梁鈺昕, 趙 容, 梁馨月, 方曉紅

(中國科學(xué)院化學(xué)研究所, 分子納米結(jié)構(gòu)與納米技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京分子科學(xué)國家研究中心, 北京 100190)

細(xì)胞作為生命的基本結(jié)構(gòu)和功能單位, 需要時(shí)刻響應(yīng)外界環(huán)境變化, 并正確做出存亡、 增殖、 分化和遷移等一系列決策[1]. 細(xì)胞決策依賴于復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[2]. 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起始于細(xì)胞膜上的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白, 這些膜蛋白在接收到細(xì)胞外的刺激信號(hào)后, 會(huì)發(fā)生構(gòu)象、 聚集狀態(tài)及動(dòng)力學(xué)行為等的改變, 然后通過細(xì)胞內(nèi)下游效應(yīng)蛋白將信號(hào)傳遞并放大, 進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)基因的表達(dá). 膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的基因突變和異常表達(dá)等變化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常, 這與許多疾病的發(fā)生、 發(fā)展密切相關(guān)[3,4], 研究這些膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能不僅有助于揭示細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制, 還能促進(jìn)這些疾病相關(guān)藥物的開發(fā).

近年來, 熒光成像尤其是單分子熒光成像技術(shù)對(duì)生命化學(xué)的發(fā)展起到了重要的推動(dòng)作用, 實(shí)現(xiàn)了無損、 原位、 高時(shí)空分辨地在活細(xì)胞中研究各種生理病理過程. 系綜方法只能檢測大量分子的平均行為, 而單分子熒光成像則可在生物體系中原位、 實(shí)時(shí)觀測單個(gè)目標(biāo)分子, 從而揭示掩蓋在群體行為下生物分子的非均一性及動(dòng)態(tài)變化. 對(duì)于細(xì)胞膜上的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白, 采用單分子成像方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)膜蛋白激活、 內(nèi)吞及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等過程的實(shí)時(shí)定量研究, 為深入研究其功能和調(diào)控機(jī)制提供了新工具[5,6].

本文結(jié)合課題組的研究工作, 介紹了活細(xì)胞單分子熒光成像分析方法, 并綜述了近年來膜蛋白單分子成像在研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機(jī)制以及藥物作用中的新進(jìn)展.

1 單分子熒光成像方法

1.1 單分子熒光顯微鏡

19世紀(jì)后出現(xiàn)的熒光顯微鏡憑借其靈敏度高、 對(duì)活細(xì)胞干擾小等優(yōu)勢, 成為生命化學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具. 2000年, Yanagida等[7]和Schindler等[8]首次在活細(xì)胞的細(xì)胞膜上觀察到單個(gè)表皮生長因子受體(EGFR)的二聚化和單個(gè)脂類分子的運(yùn)動(dòng). 隨后, 活細(xì)胞單分子熒光成像技術(shù)不斷發(fā)展, 并廣泛應(yīng)用于多種生化過程的研究[9].

單個(gè)分子的熒光信號(hào)弱, 因此, 提升信噪比(S/N)是單分子成像技術(shù)的關(guān)鍵. 為了提高信噪比, 一方面需要盡可能多收集信號(hào), 另一方面則要降低背景及噪音. 細(xì)胞的自發(fā)熒光是背景的主要來源之一, 減小激發(fā)/檢測體積可以有效降低背景信號(hào). 全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRFM)可以將激光的照明體積限制在細(xì)胞膜區(qū), 而不會(huì)激發(fā)細(xì)胞內(nèi)部的分子, 因此可以獲得高信噪比的熒光圖像, 從而使TIRFM成為細(xì)胞膜蛋白單分子成像中最常使用的顯微鏡. 全內(nèi)反射熒光成像利用了全內(nèi)反射原理, 一束入射光線經(jīng)過光密介質(zhì)照射至光疏介質(zhì), 當(dāng)入射角大于臨界角時(shí), 入射光線在界面處會(huì)發(fā)生全內(nèi)反射現(xiàn)象, 但此時(shí)仍有一部分光以隱逝波的形式穿過界面進(jìn)入光疏介質(zhì), 隱逝波的強(qiáng)度會(huì)隨著穿透深度以指數(shù)形式衰減. 相較于一般的寬場熒光顯微鏡, 全內(nèi)反射熒光顯微鏡只激發(fā)靠近界面100～200 nm處的熒光分子[10], 信噪比顯著提高(見圖1). 細(xì)胞成像中常使用的是物鏡式全內(nèi)反射熒光顯微鏡, 這種光路結(jié)構(gòu)可以通過物鏡直接形成隱逝場, 致使只有處于界面即細(xì)胞膜附近的熒光分子才被激發(fā), 其被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞膜單分子研究中[11,12].

Fig.1 Principles of objective-type TIRFM

近年來, 研究人員又研發(fā)了基于TIRFM的新成像模式. 如果希望觀察細(xì)胞膜內(nèi)稍深處的分子, 可以調(diào)整激發(fā)光的入射角度, 使之稍小于臨界角, 這種成像模式被稱為半-全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)(quasi-TIRFM)[13,14]. 雖然這種模式的照明體積與TIRFM相比有所提升, 但由于激發(fā)光傾斜著穿過細(xì)胞, 故細(xì)胞深處的熒光分子不會(huì)被激發(fā), 仍能在保持較高信噪比的條件下實(shí)現(xiàn)單分子成像. 本課題組[15]發(fā)展了一種結(jié)合TIRFM和quasi-TIRFM的成像方法. 通過在2種模式之間切換激發(fā)光的照明深度, 可以觀察到細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜上的過程. 最近, Fu等[16]報(bào)道了一種多角度TIRFM. 該方法利用隱逝波深度與激發(fā)光角度相關(guān)的原理, 逐步改變隱逝波的穿透深度, 通過一系列成像-光漂白過程, 可以實(shí)現(xiàn)界面附近250 nm的三維縱向超分辨成像, 縱向分辨率達(dá)到20 nm.

