張斌強(qiáng)，陳龍，冉鳳英，杜開慧，余飛，陳煒，楊麗萍，薛旸，陳琴華，陳繼舜

作者單位：湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院，a實(shí)驗(yàn)中心，b心血管內(nèi)科，湖北 十堰442008

附子是溫里藥中常用藥物之一，被稱為“百藥之長(zhǎng)”，又譽(yù)為“回陽(yáng)救逆第一要藥”。現(xiàn)代的科學(xué)研究同樣認(rèn)為附子具有很高的醫(yī)學(xué)藥用價(jià)值，比如在強(qiáng)心、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等領(lǐng)域都有其獨(dú)特的價(jià)值并得到了廣泛的應(yīng)用[1-2]，最近的研究發(fā)現(xiàn)它還能夠改善心衰大鼠體內(nèi)的抗氧化能力[3]，但是臨床上經(jīng)常因服用不當(dāng)發(fā)生中毒死亡，其臨床應(yīng)用受到了嚴(yán)格的限制[4]，而烏頭堿是附子中具有毒性的主要生物活性堿之一。先前的研究表明烏頭堿能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞鈉離子通道開放，加速鈉離子內(nèi)流，促使細(xì)胞膜去極化并且改變心肌細(xì)胞K+通道活性從而引發(fā)心律失常[5-6]。烏頭堿還能通過(guò)激活和磷酸化p38/MAPK信號(hào)通路，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]，在體外實(shí)驗(yàn)中，也有研究證實(shí)了烏頭堿通過(guò)降低PGC1α表達(dá)引起線粒體功能障礙，并且使得Cytoch rome c、Bax、cleaved、Caspase3表達(dá)上調(diào)以及Bcl2的表達(dá)下調(diào)最終導(dǎo)致H9c2心肌細(xì)胞的凋亡[8]。綜上所述，烏頭堿的毒性研究多集中在引起多種細(xì)胞和動(dòng)物模型的電活動(dòng)異常但對(duì)心肌細(xì)胞分化的影響的研究尚不多見。H9c2細(xì)胞株廣泛應(yīng)用于大鼠的生理和心臟毒性研究[9]，該細(xì)胞在1%胎牛血清和全反式維甲酸（RA）的誘導(dǎo)下可分化為具有成熟表型的心肌細(xì)胞[10]，應(yīng)用此種誘導(dǎo)方法，先后引起了與心臟發(fā)育[11]和藥理毒理學(xué)許多相關(guān)的研究[12-14]。2017年12月至2018年7月，本研究通過(guò)烏頭堿對(duì)H9c2分化的影響，進(jìn)一步闡釋烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞毒性作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備 大鼠H9c2心肌細(xì)胞（中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心）；烏頭堿（上海普譽(yù)科貿(mào)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)w-006-151225）；全反式維甲酸（美國(guó)Sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)WXBC4500V）；DMEM干粉培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（美國(guó)Biological Industries公司，生產(chǎn)批號(hào)1640562）；引物（上海Sangon Biotech合成）；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo Scientific公司）；SYBR Green PCR Kit（中國(guó)TIANGEN公司）；兔來(lái)源一抗α-actinin抗體（美國(guó)Cell Singaling公司）；小鼠來(lái)源一抗cTnI抗體（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology，Inc公司）；山羊抗兔熒光二抗（美國(guó)antgene公司）；山羊抗小鼠熒光二抗（美國(guó)antgene公司）；熒光定量PCR儀（美國(guó)Corbett Research公司，Rotor gene 6000）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus Corporation公司，CKX41）；熒光顯微鏡（德國(guó)Carl zeiss AG公司，Axio scope A1）。

1.2 方法

1.2.1 H9c2細(xì)胞的培養(yǎng) H9c2細(xì)胞接種到含有10%胎牛血清、100 kU//L青霉素和100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，胰蛋白酶消化傳代備用。

