吳靜鳴，黃曉青，曹陽，黃順旺

作者單位：1安徽天星醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，安徽 合肥230601；2合肥創(chuàng)新醫(yī)藥技術(shù)有限公司，安徽 合肥230088

柴葛解肌顆粒系根據(jù)經(jīng)典名方明代陶華所著《傷寒六書》收載的“柴葛解肌湯”研制而成的中藥六類新藥，由柴胡、葛根、羌活、白芷、黃芩、甘草、大棗、石膏等11味藥材組成，具有解肌清熱功效，臨床用于治療感冒、流行性感冒等，治療小兒高熱不退，并具有熱退不反復(fù)的顯著療效。原方為湯劑，本研究擬采用水提醇沉工藝將該經(jīng)典名方開發(fā)成為臨床療效好，服用量小，病人依從性好的現(xiàn)代中成藥。

該處方中石膏為臣藥，清內(nèi)郁之熱，文獻(xiàn)報道其主要成分為含水硫酸鈣[1]，鈣離子為石膏中所含的主要離子成分，石膏對動物造模所致的發(fā)熱具有一定的解熱作用。本研究于2018年5月至2019年2月對柴葛解肌顆粒提取純化工藝中醇沉前后浸膏中鈣離子進(jìn)行含量測定并對解熱藥效作用進(jìn)行對比研究，說明生產(chǎn)工藝選擇醇沉的合理性。

1 材料

1.1 儀器 KDM型可調(diào)控溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）；Laws-500T型純化水機(jī)（杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司）；STW0101型山佳高精度數(shù)字式電子體溫計[山佳國際工貿(mào)（天津）有限公司]。

1.2 試藥 柴胡、葛根、羌活、白芷、石膏（含水硫酸鈣含量為96.5%）等11味藥材購于安徽普仁中藥飲片有限公司；乙二胺四醋酸二鈉（西隴化工股份有限公司）；鈣黃綠素（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；2，4-二硝基苯酚（上海試劑三廠）；大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（安徽省食品藥品檢驗研究院提供）；金蓮清熱顆粒（寧夏啟元藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號20170609）；所用試劑均為分析純。

1.3 動物 SPF級SD大鼠53只，體質(zhì)量范圍為200～220 g，動物合格證號34000200000367，由安徽省實驗動物中心提供；普通級家兔30只，體質(zhì)量范圍為1.8～2.2 kg，動物合格證號0030686，由南京安立默科技有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 醇沉前后浸膏相關(guān)成分含量

2.1.1 醇沉前后浸膏的制備 柴胡、羌活、白芷和生姜四味藥材提取揮發(fā)油；以上藥渣與葛根、甘草、白芍等其余七味藥材合并加10倍量純化水煎煮2次，每次2 h，濾過。合并上述各濾液，濾液按重量分為均等兩份，一份濾液濃縮至含原藥材0.1 g/mL，以備測定醇沉前鈣離子含量用；另一份濾液濃縮至相對密度為1.15左右（80℃）的浸膏，放冷，加入乙醇至含醇量為50%，靜置24 h，濾過，回收乙醇至無醇味，用純化水調(diào)至含原藥材0.1 g/mL，以備測定醇沉后鈣離子含量用，做3次平行試驗。

2.1.2 試劑配制 EDTA-2Na（乙二胺四醋酸二鈉）溶液的配制[1]：取EDTA-2 Na·H2O 18.61 g，溶于約300 mL適宜溫度的去離子水中，冷卻后稀釋至1 L，搖勻即得EDTA-2Na滴定溶液（0.05 mol/L）。鈣指示劑的配制[2]：取鈣黃綠素0.3 g，加氯化鉀30 g，研磨均勻，即得。

2.1.3 陰性對照試驗 依據(jù)本品處方比例制備不含石膏的陰性對照溶液，按照2.1.4項下方法進(jìn)行測定，測得消耗EDTA-2 Na滴定液（0.05 mol/L）為0 mL，結(jié)果表明對照溶液對測定無干擾。

2.1.4 鈣離子含量的測定 精密吸取上述醇沉前和醇沉后溶液各5 mL，加純化水20 mL，氫氧化鈉溶液調(diào)pH＞12，加入少許鈣指示劑，用EDTA-2 Na滴定溶液（0.05 mol/L）進(jìn)行滴定，直至溶液由紫紅色變?yōu)榧兯{(lán)色時為止。根據(jù)EDTA-2 Na滴定液消耗量計算鈣離子含量。每1毫升EDTA-2 Na滴定液（0.05 mol/L）相當(dāng)于8.608 mg的含水硫酸鈣[1-5]。

2.1.5 水煎醇沉前后鈣離子煎出量試驗結(jié)果 柴葛解肌顆粒水煎醇沉前、水煎醇沉后鈣離子煎出量試驗結(jié)果見表1。

表1 醇沉前后鈣離子煎出量試驗結(jié)果（n＝3）

根據(jù)表1，柴葛解肌顆粒水煎醇沉前后含水硫酸鈣含量比較，醇沉后含量減少接近1/3。

2.2 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）統(tǒng)計處理，結(jié)果用表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2.3 藥效學(xué)考察［6?15］