TIRFM成像受到衍射極限的限制, 無法區(qū)分高密度成像時(shí)距離小于200 nm的點(diǎn). 近年來出現(xiàn)的光活化定位顯微術(shù)(PALM)、 隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微術(shù)(STORM)及受激輻射損耗顯微術(shù)(STED)等成像技術(shù), 實(shí)現(xiàn)了突破衍射極限的超分辨熒光成像[17]. 目前, 已有越來越多的報(bào)道將超分辨熒光顯微鏡用于單分子成像分析[18～20]. 此外, 原子力顯微鏡(AFM)與單分子熒光成像聯(lián)用可以同時(shí)獲得光學(xué)和力學(xué)信息, 在活細(xì)胞單分子研究中也將發(fā)揮重要應(yīng)用[21].

1.2 熒光探針與標(biāo)記方法

熒光蛋白是生物成像中應(yīng)用最廣泛的一類熒光標(biāo)記物. 熒光蛋白由基因編碼, 可以通過基因工程方便地將熒光蛋白與目標(biāo)蛋白融合表達(dá), 實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白特異性的標(biāo)記. 從最早發(fā)現(xiàn)的綠色熒光蛋白, 到目前已發(fā)展出的一系列具有不同發(fā)射波長的熒光蛋白[22], 均為實(shí)現(xiàn)多色熒光成像提供了重要工具[23]. 對(duì)細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行單分子研究要求熒光蛋白的亮度高且不傾向于形成寡聚體, 要實(shí)現(xiàn)對(duì)膜蛋白的長時(shí)間動(dòng)態(tài)追蹤, 還要求熒光蛋白具有良好的光穩(wěn)定性. 目前, 已有商品化的mNeonGreen[24], mRuby3[25]和mScarlet[26]等高亮度單體熒光蛋白可供選擇. 傳統(tǒng)的熒光蛋白標(biāo)記方法是在細(xì)胞中導(dǎo)入外源熒光蛋白-目標(biāo)蛋白融合基因, 但是這類外源導(dǎo)入的方法存在難以反映細(xì)胞內(nèi)蛋白真實(shí)表達(dá)水平的問題. 利用基因編輯方法可以直接將熒光蛋白基因連接在內(nèi)源目標(biāo)蛋白基因上, 從而分析細(xì)胞內(nèi)源目標(biāo)蛋白. 最近出現(xiàn)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則設(shè)計(jì)sgRNA靶向編輯目標(biāo)基因[27,28], 大大簡化了基因編輯方法, 已經(jīng)被越來越多地用于單分子熒光成像標(biāo)記[29].

有機(jī)熒光染料是另一類生物成像領(lǐng)域常用的熒光探針[30,31]. 相較于熒光蛋白, 有機(jī)小分子染料具有分子量小、 亮度高及光穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn). 商業(yè)化的ATTO, Alexa Flour和CyDyes系列染料均已被應(yīng)用于單分子成像[32]. 雖然有機(jī)小分子染料的光物理性質(zhì)優(yōu)異, 但存在難以透過細(xì)胞膜和非特異性吸附等問題[33]. 近期發(fā)展的硅-羅丹明和JF系列染料擁有良好的細(xì)胞膜穿透性, 且亮度高、 光穩(wěn)定性強(qiáng), 被越來越多地應(yīng)用在單分子成像和追蹤中[34,35]. 不同于可基因編碼的熒光蛋白, 有機(jī)小分子染料需要通過一些特異性反應(yīng)才能標(biāo)記在目標(biāo)蛋白質(zhì)上, 常用的有Halo, SNAP和Clip自標(biāo)記標(biāo)簽蛋白[36,37]. 先將這類基因編碼的蛋白標(biāo)簽融合到目標(biāo)蛋白上, 再加入可以與標(biāo)簽蛋白特異性反應(yīng)的帶有染料的標(biāo)簽配體即可完成標(biāo)記. 然而, 這類蛋白標(biāo)簽的大小與熒光蛋白相當(dāng), 可能會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白產(chǎn)生干擾. 另一個(gè)選擇是使用非天然氨基酸標(biāo)記[38,39]. 將標(biāo)簽的長度縮小至1個(gè)氨基酸, 通過對(duì)目標(biāo)蛋白的某一個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變, 可在目標(biāo)蛋白上插入帶有疊氮基或炔基等生物正交反應(yīng)官能團(tuán)的非天然氨基酸, 結(jié)合點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng), 將染料特異性標(biāo)記在目標(biāo)蛋白的特定位點(diǎn)[40,41]. 本課題組[40]首次報(bào)道在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中將非天然氨基酸用于單分子成像標(biāo)記, 觀察到細(xì)胞膜上受體更接近生理狀態(tài)的單分子行為.