1.2.2 烏頭堿對(duì)H9c2細(xì)胞增殖影響 采用噻唑藍(lán)比色法（MTT）檢測(cè)烏頭堿對(duì)H9c2細(xì)胞增殖的影響，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞以5×107個(gè)/L的細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入200 μL細(xì)胞懸液。24 h后，加入200 μL的烏頭堿溶液，使其終濃度分別為10、30、50、70、90、110 μM/L，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)5 d、3 d換液。加入5 g/L的MTT，37℃孵育4 h，再加入150 μL DMSO。振蕩10 min使結(jié)晶甲臜充分溶解后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)OD值。細(xì)胞增殖率＝實(shí)驗(yàn)組平均值/對(duì)照組平均值×100%。

1.2.3 細(xì)胞分組培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞接種于6孔板和24孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合度時(shí)加入不同實(shí)驗(yàn)分組的誘導(dǎo)因子，實(shí)驗(yàn)分組為：①正常培養(yǎng)組（含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基），②分化模型組（含1%胎牛血清、1 μM/L RA的DMEM培養(yǎng)基），③烏頭堿處理組（含1%胎牛血清、1 μM/L RA、50 μM/L烏頭堿的DMEM培養(yǎng)基）。于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3 d換液培養(yǎng)5 d后光鏡照相。

1.2.4 熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)分化相關(guān)基因的表達(dá) H9c2細(xì)胞分組培養(yǎng)結(jié)束后取6孔板用TRIZOL試劑完全裂解細(xì)胞，將細(xì)胞裂解液用氯仿抽提，異丙醇沉淀，沉淀RNA溶于DEPC水后測(cè)定其純度與含量后應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。將cDNA作為模板加入目的基因引物進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件：95℃，5 min；60℃，20 s；72℃，1 min，40個(gè)循環(huán)。以目的基因域循環(huán)數(shù)（Threshold cycle，Ct）值對(duì)同一樣本的內(nèi)參照基因GAPDH Ct值進(jìn)行目的基因表達(dá)的相對(duì)定量分析。目的基因引物序列（見表1）。

1.2.5 免疫熒光化學(xué)染色觀察胞質(zhì)內(nèi)α-actinin表達(dá) 將接種于24孔板中的不同組細(xì)胞用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min。PBS洗后加入1‰的TritonX-100破膜15 min；PBS洗3次，驢血清封閉30 min；加入PBS稀釋的兔來(lái)源α-actinin抗體（1∶100）4℃過(guò)夜；第2天37℃復(fù)溫1 h，洗去多余的一抗，PBS洗3次，每次5 min。加入用PBS稀釋的山羊抗兔二抗（1∶100），37℃孵育1h，PBS洗3次后加入濃度為1 μg/mL的DAPI染色15 min，PBS洗3遍，封片觀察。

表1 引物序列

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)cTnI及α-actinin蛋白表達(dá) 將接種于6孔板中的不同組細(xì)胞棄培養(yǎng)基，加入RIPA裂解液，冰上孵育30 min，收集上清液。BCA法檢測(cè)上清液中蛋白質(zhì)濃度后，使用30 μg總蛋白進(jìn)行SDS－PAGE電泳后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，分別加入抗大鼠α-actinin、cTnI、和α-tublin抗體（1∶1 000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。TBST漂洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h，ECL顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析對(duì)比組間差異，結(jié)果以表示，LDS法均值兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)烏頭堿對(duì)H9c2細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響 與對(duì)照組相比，隨著烏頭堿作用濃度的增加，H9c2細(xì)胞的增殖率逐漸降低。不同濃度10、30、50、70、90、110 μM/L烏頭堿處理的H9c2細(xì)胞增殖率為（0.940±0.033），（0.732±0.027），（0.570±0.041），（0.347±0.031），（0.196±0.029），（0.137±0.026），與對(duì)照組相比增殖率降低，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 大鼠H9c2細(xì)胞各組形態(tài)學(xué)觀察 對(duì)照組顯示出正常H9c2細(xì)胞形態(tài)為梭形，在分化模型組中H9c2細(xì)胞呈現(xiàn)出細(xì)長(zhǎng)的形態(tài)，而烏頭堿處理組中細(xì)長(zhǎng)形態(tài)細(xì)胞減少，細(xì)胞密度相對(duì)減少，與對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)相近（見圖1）。

