鄭穎 李小華 李強 張憶雪 陳漠水

[摘要] 目的 探討小檗堿（BBR）對大鼠高血壓左室肥厚心肌表達(dá)miRNA-29b的影響及抑制心肌纖維化的作用機(jī)制。 方法 將25只雄性SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組（Sham組，n = 7），模型組（Model組，n = 9）和模型給藥組（Model+BBR組，n = 9）。腹主動脈縮窄法制備大鼠高血壓心肌肥厚模型，術(shù)后8周測定各組超聲心動圖、心臟肥大指數(shù)，Masson染色檢測心肌組織纖維化，RT-PCR檢測心肌組織miRNA-29b及其靶基因col1α1和col3α1 mRNA表達(dá)。 結(jié)果 Model組的舒張末期室間隔厚度（IVSd）、舒張末期左室后壁厚度（LVPWd）均厚于Sham組，左室長軸縮短分?jǐn)?shù)（FS）、射血分?jǐn)?shù)（EF）均低于Sham組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;Model+BBR組的IVSd、LVPWd均薄于Model組，F(xiàn)S、EF均高于Model組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。Model組的心臟重量顯著重于Sham組，心臟/體重比顯著高于Sham組（P < 0.01）;Model+BBR組的心臟重量輕于Model組，心臟/體重比低于Model組（P < 0.05）。Model組的心肌膠原蛋白體積分?jǐn)?shù)顯著高于Sham組（P < 0.01）;Model+BBR組的心肌膠原蛋白體積分?jǐn)?shù)低于Model組（P < 0.05）。Model組的Col1α1 mRNA和Col3α1 mRNA水平均高于Sham組，miRNA-29b水平低于Sham組（P < 0.05或P < 0.01）;Model+BBR組的Col1α1 mRNA和Col3α1 mRNA水平均低于Model組，miRNA-29b水平高于Model組（P < 0.05）。 結(jié)論 BBR可能通過下調(diào)miRNA-29b水平及上調(diào)其靶基因表達(dá)水平，抑制高血壓心肌肥厚模型心肌肥厚和心肌纖維化。

[關(guān)鍵詞] 小檗堿;心肌肥厚;心肌纖維化;miRNA-29b

[中圖分類號] R-332? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）05（b）-0019-04

Effect of Berberine on the expression of miRNA-29b in left ventricular hypertrophy and the mechanism of inhibition of myocardial fibrosis

ZHENG Ying? ?LI Xiaohua? ?LI Qiang? ?ZHANG Yixue? ?CHEN Moshui

Department of Cardiology， Haikou Hospital Affiliated to Xiangya Medical College of Central South University? Haikou People′s Hospital， Hainan Province， Haikou? ?570208， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Berberine on expression of miRNA-29b in hypertensive left ventricular hypertrophy myocardial tissue and the mechanism of inhibition for myocardial fibrosis. Methods Male SD rats （n = 25） were randomly divided into sham operation group （sham group， n = 7）， model group （model group， n = 9） and model administration group （model+BBR group， n = 9）. Rat model of hypertensive cardiac hypertrophy was established by abdominal aortic coarctation. The cardiac structure and function were measured by echocardiography. The cardiac hypertrophy index was measured at 8 weeks postoperatively. The changes of myocardial fibrosis were detected by Masson staining. The expression of miRNA-29b and its target genes col1α1 and col3α1 mRNA in myocardial tissue were detected by RT-PCR. Results IVSd and LVPWd in model group were thicker than those in sham group， and FS and EF were lower than those in Sham group （P < 0.05）. IVSd and LVPWd of model+BBR group were thinner than those of model group， and FS and EF were higher than those of model group （P < 0.05）. Heart weight of model group was significantly heavier than that of sham group， and heart/body weight ratio was significantly higher than that of sham group （P < 0.01）. Heart weight of model+BBR group was lighter than that of model group， and the heart/body weight ratio was lower than that of model group （P < 0.05）. The volume fraction of myocardial collagen in model group was significantly higher than that in sham group （P < 0.01）. The volume fraction of myocardial collagen in model+BBR group was lower than that in model group （P < 0.05）. The level of col1α1 mRNA and col3α1 mRNA in model group was higher than those in sham group， and the level of miRNA-29b was lower than that in sham group （P < 0.05 or P < 0.01）. The level of col1α1 mRNA and col3α1 mRNA in model+BBR group was lower than those in model group， and the level of miRNA-29b was higher than that in model group （P < 0.05）. Conclusion Berberine inhibits myocardial hypertrophy and myocardial fibrosis by down-regulating miRNA-29b levels and up-regulating its target gene expression.

