張銀冰

摘 ?要：電致化學(xué)發(fā)光分析法兼有電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光分析法的雙重優(yōu)勢，具有靈敏度高、線性范圍寬、反應(yīng)可控性強(qiáng)、背景干擾小、選擇性好和儀器簡單等優(yōu)點(diǎn)，己經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物分子的檢測以及疾病的診斷等方面。生物傳感器是由生物識別元件和物理化學(xué)信號傳感系統(tǒng)組成的分析設(shè)備，可方便地進(jìn)行生物分析檢測。本論文對基因組DNA羥甲基電致化學(xué)發(fā)光生物傳感研究進(jìn)展現(xiàn)狀，進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：基因組;DNA羥甲基化;電化學(xué)發(fā)光;生物傳感器

電化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence），它不但有著英文縮寫名稱，還有另外一個名為電致化學(xué)發(fā)光（Electrogeneratedchemiluminescence）名稱。ECL是將電壓以及電流經(jīng)過電極施加到化學(xué)發(fā)光物質(zhì)上促進(jìn)某種新物質(zhì)的衍生，該物質(zhì)和發(fā)光物質(zhì)會產(chǎn)生反應(yīng)，供應(yīng)充足的能量來改變發(fā)光物質(zhì)的狀態(tài)，讓其從原本的基態(tài)變成了后來的激發(fā)態(tài)，在重新回到基態(tài)，經(jīng)過這樣的改變，給發(fā)光供應(yīng)足夠的能量;亦或是將電壓以及電流經(jīng)過電極的方式供應(yīng)能量，讓發(fā)光物質(zhì)可以產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)，讓中間態(tài)物質(zhì)在不穩(wěn)定的狀態(tài)下出現(xiàn)分解，供應(yīng)能量促使發(fā)光。[1]所以，利用酶切來刪掉甲基基團(tuán)，這是不可缺少的。這一點(diǎn)也是生物學(xué)家最關(guān)注的問題。人體內(nèi)的細(xì)胞有時為了再次分化，或許會對已經(jīng)分化后的細(xì)胞再一次進(jìn)行分化，一直分化到最低的狀態(tài)為止，這個過程就是刪除甲基化的環(huán)節(jié)，分析這個過程，對于醫(yī)療運(yùn)用來說有著難以言喻的價值。

1DNA羥甲基化

1948年人們第一次從人類DNA中識別出了被稱為DNA“第五個堿基”的5-甲基胞嘧啶（5-mC）。在真核生物中，DNA甲基化是在C-5位的胞嘧啶環(huán)上添加一個甲基后形成的。這個過程是在被稱為“CpG島”的y-CG-3^？列中經(jīng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化后發(fā)生的。5-mC是最常見的真核生物DNA修飾，也是許多表觀遺傳（只改變基因表達(dá)，而不改變核苷酸序列）現(xiàn)象的一種。[2]雖然甲基化DNA在植物和哺乳動物中分布廣泛，但在一些真核生物，比如果蠅和釀酒酵母中并未檢測到甲基化DNA^-84〗。于是，人們開始懷疑其在正常發(fā)育和特異性基因表達(dá)中的重要性。然而，最近的研宂表明，在敲除轉(zhuǎn)基因小鼠中對DNA甲基化起重要作用的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因后，小鼠發(fā)育異常和胚胎致死的表達(dá)水平仍然下降，這就消除了人們之前的懷疑。[3]

DNA甲基化整體調(diào)控中的一個關(guān)鍵步驟是DNA去甲基化。用甲基敏感性內(nèi)切酶監(jiān)測DNA甲基化水平后發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育過程中，移植前的胚胎甲基化水平很低之后許多CPG島殘基發(fā)生再甲基化，但在移植時，剩余的CpG島并未發(fā)生甲基化。胚胎植入后，許多DNA被甲基化，而組織特異性（Tissue-specific）基因在其相應(yīng)的表達(dá)組織中卻發(fā)生去甲基化。因此，對于生物的整個基因組DNA來甲基化模式是表觀遺傳信息的重要組成部分，是區(qū)分細(xì)胞的重要標(biāo)記物。5-甲基胞嘧啶（5-mC）通常被認(rèn)為是DNA的“第五個堿基”。在受精和胚胎發(fā)育后，大量輸甲基化標(biāo)記物被刪除這使得胚胎干細(xì)胞能分化成任何可能的專職細(xì)胞。在某些情況下，DNA的去甲基化發(fā)生時沒有細(xì)胞分裂，也就沒有合成新的DNA。因此，甲基基團(tuán)必須通過酶切主動地去除。主動去甲基化機(jī)制是人們最感興趣的，因?yàn)橐恍┘?xì)胞為了重新分化，有可能主動進(jìn)行DNA去甲基化換句話說，將己經(jīng)分化的細(xì)胞進(jìn)行再分化，轉(zhuǎn)變?yōu)楦头只癄顟B(tài)的過程，就是主動去甲基化，這在醫(yī)療應(yīng)用方面由很大的研究價值。說，肯定存在一種去除DNA中甲基胞嘧啶的方式。

2電致化學(xué)發(fā)光

最近幾年，由于電化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)的優(yōu)勢不斷的顯露，人們開始重視電化學(xué)發(fā)光檢測方式的運(yùn)用，比如，其有著較高的靈敏性，操作流程簡單、反應(yīng)迅速、節(jié)省試劑等。這些都是電化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)最顯著的優(yōu)點(diǎn)，它的出現(xiàn)促進(jìn)了生物分析的發(fā)展，大大的提升了檢測生物分子的效率和質(zhì)量，并且日漸普遍。一直以來，生物學(xué)家都在尋找研究DNA去甲基轉(zhuǎn)移酶活性的問題，也有不少的生物學(xué)家來不斷的檢測羥甲基化DNA，自從電化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)衍生后，生物學(xué)家找到來一個合適的分析和檢測平臺。