納米技術(shù)的發(fā)展使各種熒光納米顆粒逐漸應(yīng)用到生物成像中, 如量子點(diǎn)(QDs)[42,43]、 碳點(diǎn)(CDs)[44]、 聚集誘導(dǎo)發(fā)光納米顆粒(AIE NPs)[45]、 熒光納米鉆石(FNDs)[46]、 上轉(zhuǎn)換納米顆粒(UCNPs)[47]和半導(dǎo)體聚合物點(diǎn)(PDs)[48]等. 熒光納米顆粒用于單分子成像的優(yōu)勢在于, 其高亮度可以使成像系統(tǒng)在很短時(shí)間內(nèi)收集到足夠多的光子, 從而提高單分子成像的空間和時(shí)間分辨率. 目前已有報(bào)道可以在數(shù)十毫秒的時(shí)間分辨率下達(dá)到小于5 nm的空間分辨率[49]. 熒光納米顆粒的另一個(gè)優(yōu)勢是光穩(wěn)定性好, 本課題組[48]研制了具有強(qiáng)抗光漂白性能的半導(dǎo)體聚合物點(diǎn), 作為STED超分辨成像的新型納米探針, 實(shí)現(xiàn)了連續(xù)2 h的活細(xì)胞成像. 雖然納米顆粒的亮度和光穩(wěn)定性優(yōu)于有機(jī)小分子染料, 但粒徑較大. 進(jìn)一步減小熒光納米顆粒的尺寸, 并通過優(yōu)化表面修飾方法提高其活細(xì)胞標(biāo)記能力, 熒光納米顆粒有望更廣泛應(yīng)用于活細(xì)胞單分子成像.

1.3 數(shù)據(jù)分析

受到衍射極限的限制, 一個(gè)理想物點(diǎn)經(jīng)過光學(xué)系統(tǒng)成像得到的是一個(gè)艾里斑. 通常使用的光學(xué)顯微鏡分辨率約為200 nm, 遠(yuǎn)大于單個(gè)生物分子. 因此, 需要通過一些算法識(shí)別圖像中微弱的單分子熒光信號(hào)并對(duì)其進(jìn)行精確定位. 單分子檢測和定位算法可以將圖像中的信號(hào)分子從背景中區(qū)分出來, 并通過對(duì)其熒光分布進(jìn)行擬合來確定該分子的中心位置. 而單分子追蹤算法可以將連續(xù)圖像中相鄰時(shí)刻相關(guān)性最高的點(diǎn)連結(jié)起來, 得到目標(biāo)分子位置隨時(shí)間的變化曲線, 即單分子軌跡. 目前, 已經(jīng)發(fā)展了多種構(gòu)建單分子軌跡的算法[50,51], 相較于簡單關(guān)聯(lián)最臨近點(diǎn)的算法, 基于全局優(yōu)化的追蹤算法通常有更好的表現(xiàn)[52].

經(jīng)上述算法處理后, 可得到目標(biāo)分子在一段時(shí)間內(nèi)的位置及熒光強(qiáng)度信息. 但是, 如何從大量單分子數(shù)據(jù)中提取目標(biāo)分子的行為特征并與其生物學(xué)功能相聯(lián)系, 還需要進(jìn)一步發(fā)展分析方法. 近年來, 關(guān)于蛋白質(zhì)化學(xué)計(jì)量比以及分子間相互作用動(dòng)力學(xué)的單分子數(shù)據(jù)分析方法得到了快速發(fā)展.

膜蛋白的激活與其聚集計(jì)量比息息相關(guān), 定量表征膜蛋白的聚集狀態(tài)對(duì)了解信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起始階段具有重要意義. 研究膜蛋白聚集狀態(tài)最常用的單分子方法是熒光強(qiáng)度分布分析和光漂白步數(shù)分析. 熒光強(qiáng)度分布分析首先需要統(tǒng)計(jì)大量單分子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度分布, 理論上蛋白復(fù)合物的聚集程度越高, 其對(duì)應(yīng)的單分子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度越大. 參照單個(gè)熒光分子的強(qiáng)度分布, 對(duì)聚集體的熒光強(qiáng)度分布進(jìn)行多峰高斯函數(shù)擬合, 可以獲得不同聚集程度的聚集體的比例[53]. 熒光漂白步數(shù)分析則是需要分析一段時(shí)間內(nèi)單分子點(diǎn)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化曲線[54]. 一個(gè)蛋白復(fù)合物內(nèi)多個(gè)熒光分子被同時(shí)漂白的幾率較小, 而是在不同的時(shí)間被分步漂白, 呈現(xiàn)出熒光強(qiáng)度臺(tái)階式下降, 理論上臺(tái)階數(shù)目就代表著蛋白復(fù)合物的聚集程度.

由于單分子熒光信號(hào)較弱, 熒光團(tuán)自身的閃爍效應(yīng)以及細(xì)胞成像體系的背景干擾均給單分子漂白曲線的臺(tái)階識(shí)別帶來很大困難. 因此, 熒光漂白步數(shù)分析法需要準(zhǔn)確、 客觀且高效的自動(dòng)數(shù)據(jù)處理算法[55]. 目前, 基于隱馬爾可夫模型(HMM)的算法已被用于熒光漂白步數(shù)分析中, 但是單分子漂白曲線這類較短的時(shí)間序列很難訓(xùn)練HMM使其收斂到全局最優(yōu)點(diǎn). 本課題組[56]開發(fā)了一種結(jié)合最大似然估計(jì)和HMM的算法以解決這個(gè)問題. 同時(shí), 上述方法均需要用戶預(yù)設(shè)參數(shù), 這些參數(shù)會(huì)極大程度地影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性, 而且這類參數(shù)往往很難合理地預(yù)先設(shè)置. 本課題組[55]近期發(fā)展了一種無需預(yù)設(shè)參數(shù)、 基于深度學(xué)習(xí)框架的單分子光漂白步數(shù)分析算法(CLDNN), 與以往的算法相比, CLDNN不僅具有更高的準(zhǔn)確度, 而且效率提高了2個(gè)數(shù)量級(jí)(見圖2).