[Key words] Berberine; Cardiac hypertrophy; Cardiac fibrosis; miRNA-29b

高血壓所致左室肥厚是心肌梗死、心力衰竭及心血管疾病總死亡率的強預(yù)測因子，逆轉(zhuǎn)左室肥厚和心肌纖維化已成為高血壓治療的潛在策略之一[1]。microRNAs（miRNAs）是一種短鏈非編碼RNA，參與以慢性后負(fù)荷增加導(dǎo)致的以心肌肥厚和心肌纖維化為特點的心肌重構(gòu)[2]。小檗堿（BBR）可有效抑制左室肥厚及心肌纖維化，改善心功能[3]。最近研究提示，BBR可能對miRNA-29b有調(diào)控作用，干預(yù)心肌纖維化[4]。本研究通過腹主動脈縮窄法建立大鼠高血壓肥厚心肌模型，探討B(tài)BR對大鼠高血壓左室肥厚心肌形成過程中心肌纖維化的預(yù)防作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性健康SD大鼠25只，體重（200±24）g，SPF級，上海斯萊克實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005。本研究經(jīng)?？谑腥嗣襻t(yī)院生物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

鹽酸小檗堿（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號：B139120）;Masson三色染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，貨號：BA4079B）;Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Primer Set（廣州Ribobio公司，貨號：miRQ0000801-1-2）。

1.3 方法

1.3.1 動物造模及分組給藥

SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成三組：假手術(shù)組（Sham組，n = 7）、模型組（Model組，n = 9）和模型給藥組（Model+BBR組，n = 9）。采用腹主動脈縮窄法制備高血壓大鼠模型[5-7]，以10%水合氯醛腹腔麻醉，在雙腎動脈上段0.5 cm處分離腹主動脈，放置直徑為0.6 mm的小圓棒，用4號手術(shù)絲線將腹主動脈和小圓棒一起結(jié)扎，而后抽出小圓棒使腹主動脈縮窄。Sham組只暴露分離腹主動脈后關(guān)腹腔不做任何處理。Model+BBR組大鼠術(shù)后1周予灌胃給藥，100 mg/（kg·d）。Sham組及Model組予等量生理鹽水灌胃。術(shù)后8周于心尖部分取材，造模成功與否主要參考超聲心動圖，心肌肥大指數(shù)，心肌細(xì)胞橫徑明顯增大，且有心肌細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞核增大、畸形等形態(tài)學(xué)異常，說明造模成功。造模成活大鼠共14只，其中Model組和Model+BBR組各7只。

1.3.2 觀察指標(biāo)

1.3.2.1 超聲心動圖? 術(shù)后8周使用Vevo2100超聲儀探測心臟，于左胸骨旁短切面獲得左心室M型超聲心動圖，測量舒張末期室間隔厚度（IVSd）、舒張末期左室后壁厚度（LVPWd）、左室長軸縮短分?jǐn)?shù)（FS）、射血分?jǐn)?shù)（EF）。

1.3.2.2 心臟肥大指數(shù)? 水合氯醛麻醉，腹主動脈取血處死，迅速開胸取出心臟，用冰浴預(yù)冷生理鹽水洗凈殘血，濾紙吸干心臟并用天平稱取心臟重量，計算心臟肥大指數(shù)=心臟重量/體重×100%。

1.3.2.3 Masson染色檢測心肌間質(zhì)膠原沉積? 采用Image-pro plus 6.0測量心肌膠原蛋白體積分?jǐn)?shù)，即膠原纖維區(qū)所占觀察視野的百分比，每張切片隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行測量，計算其均值，作為心肌纖維化指標(biāo)。

1.3.2.4 RT-PCR檢測心肌組織miRNA-29b及其靶基因的表達(dá)? 采用Generay公司高純總RNA快速提取試劑盒提取心肌組織總RNA，按試劑盒說明書操作，使用qRT-PCR Primer Set檢測大鼠miRNA-29b，Bulge-LoopTM miRNA primer 與miRNA 3′端結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄酶催化逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以U6 snRNA為內(nèi)參照（引物序列見表1），實時熒光定量PCR儀定量miRNA-29b的表達(dá)，熒光定量PCR分析軟件自動進(jìn)行統(tǒng)計和計算，采用相對定量-△△CT法進(jìn)行定量，各反應(yīng)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Dunnett-t方法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠超聲心動圖相關(guān)指標(biāo)比較