2.3 免疫熒光化學(xué)染色觀察α?actinin分布 大鼠H9c2細(xì)胞α-actinin免疫熒光表達(dá)情況主要為細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。正常培養(yǎng)組的H9c2僅有個(gè)別細(xì)胞表達(dá)，經(jīng)分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后的表達(dá)細(xì)胞數(shù)量增多，α-actinin陽(yáng)性胞質(zhì)形態(tài)呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)形態(tài)，DAPI染色且呈現(xiàn)出多核聚集的現(xiàn)象。細(xì)胞而加入烏頭堿后α-actinin陽(yáng)性細(xì)胞減少，細(xì)長(zhǎng)形態(tài)細(xì)胞減少，表達(dá)受到抑制（見圖2）。

2.4 qPCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況 qPCR結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)組相比，分化模型組中，actc1、myl1、myl2、tnnt2的mRNA表達(dá)均上調(diào)（P＜0.01）；nppb的mRNA表達(dá)降低（P＜0.05）。與分化模型組相比，烏頭堿處理組中，actc1、myl1、myl2、tnnt2的mRNA表達(dá)均下調(diào)（P＜0.01）；nppb的mRNA表達(dá)上調(diào)但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表2）。

2.5 各組H9c2細(xì)胞cTnI及α?actinin蛋白表達(dá)情況 蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)組相比，分化模型組中cTnI及α-actinin的蛋白表達(dá)升高。與分化模型組相比，烏頭堿處理組中cTnI及α-actinin的蛋白表達(dá)下降。見圖3。

表2 熒光定量PCR（qPCR）分析大鼠H9c2細(xì)胞各組分化相關(guān)基因的表達(dá)/

表2 熒光定量PCR（qPCR）分析大鼠H9c2細(xì)胞各組分化相關(guān)基因的表達(dá)/

注：與正常培養(yǎng)組比較，aP＜0.01；與分化模型組比較，bP＜0.01

images/BZ_24_1286_614_2240_673.pngactc1 myl1 myl2 tnnt2 nppb 0.000 0.000 0.000 0.000 0.005 1.00±0.10 1.00±0.09 1.00±0.11 1.00±0.12 1.00±0.12 2.30±0.17a 2.57±0.15a 18.64±0.53a 5.53±0.23a 0.49±0.06a 0.55±0.03b 1.22±0.13b 10.02±1.10b 2.23±0.10b 0.61±0.05 62.17 63.15 206.65 216.89 10.30

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I（cTnI）及α肌動(dòng)蛋白（α-actinin）表達(dá)情況

3 討論

H9c2廣泛應(yīng)用于大鼠的生理和心臟毒性研究，先前的研究表明該細(xì)胞在1%胎牛血清和RA的誘導(dǎo)條件下可分化為具有成熟表型的心肌細(xì)胞，分化后的細(xì)胞與10%胎牛血清正常培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞形態(tài)有顯著差異，其特點(diǎn)為形態(tài)細(xì)長(zhǎng)并伴有多核聚集[10]。因?yàn)镠9c2具有分化為成熟心肌細(xì)胞的能力，所以其作為一種分化模型在多個(gè)研究中得到應(yīng)用[15-16]。最近較為熱門的細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境誘導(dǎo)H9c2分化為成熟心肌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，H9c2細(xì)胞分化后具有高表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)志物F-actin、α-actinin、cTnI、以及myl2和tnnt2基因表達(dá)的增高的特點(diǎn)。而BNP作為一個(gè)胚胎心肌高表達(dá)的標(biāo)記物受到nppb基因的調(diào)控，在未分化的H9c2心肌細(xì)胞中有較高的表達(dá)而分化后的成熟心肌細(xì)胞表達(dá)下降[17-18]。所以本研究采用qPCR檢測(cè)分化相關(guān)基因actc1、myl1、myl2、tnnt2、nppb，免疫熒光染色觀察αactinin表達(dá)以及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)α-actinin、cTnI蛋白定量來(lái)分析H9c2心肌細(xì)胞的分化情況。

