胡可，常瑞，朱秋勁，湯鵬宇，劉春麗，宋麗，鄧力， 胡萍，何臘平，曾雪峰，葉春

1(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽，550025)2(貴州大學(xué)貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽，550025)

西式熏煮火腿是西式低溫肉制品的一種，其營養(yǎng)價(jià)值高，風(fēng)味卓越，肉質(zhì)鮮口感好，深受大眾喜愛[1]。目前，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)西式熏煮火腿的研究主要集中在原輔料品質(zhì)特性、加工工藝改善及品質(zhì)提升研究、西式熏煮火腿加熱和煙熏等過程的質(zhì)量安全控制三個(gè)方面[2-4]。西式熏煮火腿區(qū)別于其他西式火腿在于其獨(dú)特的煙熏風(fēng)味，目前常使用傳統(tǒng)發(fā)煙方式煙熏火腿，但煙熏過程中常產(chǎn)生苯并芘和多環(huán)芳烴等有害物質(zhì)[5]。為避免有害物質(zhì)的產(chǎn)生，綠色煙熏液研制并上市，液熏法賦予西式火腿煙熏風(fēng)味應(yīng)運(yùn)而生，然而其煙熏風(fēng)味卻不如傳統(tǒng)煙熏方式煙熏風(fēng)味好[6]。研究表明，風(fēng)味成分與食品基質(zhì)中的蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)相互作用，從而影響對(duì)某些風(fēng)味的感知[7]。其中，蛋白質(zhì)由于氨基酸側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的顯著變化，具有以多種方式與風(fēng)味化合物相互作用的潛力[8]，這些相互作用包括離子鍵，氫鍵和疏水鍵等。上述類型的相互作用本質(zhì)上屬于都是非共價(jià)相互作用，故具有可逆性[9]。肌漿蛋白占豬肉蛋白的30%～35%[10]，屬于水溶性蛋白，在維持肉質(zhì)方面起著重要作用。因此，為了優(yōu)化西式熏煮火腿的煙熏風(fēng)味，有必要探究西式熏煮火腿不同加工環(huán)節(jié)對(duì)火腿肌漿蛋白結(jié)構(gòu)的影響，以及西式熏煮火腿中肌漿蛋白結(jié)構(gòu)變化與風(fēng)味之間的關(guān)系。

本研究以西式熏煮火腿不同加工階段的肌漿蛋白為對(duì)象，運(yùn)用傅里葉變換紅外、紫外、內(nèi)源熒光等光譜技術(shù)手段，測定不同加工環(huán)節(jié)肌漿蛋白巰基總量、表面疏水性及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，旨在解釋西式熏煮火腿不同加工環(huán)節(jié)中肌漿蛋白結(jié)構(gòu)變化，對(duì)提升西式熏煮火腿產(chǎn)品品質(zhì)、優(yōu)化西式火腿加工工藝具有指導(dǎo)意義為煙熏液在西式火腿加工中的使用及風(fēng)味的提升提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西式火腿制作材料：新鮮豬后腿精瘦肉；食鹽、白砂糖、味精、黑胡椒粉、淀粉等調(diào)味料，購于合力超市；乳酸鉀，北京清源食品添加劑有限公司；亞硝酸鹽，杭州龍山化工有限公司；三聚磷酸鈉、焦磷酸鈉、D-異抗壞血酸鈉，河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；黃原膠、卡拉膠，內(nèi)蒙古阜豐生物科技有限公司；大豆分離蛋白，萬利達(dá)生物科技有限公司；硬木煙熏香味料SmokeZ C-10-12、C-10-06，美國紅箭公司。以上材料均為食品級(jí)。

