi)源小麥基因（TaLox2和TaUbiL1）進(jìn)行精準(zhǔn)編輯。TaGW2基因是小麥籽粒大小和千粒重的負(fù)調(diào)因子，但各成員對(duì)籽粒大小和千粒重貢獻(xiàn)尚未明確。Wang等[50]使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)和TILLING（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）分別誘變Bobwhite和Paragon品種中TaGW2基因，證實(shí)不同基因型中單拷貝無(wú)效突變會(huì)不同程度地影響籽粒大小和千粒重。最初，植物核苷酸堿基編輯僅限于將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，直到2018年有研究[51]報(bào)道了一種改進(jìn)的編輯技術(shù)。它能使原生質(zhì)體中A·T轉(zhuǎn)變?yōu)镚·C的效率達(dá)到7.5%，再生稻和小麥植株中的轉(zhuǎn)化率可達(dá)59.1%，通過(guò)引入功能進(jìn)行突變可直接獲得抗除草劑水稻，并且可以精確編輯所有堿基對(duì)。

目前，雖然CRISPR系統(tǒng)的脫靶問(wèn)題尚未得到徹底解決，但簡(jiǎn)單、高效的優(yōu)勢(shì)使其在細(xì)菌、病毒、動(dòng)物、植物中廣泛應(yīng)用。相信隨著CRISPR系統(tǒng)的不斷改進(jìn)，該技術(shù)在今后的生物學(xué)、農(nóng)學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)⒕哂懈鼮閺V闊的應(yīng)用前景。

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