周佳妮 馬泳泳

[摘要] 目的 探討miR-132對(duì)程序性死亡4基因（PDCD4）的靶向作用，及其在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞黏附介導(dǎo)的耐藥性中的作用。 方法 利用熒光素酶報(bào)告基因分析miR-132對(duì)PDCD4的靶向調(diào)控關(guān)系。對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞株U266進(jìn)行miR模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染，之后比較地塞米松（Dex）、多柔比星（Dox）、硼替佐米（Bort）處理下U266細(xì)胞的藥物敏感性。Transwell法檢測(cè)U266細(xì)胞的遷移能力。MTT法和CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。 結(jié)果 Dex和Dox干預(yù)后細(xì)胞的抑制率顯著上升（P < 0.05），而Bort干預(yù)后細(xì)胞的抑制率無(wú)顯著變化（P > 0.05）。熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果證實(shí)PDCD4是miR-132的靶基因。上調(diào)miR-132可以抑制PDCD4基因和和蛋白的表達(dá)（P < 0.05）。miR-132上調(diào)后U266細(xì)胞的遷移距離顯著增加（P < 0.05）。miR-132上調(diào)后U266細(xì)胞的黏附率和增殖活性顯著增加（P < 0.05）。 結(jié)論 miR-132可以靶向PDCD4調(diào)控多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞黏附介導(dǎo)的耐藥性。

[關(guān)鍵詞] miR-132;程序性死亡4基因;多發(fā)性骨髓瘤;耐藥性;細(xì)胞黏附

[中圖分類號(hào)] R741? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）05（b）-0004-05

The role of miRNA-132 in multiple myeloma cell adhesion mediated drug resistance by targeting PDCD4

ZHOU Jia′ni1? ?MA Yongyong2

1.Department of Hematology， Ningbo Medical Center Li Huili Hospital， Zhejiang Province， Ningbo? ?315000， China; 2.Department of Hematology， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Zhejiang Province， Wenzhou? ?325000， China

[Abstract] Objective To explore the targeting effect of miR-132 on programmed death 4 gene （PDCD4） and its role in the adhesion mediated drug resistance of multiple myeloma cells. Methods Luciferase reporter gene was used to analyze the targeting regulation of miR-132 on PDCD4. Human myeloma cell line U266 was transfected with miR mimic and inhibitor， and then the drug sensitivity of U266 cells treated with Dexamethasone （Dex）， Doxorubicin （Dox） and Bortezomib （Bort） was compared. Transwell method was used to detect the migration ability of U266 cells. MTT and CCK-8 methods were used to detect cell proliferation. Results After Dex and Dox intervention， the inhibition rate of cells increased significantly （P < 0.05）， while the inhibition rate of Bort did not change significantly （P > 0.05）. Luciferase reporter gene analysis confirmed that PDCD4 was the target gene of miR-132. Up regulation of miR-132 could inhibit the expression of PDCD4 gene and protein （P < 0.05）. The migration distance of U266 cells increased （P < 0.05）. After miR-132 was up-regulated， the adhesion rate and proliferation activity of U266 cells increased （P < 0.05）. Conclusion miR-132 can target PDCD4 to regulate multiple myeloma cell adhesion mediated drug resistance.

[Key words] miR-132; Programmed death 4 gene; Multiple myeloma; Drug resistance; Cell adhesion

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）屬于惡性漿細(xì)胞病[1-4]。MicroRNAs（miR）為非編碼小RNA，可參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生，侵襲及轉(zhuǎn)移，耐藥等行為[5-7]。miR-132在MM中鮮有報(bào)道。程序性死亡4基因（programmed cell death 4，PDCD4）屬于抑癌基因，其低表達(dá)水平下降可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。既往研究證實(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路可調(diào)控PDCD4基因參與人子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[8-9]。本研究驗(yàn)證了miR-132與PDCD4靶向調(diào)控的關(guān)系，以及對(duì)U266細(xì)胞生長(zhǎng)及耐藥的影響，具體報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人骨髓瘤細(xì)胞株U266購(gòu)自上海江林生物科技有限公司，培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基（RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清同時(shí)添加雙抗，青霉素100 U/mL，鏈霉素0.1 mg/mL），培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥物抑制試驗(yàn)? U266細(xì)胞先轉(zhuǎn)染miR-132抑制劑（終濃度為100 nmol/L），之后使用地塞米松（Dexamethasone，Dex）50 nmol/L，多柔比星（Doxorubicin，Dox）100 nmol/L，硼替佐米（Bortezomib，Bort）5 nmol/L處理U266細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后檢測(cè)細(xì)胞活性，并計(jì)算抑制率，抑制率=（OD未處理孔-OD加藥孔）/OD未處理孔×100%。