試劑：尿素，天津市福晨化學(xué)試劑廠；Tris，美國Genview公司；K2HPO4、NaH2PO4、KCl，成成金山化學(xué)試劑有限公司；2-硝基苯甲酸(DTNB)，上海麥克林生物化學(xué)公司；8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；β-巰基乙醇，廣東翁江化學(xué)試劑有限公司；KBr，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平(CP214)，奧豪斯儀器有限公司；梅特勒-托利多的便攜式pH計(jì)(Seven2GoTM)，瑞士；高速分散均質(zhì)機(jī)(XHF-DY)，寧波新芝生物科技股份有限公司；全波長酶標(biāo)儀(SpectraMAX190)，美國Molecular Devices公司；超聲清洗器(SB25-12DT)，上海冠特超聲儀器有限公司；斬拌機(jī)(ZBJ-40)、 灌腸機(jī)(GCJ-50)，諸城市華剛機(jī)械有限公司；真空滾揉機(jī)(GR-60)，諸城市新得利食品機(jī)械有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀VERTEX70，日本島津公司；紫外-可見分光光度計(jì)(UV2600)日本，Shimadzu公司；熒光分光光度計(jì)(Cary eclipse)，美國Aglient公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備

西式熏煮火腿加工方法：

(1)修整切塊：將后腿精瘦肉切成小肉塊，肉塊規(guī)格為1 cm×2 cm×3 cm。

(2)腌制：按照腌制配方制作好腌液，倒入切好的肉中，充分混合均勻，放在0～4 ℃環(huán)境腌制24～48 h。腌制配方(以實(shí)際腌制肉質(zhì)量計(jì))：食鹽 2.5%，亞硝酸鈉0.015%，異抗壞血酸鈉0.06%，多聚磷酸鈉0.1%，焦磷酸鈉0.2%，白砂糖0.8%，蒸餾水5%左右。

(3)真空滾揉：在0～8 ℃下滾揉4 h，每滾揉20 min間歇10 min，在滾揉快結(jié)束時(shí)按加工配方加入配料，再繼續(xù)滾揉10 min，以保證其分布均勻。加工配方(以實(shí)際加工肉質(zhì)量計(jì))：胡椒粉0.5%、味精0.5%、大豆蛋白2.2%、淀粉6.5%、卡拉膠0.3%、黃原膠0.3%、紅曲紅0.01%、硬木煙熏香味料Smoke ZC-10-12型0.2%、Smoke ZC-10-06型 0.5%、乳酸鏈球菌素0.1%。

(4)斬拌：取滾揉后的20%的肉料，經(jīng)斬拌機(jī)斬至肉糜后與肉塊混勻。

(5)灌腸：將塑料腸衣剪開，一端打卡后排氣，操作灌腸機(jī)灌餡，每間隔約20 cm打1次卡。

(6)蒸煮：預(yù)先在蒸煮鍋內(nèi)加入清潔水，預(yù)熱到85 ℃放入火腿，將水溫恒定在80 ℃蒸煮2 h。

(7)冷卻：采用流水冷卻，冷卻后于0～5 ℃冷庫保藏。

依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)室探索的西式熏煮火腿加工過程生產(chǎn)西式熏煮火腿，分別在原料肉、腌制、真空滾揉、斬拌和蒸煮環(huán)節(jié)進(jìn)行取樣。

1.3.2 肌漿蛋白的提取

參照XIA等[11]的方法。準(zhǔn)確稱量10 g肉樣于100 mL燒杯中，加入40 mL 0.03 mol/L緩沖液(含0.04 mol/L NaCl，pH=6.5)。在冰浴條件下以8 000 r/min勻漿3 min后12 000 r/min，4 ℃冷凍離心20 min取上清液，保存于4 ℃下并盡快使用。

以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，采用二辛可寧酸法測定蛋白質(zhì)濃度。

1.3.3 肌漿蛋白巰基含量的測定

巰基總量的測定方法參考XU等[12]的方法。使用20 mmol/L K2HPO4/KH2PO4磷酸鹽緩沖液(含 0.6 mol/L KCl，pH=7.0)將肌漿蛋白稀釋到濃度為4 mg/mL。以未加入肌漿蛋白的緩沖液混合體系為空白。巰基總量的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：A為減去試劑空白后412 nm處肌漿蛋白吸光值；D為肌漿蛋白稀釋倍數(shù)；C為肌漿蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.4 肌漿蛋白質(zhì)表面疏水性的測定