Fig.2 Architecture of CLDNN(A), the analysis accuracies of CLDNN and HMM to the synthesized data sets with different aSNRs(B) and the true distribution and outputted distributions of bleaching steps analyzed by different algorithms(C)[55] Copyright 2019, American Chemical Society.

通過對(duì)細(xì)胞上膜蛋白的單分子運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行分析, 可以定量表征其動(dòng)力學(xué)行為. 由于膜蛋白的擴(kuò)散受其構(gòu)象、 相互作用分子、 所處微環(huán)境以及跨膜區(qū)尺寸的影響, 在細(xì)胞內(nèi)外刺激因素的作用下, 膜蛋白會(huì)響應(yīng)刺激發(fā)生各種擴(kuò)散行為的改變, 同時(shí)調(diào)節(jié)下游信號(hào). 因此, 表征膜蛋白的擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)行為對(duì)于了解其功能和調(diào)控機(jī)制均具有重要作用. 傳統(tǒng)的方法是分析均方位移(MSD)[57], 由MSD-Δt曲線可以得到目標(biāo)分子的擴(kuò)散類型及擴(kuò)散系數(shù), 但是MSD分析丟失了單個(gè)分子擴(kuò)散狀態(tài)隨時(shí)間變化的信息. 近年來, 基于HMM的方法被用于分析擴(kuò)散位移隨時(shí)間變化的曲線, 實(shí)現(xiàn)了從單個(gè)分子運(yùn)動(dòng)軌跡數(shù)據(jù)中提取其隱藏的多個(gè)擴(kuò)散狀態(tài), 刻畫出最可能的狀態(tài)變化路徑, 從而得到分子在某一擴(kuò)散狀態(tài)的停留時(shí)間和在不同擴(kuò)散狀態(tài)間的轉(zhuǎn)化概率等信息[58,59]. 針對(duì)細(xì)胞膜蛋白, 本課題組[60]發(fā)展了基于瑞利混合分布的HMM方法, 克服了之前方法需要預(yù)先設(shè)定擴(kuò)散狀態(tài)數(shù)或者容易過度擬合的缺點(diǎn), 可以得到膜蛋白在不同聚集狀態(tài)下的擴(kuò)散系數(shù)、 所占比例、 轉(zhuǎn)化速率和蛋白間相互作用的結(jié)合/解離速率常數(shù)等動(dòng)力學(xué)信息(見圖3).

Fig.3 Principle of the RmHMM method(A, B) and dwell times on the dimeric state of the EGFR before(C) and after(D) the stimulation revealed by RmHMM[60] Copyright 2019, American Chemical Society.

2 單分子成像研究膜蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

在單分子水平定量研究膜蛋白響應(yīng)外界刺激后其定位、 化學(xué)計(jì)量比和動(dòng)力學(xué)行為的變化, 不僅有助于理解相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制, 還可以幫助闡釋和預(yù)測不同生理病理?xiàng)l件下的膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程, 對(duì)于相關(guān)藥物的開發(fā)和優(yōu)化也具有重要意義. 下面將介紹單分子成像在研究轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)受體、 表皮生長因子受體(EGFR)、 腫瘤壞死因子受體(TNFR)和G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)幾種重要的細(xì)胞膜信號(hào)受體上的應(yīng)用.

2.1 轉(zhuǎn)化生長因子-β受體研究

TGF-β/Smad信號(hào)通路控制著包括增殖、 分化、 遷移和凋亡等一系列重要的細(xì)胞生理過程[61]. 該信號(hào)通路起始于配體TGF-β與細(xì)胞膜上TGF-βⅡ型受體(TβRⅡ)的結(jié)合, 隨后招募TGF-βⅠ型受體(TβRⅠ)形成異源多聚體復(fù)合物, 通過磷酸化下游Smad蛋白激活或抑制細(xì)胞核內(nèi)特定基因的轉(zhuǎn)錄, TGF-βⅢ型受體(TβRⅢ)可以協(xié)助將配體遞送給TβRⅡ, 從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)配體的響應(yīng)[62].

通過傳統(tǒng)的生化方法得到的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路模型認(rèn)為TβRⅠ, TβRⅡ和TβRⅢ在靜息狀態(tài)下均以二聚體或寡聚體形式存在, 在受到配體刺激后TβRⅠ二聚體與TβRⅡ二聚體結(jié)合形成激活的異源受體復(fù)合物. 本課題組[12]利用單分子熒光成像技術(shù), 通過熒光強(qiáng)度及熒光漂白步數(shù)分析發(fā)現(xiàn), 當(dāng)受體低表達(dá)時(shí), TβRⅠ, TβRⅡ和TβRⅢ 3種受體在靜息狀態(tài)均可以單體形式存在; 受TGF-β1刺激后, TβRⅡ發(fā)生二聚化(見圖4), TβRⅠ在TβRⅡ存在下二聚體比例也會(huì)顯著升高. 基于此提出了TGF-β受體激活的新模式, 即此類絲/蘇氨酸激酶受體也可通過配體誘導(dǎo)下單體二聚化而激活. 而非激酶受體TβRⅢ在配體刺激后其仍主要為單體, 說明TβRⅢ在單體狀態(tài)時(shí)即可增強(qiáng)配體與TβRⅡ的結(jié)合[63].