Model組的IVSd、LVPWd均厚于Sham組，F(xiàn)S、EF均低于Sham組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;Model+BBR組的IVSd、LVPWd均薄于Model組，F(xiàn)S、EF均高于Model組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.2 各組大鼠心臟肥大指數(shù)相關(guān)指標(biāo)比較

Model組的心臟重量顯著重于Sham組，心臟/體重比顯著高于Sham組（P < 0.01）;Model+BBR組的心臟重量輕于Model組，心臟/體重比低于Model組（P < 0.05）。見表3。

2.3 各組大鼠心肌纖維化情況比較

Masson染色顯示血管和心肌中的膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色。各組大鼠心肌纖維化情況見圖1（封四）。Model組的心肌膠原蛋白體積分?jǐn)?shù)顯著高于Sham組（P < 0.01）;Model+BBR組的心肌膠原蛋白體積分?jǐn)?shù)低于Model組（P < 0.05）。見表4。

2.4 各組大鼠心肌組織miRNA-29b及其靶基因的表達(dá)水平比較

Model組的Col1α1 mRNA和Col3α1 mRNA水平均高于Sham組，miRNA-29b水平低于Sham組（P < 0.05或P < 0.01）;Model+BBR組的Col1α1 mRNA和Col3α1 mRNA水平均低于Model組，miRNA-29b水平高于Model組（P < 0.05）。見圖2。

3 討論

以心臟成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積為特征的心肌纖維化也已被證明在高血壓引起的心力衰竭的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[8-9]。故延緩或逆轉(zhuǎn)心肌肥厚和心肌纖維化成為治療高血壓、預(yù)防心力衰竭的潛在策略，是近年來高血壓防治領(lǐng)域最具吸引力的治療目標(biāo)和新熱點。

研究顯示，miRNAs可調(diào)節(jié)心肌肥大、纖維化，對心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展有重要影響，是心血管疾病潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點[10-11]。目前已明確其作用機(jī)制主要與TGF-β1/Smad信號通路[12]及腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)介導(dǎo)[13]等密切相關(guān)。朱珂等[14]發(fā)現(xiàn)，扶正化瘀方抗心肌纖維化的作用可能與其抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖，并促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的凋亡及miRNA-29b-5p表達(dá)有關(guān)。也有學(xué)者認(rèn)為，miRNA-29b通過激活Notch信號通路抑制心肌纖維化和心肌肥厚，保護(hù)心肌細(xì)胞發(fā)展為心肌梗死[15]。

BBR對壓力誘導(dǎo)的心肌肥厚及心肌損傷有顯著的治療作用[2，16-19]，其作用機(jī)制可能與BBR通過上調(diào)心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞miRNA-29b的表達(dá)有關(guān)[20]。本實驗發(fā)現(xiàn)8周后大鼠IVSd和LVPWd顯著增加，Model+BBR組較Model組心室厚度顯著減輕，提示BBR能夠顯著抑制心肌肥厚;大鼠心臟重量和心體比明顯縮小，Masson染色發(fā)現(xiàn)大鼠心肌纖維化程度明顯減輕，提示BBR能抑制大鼠高血壓心肌肥厚和左室纖維化。故本研究采用腹主動脈縮窄法致大鼠心肌肥厚模型提示BBR可以顯著抑制大鼠高血壓心肌肥厚和心肌纖維化。

大鼠高血壓心肌肥厚模型心肌組織miRNA-29b水平顯著降低，miRNA-29b靶基因col1α1和col3α1 mRNA水平明顯增加，而BBR治療后可以顯著上調(diào)其心肌組織miRNA-29b水平，降低miRNA-29b靶基因col1α1和col3α1 mRNA水平，提示BBR的抗心肌肥厚和心肌纖維化的機(jī)制可能與其對miRNA-29b水平的調(diào)節(jié)有關(guān)。這與Zhu等[20]的研究結(jié)果基本相似。

綜上所述，本研究在細(xì)胞及動物模型水平上提示了BBR對心肌肥厚的抑制作用，為心肌肥厚與纖維化疾病的治療提供新的治療靶點。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? 張慧閣，鄭榮果，任紅欣.阿托伐他汀逆轉(zhuǎn)原發(fā)性高血壓患者左心室心肌肥厚臨床研究[J].中國藥業(yè)，2018，27（24）：71-73.