1.2.2 miR模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染? 將U266細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板中，加入含2.5 μL模擬物的100 μL培養(yǎng)基，靜置5 min，加入轉(zhuǎn)染試劑Lipofectmine2000（Invitrogen公司，批號(hào)：33658），靜置20 min，每孔加入800 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，模擬物的終濃度為50 nmol/L，抑制物的終濃度為100 nmol/L。細(xì)胞分組：轉(zhuǎn)染模擬物的細(xì)胞為模擬物組，轉(zhuǎn)染抑制物的細(xì)胞為抑制物組，未做任何處理的細(xì)胞為未處理組，采用PBS作參照的細(xì)胞為PBS組。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)? 用Trizol試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：15596026）提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。每個(gè)樣本重復(fù)3次。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，54℃退火15 s，72℃延伸10 s，收集熒光，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 熒光素酶報(bào)告基因分析? PDCD4的WT或MUT 3′-UTR質(zhì)粒由科雷生物科技有限公司提供。將質(zhì)?？寺≈羛GL3 Basic載體中，將50 nmol/L miR-132模擬物與10 μg PDCD4轉(zhuǎn)染U266細(xì)胞[10]。用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（上海滬震實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：11402HZ60）測(cè)定熒光素酶活性。

1.2.5 細(xì)胞遷移能力檢測(cè)? 使用Transwell侵襲小室（美國(guó)Costar公司，批號(hào)：3422）檢測(cè)U266細(xì)胞的遷移能力。檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.6 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)? 培養(yǎng)U266細(xì)胞懸液接種于96孔板中，培養(yǎng)12 h，加入MTT（美國(guó)Sigma公司，M1218）在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，加入DMSO 200 μL，震蕩10 min。黏附率=A黏附細(xì)胞/A總細(xì)胞×100%。

1.2.7 細(xì)胞活性檢測(cè)? 使用MTT法和CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性。MTT和CCK-8試劑盒均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，批號(hào)分別為M1218和T6522，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.8 Western blot檢測(cè)? 收集細(xì)胞蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育。使用Image QuantTMLAS4000成像系統(tǒng)（美國(guó)GE公司）顯色。本研究以GAPDH作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn);以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 U266細(xì)胞轉(zhuǎn)染模擬物和抑制劑后miR-132的表達(dá)

轉(zhuǎn)染模擬物后U266細(xì)胞中miR-132的表達(dá)顯著升高（圖1A、B）。轉(zhuǎn)染模擬物的U266細(xì)胞中miR-132的表達(dá)顯著升高，而轉(zhuǎn)染抑制劑的U266細(xì)胞中miR-132的表達(dá)顯著降低（P < 0.05）（圖1C）。

A、B：U266細(xì)胞轉(zhuǎn)染模擬物和抑制劑后miR-132的表達(dá)（400×）;C：四組miR-132的相對(duì)表達(dá)水平比較。與PBS組比較，**P < 0.01;與未處理組比較，##P < 0.01;與模擬物組比較，$$P < 0.05