Fig.4 A typical single-molecule image of TβRⅡ-GFP(A), distribution of the fluorescence intensity of diffraction-limited TβRⅡ-GFP spots, the solid curves show the fitting of Gaussian function and the two peaks represented TβRⅡ-GFP monomers and dimers, respectively(B), time courses of GFP emission after background correction show two-step bleaching(C)[12]Copyright 2009, the National Academy of Sciences of the United States of America.

從受體的動(dòng)力學(xué)行為上分析, 也可得到一致的結(jié)論. 通過追蹤TβRⅠ-GFP的單分子軌跡, 發(fā)現(xiàn)在共表達(dá)TβRⅡ時(shí), TGF-β1刺激會(huì)顯著降低TβRⅠ的擴(kuò)散系數(shù). 由于受體在膜上的擴(kuò)散系數(shù)與其跨膜區(qū)半徑成反比, 這進(jìn)一步驗(yàn)證了信號(hào)激活過程中TβRⅠ會(huì)與TβRⅡ結(jié)合形成異源寡聚體. 而在破壞脂筏的情況下, 配體刺激不會(huì)改變TβRⅠ的擴(kuò)散行為, 這說明脂筏區(qū)域?yàn)門βRⅠ與TβRⅡ的結(jié)合提供了環(huán)境[64]. 此外, 通過定量表征TGF-β受體在單體和二聚體之間相互轉(zhuǎn)換的動(dòng)力學(xué)過程, 實(shí)現(xiàn)了對(duì)這一相互轉(zhuǎn)化過程更準(zhǔn)確的分析, 本課題組使用非天然氨基酸的方法對(duì)TβRⅡ進(jìn)行標(biāo)記, 得到了比之前熒光蛋白標(biāo)記擾動(dòng)更小、 信噪比更高的單分子圖像. 通過分析受體分子二聚的共定位時(shí)間, 計(jì)算出TβRⅡ二聚體的壽命為253 ms, 解離速率常數(shù)為3.95 s-1, 而且配體刺激并不會(huì)顯著改變這一過程的動(dòng)力學(xué)參數(shù). 以上實(shí)驗(yàn)[40]說明配體并不能穩(wěn)定TβRⅡ二聚體, 受配體刺激后TβRⅡ二聚化程度增加是由受體密度增大所致.

對(duì)于受體在形成信號(hào)復(fù)合物之后, 其下游信號(hào)的傳遞過程. 之前的研究[65,66]對(duì)于受體激活Smad蛋白發(fā)生在細(xì)胞膜上還是細(xì)胞內(nèi)一直存在爭議. 本課題組[67]研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)有配體刺激時(shí), 激活的受體復(fù)合物會(huì)在細(xì)胞膜上結(jié)合Smad3并將其磷酸化. 雖然細(xì)胞在有無配體刺激時(shí)Smad3均存在上膜的現(xiàn)象, 但是有配體刺激時(shí)Smad3和TβRⅠ的解離速率常數(shù)更小, 其結(jié)合更穩(wěn)定(見圖5). 通過單分子成像和追蹤的方法, 在提高時(shí)間及空間分辨率的基礎(chǔ)上可進(jìn)一步明確TGF-β受體激活過程.

Fig.5 A typical single-molecule fluorescence images of EGFP-Smad3 molecules docking on the cell membrane in the presence of TGF-β1(A), diffusion coefficient of membrane-docked EGFP-Smad3 molecules with the marked D value in HeLa cells in the presence of TGF-β1(B), cumulative histograms(solid) indicated the docking time of EGFP-Smad3 molecules in stimulated cells, the histograms were fitted with a single exponential function, the dotted lines are the fitting curves with the time constants τ(0.60 s)(C)[67] Copyright 2016, Springer Nature.

膜蛋白的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)重要的調(diào)控機(jī)制[68], TGF-β信號(hào)通路也與受體在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程密切相關(guān). 內(nèi)吞的受體會(huì)在細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào), 進(jìn)一步被修飾、 降解或者重新回到細(xì)胞膜上. TGF-β受體有2種內(nèi)吞途徑, 其中網(wǎng)格蛋白(Clathrin)介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑與TGF-β信號(hào)的上調(diào)有關(guān), 而胞膜窖(Caveolae)介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑與TGF-β信號(hào)的下調(diào)有關(guān). 通過對(duì)TβRⅠ內(nèi)吞過程的多色成像, 發(fā)現(xiàn)了一種新的TGF-β受體轉(zhuǎn)運(yùn)途徑. 研究[69]表明, Clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞和Caveolae介導(dǎo)的內(nèi)吞會(huì)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生融合(見圖6), 形成Clathrin和窖蛋白(Caveolin-1)雙陽性囊泡, 在Rab5的調(diào)控下, 融合囊泡會(huì)進(jìn)一步融合至早期內(nèi)涵體, 形成Caveolin-1陽性早期內(nèi)涵體, TβRⅠ可能在此時(shí)被再次分選, 從而決定其信號(hào)傳遞、 降解和回收.