[2]? Werfel S，Leierseder S，Ruprecht B，et al. Preferential microRNA targeting revealed by in vivo competitive binding and differential Argonaute immunoprecipitation [J]. Nucleic Acids Res，2017，45（17）：10218-10228.

[3]? Liao Y，Chen K，Dong X，et al. Berberine inhibits cardiac remodeling of heart failure after myocardial infarction by reducing myocardial cell apoptosis in rats [J]. Exp Ther Med，2018，16（3）：2499-2505.

[4]? Ckv N，Macedo CT，Brr C，et al. Circulating miRNAs as potential biomarkers associated with cardiac remodeling and fibrosis in chagas disease cardiomyopathy [J]. Int J Mol Sci，2019，20（16）：E4064.

[5]? 劉靜，崔海峰，李思耐，等.壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠舒張性心力衰竭模型的改良及效果探討[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2017，46（1）：34-38，52.

[6]? 劉成芳，劉繼斌，王瑾，等.心肌內(nèi)向整流鉀電流激動劑扎考比利對腹主動脈縮窄大鼠心功能和心肌纖維化的作用[J].中國循環(huán)雜志，2019，34（6）：606-611.

[7]? 梁悅，張光濤，湯曉萌，等.壓力超負(fù)荷致心肌肥厚形成過程中收縮壓和心重指數(shù)的變化[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2017， 14（14）：16-19.

[8]? Travers JG，Kamal FA，Robbins J，et al. Cardiac fibrosis：the fibroblast awakens [J]. Circ Res，2016，118（6）：1021-1040.

[9]? Kong P，Christia P，F(xiàn)rangogiannis NG. The pathogenesis of cardiac fibrosis [J]. Cell Mol Life Sci，2014，71（4）：549-574.

[10]? 唐青，邢曉為，黃利華，等.miRNA在高血壓疾病中的應(yīng)用及調(diào)控機(jī)制[J].中華高血壓雜志，2013，21（2）：121-126.

[11]? Moghaddam AS，Afshari JT，Esmaeili SA，et al. Cardioprotective microRNAs：lessons from stem cell-derived exosomal microRNAs to treat cardiovascular disease [J]. Atherosclerosis，2019，285：1-9.

[12]? 張國華.TGF-β1/Smads信號通路在高血壓心肌纖維化中的調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥，2014，54（7）：85-87.

[13]? Syed M，Ball JP，Mathis KW，et al. MicroRNA-21 ablation exacerbates aldosterone-mediated cardiac injury，remodeling，and dysfunction [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab，2018，315（6）：E1154-E1167.

[14]? 朱珂，婁利霞，高永紅，等.扶正化瘀方對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞miR-29b-5p表達(dá)的影響[J].醫(yī)學(xué)綜述，2019，25（13）：2689-2694.

[15]? Liu Y，Wang H，Wang X，et al. MiR-29b inhibits ventricular remodeling by activating notch signaling pathway in the rat myocardial infarction model [J]. Heart Surg Forum，2019，22（1）：E19-E23.

[16]? 于怡卉，李明慧，張瑤俊，等.小檗堿對壓力負(fù)荷所致心肌肥厚大鼠的保護(hù)作用[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2015，35（1）：40-45.

[17]? 王小英，林佳，潘競鏘.小檗堿及同系物抑制心肌肥厚和心室重構(gòu)的藥理作用[J].今日藥學(xué)，2012，22（1）： 46-50.

[18]? 王英偉，李秀東，孫明君，等.小檗堿對力竭運動誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷具有保護(hù)作用[J].中華心血管病雜志，2019， 47（8）：647-652.

[19]? Dong S，Zhang S，Chen Z，et al. Berberine could ameliorate cardiac dysfunction via interfering myocardial lipidomic profiles in the rat model of diabetic cardiomyopathy [J]. Front Physiol，2018，9：1042.

[20]? Zhu ML，Yin YL，Ping S，et al. Berberine promotes ischemia-induced angiogenesis in mice heart via upregulation of microRNA-29b [J]. Clin Exp Hypertens，2017，39（7）：672-679.

（收稿日期：2019-09-30? 本文編輯：李亞聰）