之前的研究表明，烏頭堿對(duì)H9c2細(xì)胞有毒性作用能夠誘導(dǎo)其凋亡的產(chǎn)生[8]。本研究分別使用不同濃度的烏頭堿刺激H9c2細(xì)胞后用MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，烏頭堿對(duì)H9c2細(xì)胞的增殖抑制情況與先前的研究結(jié)果一致。因?yàn)镽A誘導(dǎo)分化是一個(gè)較為長(zhǎng)期的過(guò)程，之前的研究中誘導(dǎo)天數(shù)一般在5～7 d。我們用MTT檢測(cè)烏頭堿作用5 d后細(xì)胞的增殖率，挑選50 μM/L的烏頭堿濃度行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究將H9c2在1%胎牛血清和RA培養(yǎng)條件下成功的誘導(dǎo)成為形態(tài)細(xì)長(zhǎng)并伴有多核聚集的H9c2心肌細(xì)胞。在H9c2分化誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中加入50 μM/L的烏頭堿后，結(jié)果表明經(jīng)烏頭堿處理后的H9c2細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)形態(tài)減少，多核聚集減少。mRNA呈現(xiàn)出actc1、myl1、myl2、tnnt2表達(dá)均降低（P＜0.05），而nppb的mRNA表達(dá)處理前后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫熒光染色顯示出分化后的H9c2細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)α-actinin的表達(dá)增強(qiáng)，而加入烏頭堿后α-actinin的表達(dá)降低，典型的分化細(xì)胞數(shù)量減少。同時(shí)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)后顯示分化后cTnI及α-actinin蛋白表達(dá)增高，而烏頭堿處理組表達(dá)降低。說(shuō)明分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入烏頭堿后H9c2細(xì)胞的分化受到抑制。

眾所周知，成熟的心肌細(xì)胞能夠有節(jié)律的跳動(dòng)，這種生理功能是一系列復(fù)雜調(diào)控的結(jié)果，但是必不可少的就是粗細(xì)肌絲的滑動(dòng)。目前對(duì)于H9c2向成熟心肌細(xì)胞分化的研究中，縱使沒有出現(xiàn)節(jié)律跳動(dòng)的情況，但大多根據(jù)形態(tài)的改變，多核聚集的出現(xiàn)，肌絲的形成以及相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)來(lái)證明其向成熟心肌細(xì)胞分化的事實(shí)[18]。本研究通過(guò)烏頭堿對(duì)RA誘導(dǎo)H9c2分化的抑制作用，揭示了烏頭堿對(duì)H9c2分化相關(guān)基因和蛋白的抑制情況。其中actc1、myl1、myl2、tnnt2都是參與肌絲形成所需蛋白的重要調(diào)控基因，這些基因的表達(dá)能夠直接反應(yīng)心肌細(xì)胞的分化的程度。另外α-actinin表達(dá)的改變也印證了烏頭堿對(duì)心肌分化標(biāo)志物的抑制作用。我們可以猜想烏頭堿能夠通過(guò)某種方式影響心肌細(xì)胞肌絲中蛋白的表達(dá)從而導(dǎo)致肌絲的功能出現(xiàn)障礙，成為烏頭堿引發(fā)心臟毒性的機(jī)制。（本文圖1，2見插圖7-1）