Fig.6 Triple-color live-cell confocal imaging of the cell co-expressing caveolin-1-EGFP, clathrin-DsRed and Myc-TβRⅠ, the boxed region was magnified(images to the right) to show the movement of a Myc-TβRⅠ, caveolin-1-EGFP and clathrin-DsRed triple-positive vesicle(arrows) from the lateral plasma membrane(white lines) to the cytoplasm[69]Copyright 2015, Springer Natare.

本課題組[15]還研究了TGF-β受體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上的過程. 在細(xì)胞質(zhì)內(nèi), 利用quasi-TIRFM觀察到新合成的TβRⅡ由后高爾基體囊泡運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜上的過程. 相較于靜息狀態(tài)的細(xì)胞, 受配體刺激后細(xì)胞膜附近包含TβRⅡ的后高爾基體囊泡數(shù)量增多, 這類囊泡可能作為新生成TβRⅡ的儲(chǔ)存裝置, 可以響應(yīng)配體刺激將受體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜上, 補(bǔ)償因內(nèi)吞而減少的受體. 結(jié)合熒光漂白后恢復(fù)技術(shù)和單分子成像, 發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上的TβRⅡ主要呈單體狀態(tài)[70]. 先用較強(qiáng)的激光將成像范圍內(nèi)的受體漂白, 幾分鐘后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未被漂白的TβRⅡ-EGFP被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上導(dǎo)致熒光恢復(fù), 再用較弱的激光對(duì)新轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜上的受體進(jìn)行單分子追蹤[圖7(A)]. 結(jié)果表明, 受配體刺激后, 單位時(shí)間內(nèi)上膜的TβRⅡ增多, 而且在細(xì)胞膜上的停留時(shí)間更長. 這導(dǎo)致細(xì)胞膜上TβRⅡ的密度增加, 從而促進(jìn)了TβRⅡ的二聚化及信號(hào)激活[圖7(B)和(C)].

Fig.7 Principle of FRAP-SMI(A), cumulative histograms of the dwell times of newlydelivered TβRⅡ-EGFPs in unstimulated(B) and stimulated cells(C)[70] Copyright 2018, American Chemical Society.

2.2 表皮生長因子受體研究

EGFR信號(hào)通路調(diào)控著細(xì)胞發(fā)育、 增殖、 凋亡和分化等關(guān)鍵的生理過程. EGFR是單次跨膜蛋白, 包含胞外配體結(jié)合域、 跨膜區(qū)和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域[4]. 長期以來人們認(rèn)為EGFR受配體刺激后會(huì)發(fā)生二聚化, 胞內(nèi)的激酶結(jié)構(gòu)域相互靠近發(fā)生自磷酸化從而被激活. Chung等[71]通過追蹤量子點(diǎn)標(biāo)記的單個(gè)EGFR, 原位研究了其激活過程的細(xì)節(jié), 發(fā)現(xiàn)EGFR在細(xì)胞膜上處于單體-二聚體的動(dòng)態(tài)平衡. 在配體刺激前, EGFR會(huì)形成動(dòng)力學(xué)上穩(wěn)定的預(yù)二聚體, 為配體結(jié)合及信號(hào)傳遞做好準(zhǔn)備. 結(jié)合配體后, EGFR會(huì)在激活下游信號(hào)的同時(shí)快速出現(xiàn)一個(gè)非常慢的擴(kuò)散狀態(tài), 說明結(jié)合了配體的受體二聚體依然是信號(hào)傳遞中所必須的. 最近的研究[72]表明, 配體刺激后EGFR會(huì)形成四聚體或聚集程度更高的多聚體, 多聚體的形成更有利于受體的自磷酸化和激活. 本課題組[73]通過單分子熒光成像追蹤了EGFR家族的HER2蛋白, 配體HRG會(huì)結(jié)合HER3蛋白與HER2形成異二聚體. 經(jīng)HRG刺激后發(fā)現(xiàn), 不同于TGF-β等受體二聚后擴(kuò)散系數(shù)減小, HER2的擴(kuò)散系數(shù)反而有所增大, 用藥物抑制激酶活性或擾亂細(xì)胞骨架后, 擴(kuò)散系數(shù)增大的現(xiàn)象消失. 這說明該反常的快速擴(kuò)散與HER2的磷酸化和細(xì)胞骨架有關(guān), 可能是HER2或EGFR的磷酸化導(dǎo)致了細(xì)胞骨架發(fā)生重排, 從而改變了HER2所處的膜微環(huán)境, 導(dǎo)致其擴(kuò)散加快.

2.3 腫瘤壞死因子受體研究

TNFR屬于TNF受體超家族, 是細(xì)胞膜上的模式感應(yīng)受體, 在細(xì)胞存活和凋亡中均具有重要的信號(hào)調(diào)節(jié)作用, 與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān). 在受到配體TNFα刺激時(shí), TNFR1會(huì)發(fā)生三聚化而激活, 誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡. 通過單分子成像研究發(fā)現(xiàn), 在綠膿桿菌分泌的化學(xué)信號(hào)分子3oc刺激后, 通過嵌入細(xì)胞膜脂筏區(qū)域, 3oc可以使TNFR1的運(yùn)動(dòng)加快, 增加其相互碰撞幾率, 引起其三聚體比例增加[74]. 這表明TNFR1在沒有配體TNFα的情況下也可以被激活, 這種非經(jīng)典的激活方式揭示了一種微生物擾亂宿主固有免疫的新機(jī)制, 即通過代謝物直接激活宿主的TNFR1信號(hào)來抑制宿主的免疫功能.