電致化學(xué)發(fā)光（ECL）分析法無論是從電化學(xué)的角度來說亦或是從化學(xué)發(fā)光分析法的角度來說，都是有著顯著的優(yōu)勢的，它有著較高的靈敏性，反應(yīng)快，范圍廣，干擾性低，好選擇以及操作便利等等，這些都對研究有著很大的幫助。如今，電致化學(xué)發(fā)光（ECL）分析法在醫(yī)療領(lǐng)域開始普遍使用，其中運(yùn)用最多的就是檢測生物分子，診斷患者的病情等等，可是學(xué)者對ECL分析法分析的成果不多，特別是檢測5-hmC更是少之又少。

3電化學(xué)發(fā)光DNA生物傳感器

生物傳感中的傳感系統(tǒng)涉及各種檢測器，如壓電，光學(xué)，電化學(xué)，電化學(xué)發(fā)光等。生物傳感方法近幾十年來蓬勃發(fā)展，為臨床早期診斷帶來了重大突破。商業(yè)化和臨床應(yīng)用的生物傳感器應(yīng)該具有穩(wěn)定、快速、高靈敏和廉價的特點(diǎn)。在對生物傳感有貢獻(xiàn)的技術(shù)中，電化學(xué)發(fā)光由于具有電勢可控和靈敏度高的雙重優(yōu)勢，引起了人們的廣泛關(guān)注。電化學(xué)發(fā)光生物傳感是將特異性識別物質(zhì)如抗體、酶、DNA等固定在電極上而組成的分析元件，通過目標(biāo)分析物結(jié)合前后電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化來進(jìn)行定量檢測，廣泛應(yīng)用于生物分析，免疫分析，食品安全和環(huán)境監(jiān)測等。其中，DNA是生物體遺傳信息的主要載體，引導(dǎo)生物發(fā)育與生命機(jī)能運(yùn)作，電化學(xué)發(fā)光DNA生物傳感器結(jié)合了生物識別的特異性及ECL的高靈敏性，為DNA分析提供了一種很有前景的方法，越來越多的研究者致力于電化學(xué)發(fā)光DNA生物傳感的研究。

許多DNA檢測體系基于目標(biāo)DNA與其互補(bǔ)探針的雜交，Li等報(bào)道了一種電化學(xué)發(fā)光生物傳感方法檢測DNA甲基化，該方法結(jié)合酶聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了對DNA甲基化水平的高靈敏檢測。[5]然而，該方法需要對目標(biāo)分析物進(jìn)行標(biāo)記，使得分析過程比較復(fù)雜。Zhang等使用發(fā)夾DNA作為識別元件，以釕復(fù)合物作為信號物質(zhì)，構(gòu)建了一種用于檢測靶單鏈DNA（ss-DNA）的高選擇性ECL生物傳感器。該ECL方法具有較高的靈敏度和很好的選擇性，并且不需要對目標(biāo)分析物進(jìn)行記。[6]

結(jié)束語

電化學(xué)發(fā)光分析法結(jié)合了發(fā)光分析高靈敏度和電化學(xué)電位可控等優(yōu)點(diǎn)，引起了諸多分析化學(xué)工作者的關(guān)注。電化學(xué)發(fā)光生物傳感器是將特異性分子識別物質(zhì)如酶、抗體或DNA等生物分子作為分子識別物質(zhì)固定在換能器上，以電化學(xué)發(fā)光信號為檢測信號的分析器件，其具有靈敏度髙、線性范圍寬、反應(yīng)可控性強(qiáng)、成本低廉、分析速度快、操作簡單和易于微型化與集成化等優(yōu)點(diǎn)，己經(jīng)被用于一些疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物檢測。但是目前一些低水平的生物標(biāo)志物檢測仍然是電化學(xué)發(fā)光生物傳感器面臨的一大挑戰(zhàn)。近年來，具有優(yōu)異性質(zhì)的不同結(jié)構(gòu)、組成和形貌的納米材料的引入促進(jìn)了電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的發(fā)展，大大提髙了其檢測的靈敏度和選擇性。

參考文獻(xiàn)

[1] ?馬鼻肺炎病毒進(jìn)化分析及DNA條形碼的確定[J].鄭小龍，王群，孫明君，孫濤，朱來華，梁成珠，岳志芹.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào).2017（02）

[2] ?DNA步行者分子機(jī)器研究新進(jìn)展[J].汪晶，王東霞，馬嘉懿，孔德明.中國科學(xué)：化學(xué).2019（05）

[3] ?1種簡單有效的根際土壤微生物DNA提取方法[J].鄭道君，張冬明，吉清妹，史珍萍，符傳良.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué).2017（04）

[4] ?DNA：FromCarrierofGeneticInformationtoPolymericMaterials[J].JiaojiaoZhang，F(xiàn)engLi，DayongYang.TransactionsofTianjinUniversity.2019（04）

[5] ?超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)在高通量測序片段化DNA中的應(yīng)用[J].李根亮，盧舒雨，許苡僥，黃捷，黃曉敏，肖娟，農(nóng)嵩.右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào).2016（05）

[6] ?DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)探尋路上競爭中的合作[J].張翮.自然辯證法通訊.2017（03）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.21575109）