2.3.1 醇沉前后浸膏對2，4-二硝基苯酚致大鼠發(fā)熱模型的影響 選取體溫正常（37.0～38.0℃）、測定2次體溫后溫差≤0.3℃的大鼠53只，分成四組，分別為0.9%氯化鈉溶液組（0.70 mL/100 g）、陽性對照組（金蓮清熱顆粒2.3 g/kg）、醇沉前組（7.2 g生藥/kg，0.70 mL/100 g）、醇沉后組（7.2 g生藥/kg，0.70 mL/100 g），每只大鼠背部皮下注射2，4－二硝基苯酚20 mg/kg，當(dāng)體溫升高1℃左右時，各組大鼠分別灌胃相應(yīng)藥物或0.9%氯化鈉溶液，在給藥后每隔1 h測肛溫1次，連續(xù)測定3 h。見表2。

表2結(jié)果顯示：與0.9%氯化鈉溶液組比較，給藥后2 h和3 h，陽性對照藥金蓮清熱顆粒，醇沉前和醇沉后均可降低大鼠發(fā)熱體溫（P＜0.05或P＜0.01）；金蓮清熱顆粒組，醇沉前組和醇沉后組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3.2 醇沉前后浸膏對內(nèi)毒素致家兔發(fā)熱模型的影響 實驗前間隔30 min測兩次肛溫，以波動不大于0.2℃者為受試動物，取其均值為基礎(chǔ)溫度。取體溫符合解熱實驗要求的家兔分為四組，分別為0.9%氯化鈉溶液組（5 mL/kg），陽性對照組（金蓮清熱顆粒1.7 g/kg），醇沉前組（5.2 g生藥/kg，5.03 mL/kg），

表2 醇沉前后浸膏對2，4-二硝基苯酚致大鼠發(fā)熱模型的影響/（℃，）

表2 醇沉前后浸膏對2，4-二硝基苯酚致大鼠發(fā)熱模型的影響/（℃，）

注：與0.9%氯化鈉溶液組相比較，aP＜0.01，bP＜0.05；造模后，金蓮清熱顆粒組、醇沉前組、醇沉后組之間比較，P＞0.05

組別0.9%氯化鈉溶液組金蓮清熱顆粒組醇沉前組醇沉后組給藥后鼠數(shù)13 13 14 13劑量0.7 mL/100 g 2.3 g/kg 7.2 g生藥/kg 7.2 g生藥/kg造模前37.5±0.2 37.5±0.3 37.5±0.3 37.5±0.3造模后39.9±0.6 39.9±0.8 39.8±0.3 39.9±0.4 3 h 39.3±0.3 38.7±0.4a 38.7±0.2a 38.7±0.5b 1 h 39.9±0.7 39.5±0.6 39.4±0.4 39.4±0.6 2 h 39.5±0.3 38.9±0.3a 38.9±0.3a 39.1±0.4b

表3 醇沉前后浸膏對內(nèi)毒素致家兔發(fā)熱模型的影響/（℃）

表3 醇沉前后浸膏對內(nèi)毒素致家兔發(fā)熱模型的影響/（℃）

注：與0.9%氯化鈉溶液組相比較，aP＜0.01，bP＜0.05；造模后，金蓮清熱顆粒組、醇沉前組、醇沉后組之間比較，P＞0.05

給藥后組別 劑量 兔數(shù) 基礎(chǔ)體溫 造模后0.9%氯化鈉溶液組金蓮清熱顆粒組醇沉前組醇沉后組4 h 40.2±0.5 40.1±0.3 40.1±0.3 40.1±0.3 5 mL/kg 1.7 g/kg 5.2 g生藥/kg 5.2 g生藥/kg 7 8 8 7 39.5±0.4 39.5±0.3 39.5±0.3 39.5±0.3 40.9±0.2 41.0±0.3 40.9±0.3 40.9±0.4 1 h 41.2±0.3 40.9±0.3 40.9±0.4 40.9±0.4 2 h 41.5±0.4 40.9±0.3a 40.6±0.4a 40.6±0.4a 3 h 40.9±0.5 40.5±0.3b 40.5±0.4b 40.5±0.4

醇沉后組（5.2 g生藥/kg，5.03 mL/kg）。每組家兔靜脈注射大腸桿菌液（106/kg）造模。選擇體溫升高高于1℃的家兔，分別灌胃相應(yīng)藥物或0.9%氯化鈉溶液，觀察給藥后1、2、3、4 h時各組家兔直腸溫度變化。見表3。

表3結(jié)果顯示：與0.9%氯化鈉溶液組比較，給藥后2h，金蓮清熱顆粒、醇沉前和醇沉后可降低家兔發(fā)熱體溫（P＜0.01），給藥后3 h，醇沉前和金蓮清熱顆粒均可降低家兔發(fā)熱體溫（P＜0.05）；金蓮清熱顆粒組，醇沉前組和醇沉后組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

處方中的石膏清熱瀉火，除煩止渴?？诜嗉鍎?，經(jīng)胃酸作用后，一部分可變?yōu)榭扇苄遭}，經(jīng)腸吸收入血，增加血中鈣離子濃度，調(diào)節(jié)體溫中樞而解熱[1]。本研究參照相關(guān)文獻(xiàn)[1-5]，采用絡(luò)合滴定法測定鈣離子在醇沉前后浸膏的溶出情況，考察藥液中石膏含量，測定結(jié)果可靠、靈敏。

考察柴葛解肌顆粒處方工藝在醇沉前后浸膏對2，4-二硝基苯酚致大鼠發(fā)熱模型和對內(nèi)毒素致家兔發(fā)熱模型的影響，兩種浸膏均具有一定的解熱作用，且金蓮清熱顆粒組，醇沉前組和醇沉后組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

因此，本醇沉工藝（含醇量為50%）雖然鈣離子含量減少接近1/3，但從藥效學(xué)（解熱）角度分析仍具有一定的可行性，為柴葛解肌顆粒的提純工藝提供理論支持。