2.4 G蛋白偶聯(lián)受體研究

GPCR是人類基因組中最大的跨膜信號(hào)蛋白家族, 其異常與許多疾病相關(guān). 近年來, 單分子成像分析極大地推動(dòng)了GPCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究[5,75]. GPCR會(huì)感應(yīng)細(xì)胞外環(huán)境變化, 并以一種非線性、 動(dòng)態(tài)的方式將信息傳遞到細(xì)胞內(nèi)部. GPCR被配體激活后, 可結(jié)合下游的G蛋白, 導(dǎo)致G蛋白解聚為α和βγ亞基, 從而調(diào)控下游信號(hào). Arrestin一直被認(rèn)為會(huì)在GPCR磷酸化后與之結(jié)合, 使受體內(nèi)吞, 進(jìn)而對(duì)配體變得不敏感. 但是, 最近研究[76]發(fā)現(xiàn)某些配體可以直接激活A(yù)rrestin信號(hào)通路, 即存在偏向激活現(xiàn)象.

Calebiro等[53]通過單分子熒光成像研究了生理?xiàng)l件下β1AR,β2AR和GABAB3種典型的GPCR, 發(fā)現(xiàn)不同受體的聚集程度不同, 其中β1AR的聚集程度最低, 主要以單體/二聚體形式存在, GABAB的聚集程度最高, 普遍為二聚體/四聚體.β1AR和β2AR在細(xì)胞表面以自由擴(kuò)散的形式運(yùn)動(dòng), GABAB受體則傾向于與細(xì)胞微絲骨架結(jié)合而呈現(xiàn)有序的排列. 在激動(dòng)劑刺激下, 受體的聚集狀態(tài)沒有改變, 但是GABAB受體復(fù)合物運(yùn)動(dòng)能力得到了顯著提升. 以上結(jié)果表明, GPCR在細(xì)胞表面始終處于結(jié)合與解離的動(dòng)態(tài)平衡中, 并且受體復(fù)合物可以在配體的調(diào)控下靶向不同的細(xì)胞微區(qū). Sungkaworn等[77]通過單分子追蹤也發(fā)現(xiàn)GPCR傾向于在細(xì)胞膜上的一些熱點(diǎn)區(qū)域內(nèi)結(jié)合G蛋白, 從而激活下游信號(hào)通路.

GPCR的偏向激活是指同一個(gè)受體分子接受不同配體刺激時(shí)可以與下游不同的效應(yīng)蛋白結(jié)合, 啟動(dòng)不同的信號(hào)通路. 平衡型配體可以同時(shí)激活G蛋白和β-Arrestin通路, 偏向性配體會(huì)更傾向于激活其中一條通路[78]. 關(guān)于GPCR的偏向激活研究[79]發(fā)現(xiàn), GPCR家族的β2腎上腺素受體(β2AR)在低表達(dá)條件下主要以單體形式存在于細(xì)胞膜上, 偏向激動(dòng)劑卡維地洛激活β2AR時(shí)則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞膜上的β2AR發(fā)生二聚化, 但在完全激動(dòng)劑Isoproterenol和拮抗劑Propranolol作用下,β2AR仍為單體. 用siRNA敲降β-Arrestin1后, 卡維地洛刺激引起β2AR二聚體增多的比例降低, 敲降β-Arrestin2后, 卡維地洛刺激不再引起β2AR二聚體增多, 說明卡維地洛刺激造成的β2AR二聚化依賴于β-Arrestin, 而且主要依賴于β-Arrestin2. 利用多色單分子熒光成像, 也觀察到卡維地洛刺激后有更高比例的β2AR二聚體與β-Arrestin共定位, 從而提出了β2AR通過受體二聚化實(shí)現(xiàn)偏向激活的可能機(jī)制(見圖8).

Fig.8 Aggregation states of β2AR-GFP under different conditions(A—C), the distributions of the fluorescence intensity of individual β2AR-GFP spots after the stimulation with 10 mmol/L carvedilol(A), isoproterenol(B), and propranolol(C), the fractions of one and two-step bleaching events of β2AR-GFP in the resting and drug-stimulated cells(D), before(E) and after(F) ligand stimulation in the presence of the siRNA targeting β-arrestin1(βarr1), or the siRNA targeting β-arrestin2(βarr2)[79] Copyright 2016, Royal Society of Chemistry.

GPCR受體還存在轉(zhuǎn)位激活的現(xiàn)象[78]. 轉(zhuǎn)位激活是指一個(gè)受體與相應(yīng)的配體結(jié)合后可促使另一個(gè)受體激活, 從而使信號(hào)進(jìn)一步傳遞, 且期間沒有轉(zhuǎn)錄和翻譯中間產(chǎn)物. 研究人員發(fā)現(xiàn)β2AR可以轉(zhuǎn)位激活EGFR, 但這一過程具體的分子機(jī)制之前并不清楚. 本課題組[80]首次用單分子熒光成像方法研究了β2AR轉(zhuǎn)位激活EGFR. 當(dāng)β2AR被異丙腎上腺素激活時(shí), EGFR的二聚化程度上升, 擴(kuò)散速率下降, 說明這一轉(zhuǎn)位激活過程仍需要EGFR形成二聚體, 并且Src激酶介導(dǎo)了該過程. 進(jìn)一步的共定位實(shí)驗(yàn)顯示, 異丙腎上腺素刺激后,β2AR和EGFR的共定位程度沒有顯著上升, 說明該轉(zhuǎn)位激活過程不依賴于直接的受體相互作用.