2.2 miR-132表達(dá)水平對(duì)U266細(xì)胞藥物敏感性的影響

在未處理的U266細(xì)胞中，Dex的抑制率為（14.28±0.25）%，Dox的抑制率為（31.05±1.03）%，Bort的抑制率為（28.16±1.04）%;在加入抑制劑的U266細(xì)胞中，Dex的抑制率為（36.24±2.06）%，Dox的抑制率為（42.36±3.16）%，Bort的抑制率為（30.12±1.25）%。與未處理?xiàng)l件下各種藥物的抑制率比較，加入抑制劑的細(xì)胞中Dex和Dox的抑制率顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而Bort的抑制率無(wú)顯著變化（P﹥0.05）。

2.3 miR-132對(duì)PDCD4的靶向作用

Target Scan（www.targetscan.org）預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PDCD4是miR-132的靶基因。PDCD4 3′UTR包含miR-132的保守結(jié)合區(qū)（圖2A）。miR-132模擬物與包含WT-PDCD4的熒光素酶載體共轉(zhuǎn)染后，降低了U266細(xì)胞的活性，熒光素酶活性分別下降66.02%和73.06%（P < 0.05）（圖2B）。miR-132模擬物可以下調(diào)PDCD4基因和蛋白的表達(dá)（P < 0.05）（圖2C、D）。

2.4 miR-132對(duì)PDCD4表達(dá)的影響

抑制miR-132的表達(dá)可顯著上調(diào)PDCD4的mRNA水平（P < 0.05）（圖3A）。抑制miR-132的表達(dá)可顯著上調(diào)PDCD4的蛋白水平（圖3B）。

2.5 不同處理?xiàng)l件下U266細(xì)胞的遷移能力和黏附率比較

miR-132上調(diào)后U266細(xì)胞的遷移距離顯著增加，抑制miR-132表達(dá)可降低U266的遷移距離（P < 0.05）（圖4A、B）。miR-132上調(diào)后U266細(xì)胞的黏附率顯著增加，反之下降（P < 0.05）（圖4C、D）。

2.6 不同處理?xiàng)l件下U266細(xì)胞的增殖活性

與未處理組U266細(xì)胞的增殖活性比較，miR-132上調(diào)后U266細(xì)胞的增殖活性顯著增加，當(dāng)miR-132的表達(dá)受到抑制時(shí)，U266的增殖活性降低（P < 0.05）。見(jiàn)圖5～6。

3 討論

在MM的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，多種miRNA表達(dá)異常[11-14]。miR-132與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在多種疾病中出現(xiàn)異常變化[15-16]，例如Diao等[17]發(fā)現(xiàn)miR-132可通過(guò)調(diào)控其靶基因scn1a和scn2a的表達(dá)參與記憶的過(guò)程。有研究表明[18-19]，miR與腫瘤耐藥相關(guān)。Dex、Dox、Bort是治療MM的常用藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-132表達(dá)下調(diào)可提高U266對(duì)Dex和Dox的耐藥率，而對(duì)Bort的耐藥率無(wú)影響。

PDCD4為抑癌基因，其表達(dá)量降低提示腫瘤患者的不良預(yù)后，因此PDCD4可成為治療腫瘤的新靶點(diǎn)[10]。有研究證實(shí)[20]，miR-132可能通過(guò)抑制PDCD4的表達(dá)參與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的過(guò)程。本研究提示，PDCD4是miR-132的靶基因。抑制miR-132的表達(dá)可顯著上調(diào)PDCD4的mRNA水平和蛋白水平，以此提示miR-132可通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因PDCD4的表達(dá)進(jìn)而參與到腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本研究中使用化學(xué)合成的miR-132的模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染U266細(xì)胞，結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染抑制劑的U266細(xì)胞顯示出較強(qiáng)的遷移能力，且細(xì)胞的黏附能力降低，以此提示抑制miR-132的表達(dá)可降低U266細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，骨髓瘤細(xì)胞中miR-132對(duì)PDCD4有調(diào)控作用，說(shuō)明這可能與PDCD4的參與有關(guān)。

綜上，miR-132在MM的進(jìn)展中起到重要作用，本研究發(fā)現(xiàn)miR-132的下調(diào)可抑制骨髓瘤細(xì)胞的遷移能力和黏附能力。PDCD4是miR-132的靶點(diǎn)。miR-132可能是治療MM的靶點(diǎn)。

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