3 單分子成像研究藥物作用機(jī)制

目前已發(fā)現(xiàn)的可成藥蛋白中約有41%屬于GPCR、 離子通道和激酶家族, 以這3個(gè)家族蛋白質(zhì)為靶點(diǎn)的小分子藥物更是占小分子藥物總數(shù)的54%[81]. 由此可見, 膜蛋白是十分重要的藥物開發(fā)靶點(diǎn). 對(duì)于一個(gè)膜蛋白受體靶點(diǎn)通常有多種治療藥物, 而不同藥物之間療效存在差異, 它們與膜受體的作用機(jī)制或作用程度可能不同. 傳統(tǒng)的生化方法難以衡量藥物對(duì)細(xì)胞膜受體不同下游通路的作用程度, 一般通過檢測下游信號(hào)分子的濃度來表征受體的激活程度, 但是這種方法需要事先知道詳細(xì)的信號(hào)通路傳導(dǎo)機(jī)制. 近年來, 利用單分子成像和追蹤的方法, 已經(jīng)可以直接通過檢測藥物作用后受體的聚集和擴(kuò)散情況來判斷藥物對(duì)受體的激活或抑制程度[82]. 在單分子水平研究藥物與膜受體的作用機(jī)制和作用程度, 對(duì)改良已有藥物和開發(fā)副作用小的新藥均具有很好的指導(dǎo)意義.

TGF-β信號(hào)的反常激活與許多疾病相關(guān), 如在肥厚型心肌細(xì)胞中, TβRⅡ在配體刺激后的二聚化程度相較于正常心肌細(xì)胞更高[83]. 目前, 大部分TGF-β信號(hào)的抑制劑是抗體, 為了提升藥物的組織穿透性和穩(wěn)定性, 需要發(fā)展更多的小分子抑制劑. 已發(fā)展的小分子抑制劑通常靶向TβRⅠ激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點(diǎn). 小分子天然產(chǎn)物柚皮素也具有潛在的藥物活性, 能降低Smad3的表達(dá)和磷酸化. 本課題組[84]結(jié)合單分子熒光成像和單分子力譜方法研究了柚皮素的抑制機(jī)制, 發(fā)現(xiàn)柚皮素會(huì)降低TGF-β1和TβRⅡ的結(jié)合概率, 抑制TβRⅡ的二聚化, 從而抑制下游信號(hào)傳遞.

二甲雙胍是臨床上常用的降血糖藥物, 在心血管疾病、 多囊卵巢綜合征、 糖尿病腎病和癌癥中也顯示出療效. 研究[85]發(fā)現(xiàn), 二甲雙胍同樣可通過阻斷TGF-β1與受體的結(jié)合實(shí)現(xiàn)抑制功能. 單分子成像結(jié)果表明, TβRⅡ二聚化程度隨二甲雙胍濃度上升而下降, 這也解釋了二甲雙胍對(duì)一些與TGF-β1信號(hào)異常相關(guān)的疾病有治療效果的原因.

大多數(shù)β2AR的激動(dòng)劑屬于兒茶酚胺, 會(huì)激活下游G蛋白信號(hào), 然而長期的兒茶酚胺刺激導(dǎo)致G蛋白介導(dǎo)的腺苷酸環(huán)化酶激活是有心臟毒性的. 除了用拮抗劑抑制β2AR激活下游G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路外, 還發(fā)現(xiàn)偏向性配體卡維地洛可以特異性激活β-Arrestin介導(dǎo)的下游信號(hào), 該通路會(huì)阻止腺苷酸環(huán)化酶激活, 抵消兒茶酚胺的毒性[86]. 利用單分子熒光成像技術(shù), 觀察卡維地洛偏向激活β2AR時(shí), 發(fā)現(xiàn)受體的二聚化程度會(huì)升高, 反之用完全激動(dòng)劑異丙腎上腺素和反向激動(dòng)劑普萘洛爾激活時(shí),β2AR主要為單體[圖8(A)～(D)][79], 這為開發(fā)偏向激活藥物提供了新的依據(jù).

4 總結(jié)與展望

單分子熒光成像為實(shí)時(shí)、 動(dòng)態(tài)地研究生命化學(xué)過程提供了新技術(shù), 是結(jié)合化學(xué)、 物理、 生命科學(xué)及計(jì)算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科的交叉研究領(lǐng)域. 不同于傳統(tǒng)的系綜方法, 聚焦于單分子水平的動(dòng)態(tài)過程為研究膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能提供了嶄新視角. 目前, 活細(xì)胞單分子熒光成像的應(yīng)用還面臨一些挑戰(zhàn). 首先, 在熒光探針方面, 仍然需要發(fā)展亮度更高、 光穩(wěn)定性更好、 干擾更小的熒光探針, 在標(biāo)記方法上將更多使用基因編輯的方法, 如CRISPR/Cas9系統(tǒng), 原位研究內(nèi)源表達(dá)的膜蛋白; 其次, 膜蛋白單分子成像最常用的全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRFM)顯微成像分辨率仍然受限于衍射極限, 新發(fā)展的許多突破光學(xué)衍射極限的超分辨成像方法將更多地應(yīng)用到單分子成像研究中; 最后, 需要在不干擾膜蛋白功能的條件下實(shí)現(xiàn)更高時(shí)間和空間分辨的單分子成像, 從而揭示細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要生化過程的分子機(jī)制.