參考BOYER等的方法[13]。以原料肉中肌漿蛋白為對(duì)照，疏水強(qiáng)度以不同加工環(huán)節(jié)肌漿蛋白與原料肉組肌漿蛋白熒光強(qiáng)度的比例(相對(duì)熒光強(qiáng)度)計(jì)，計(jì)算公式如公式(2)所示：

(2)

1.3.5 肌漿蛋白化學(xué)作用力的測定

離子鍵含量=CSB-CSA

(3)

氫鍵含量=CSC-CSB

(4)

疏水相互作用=CSD-CSC

(5)

二硫鍵含量=CSE-CSD

(6)

式中：CSA、CSB、CSC、CSD、CSE、分別為溶解于SA、SB、SC、SD、SE的蛋白質(zhì)含量，各化學(xué)作用力相對(duì)含量以該化學(xué)作用力含量與所有化學(xué)作用力含量之和的比計(jì)算。

1.3.6 肌漿蛋白傅里葉變換紅外光譜分析

參考藍(lán)蔚青等[15]的方法。

1.3.7 肌漿蛋白內(nèi)源熒光光譜分析

參考李慶舒等[16]的方法。

1.3.8 肌漿蛋白紫外吸收光譜分析

參考康懷彬等[17]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次平行，結(jié)果用X±SD表示，數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 23軟件進(jìn)行分析，采用ANOVA進(jìn)行LSD差異分析，P<0.05表示差異顯著。Origin 2016軟件用于制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 西式熏煮火腿不同加工環(huán)節(jié)蛋白質(zhì)巰基總量變化

已有研究表明，蛋白展開的過程中原來掩埋于蛋白內(nèi)部的作用位點(diǎn)、疏水基團(tuán)和巰基基團(tuán)就會(huì)暴露于蛋白表面與風(fēng)味化合物發(fā)生共價(jià)結(jié)合[18]，將蛋白溶液由水溶性環(huán)境轉(zhuǎn)換成疏水性環(huán)境并形成二硫鍵，且蛋白分子的疏水區(qū)域和巰基基團(tuán)具有吸附性，從而增強(qiáng)蛋白的風(fēng)味吸附能力[19]。蛋白質(zhì)巰基分為表面活性巰基和包埋于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的巰基，巰基總量即蛋白質(zhì)分子的所有巰基。實(shí)驗(yàn)西式熏煮火腿不同加工環(huán)節(jié)肌漿蛋白巰基總量的變化結(jié)果如圖1所示。

圖1 西式熏煮火腿不同加工環(huán)節(jié)肌漿蛋白巰基總量的變化
Fig.1 Changes of different processing operations of western-style smoked ham on total sulfhydryl content of sarcoplasmic protein

由圖1可知，肌漿蛋白巰基總量在西式熏煮火腿加工過程中呈先逐漸降低再急速上升的趨勢，斬拌環(huán)節(jié)肌漿蛋白巰基總量最低，這可能是因?yàn)榭焖贁匕璧募羟辛?dǎo)致蛋白內(nèi)部或蛋白質(zhì)間有外在因素和環(huán)境變化。蒸煮環(huán)節(jié)肌漿蛋白巰基總量最高(P<0.01)(圖1)，在蒸煮過程中，溫度升高使掩埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的巰基基團(tuán)逐漸暴露，巰基總量升高。KO等[20]等指出熱環(huán)境導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)改變，蛋白質(zhì)分子鏈展開，暴露更多的疏水性風(fēng)味結(jié)合位點(diǎn)，這一點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.2 不同加工環(huán)節(jié)肌漿蛋白表面疏水性變化

表面疏水性的變化已成功用于反映經(jīng)加壓和超聲修飾等處理后蛋白質(zhì)三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)變化[18,21]。以ANS作為熒光探針，測定西式熏煮火腿不同加工環(huán)節(jié)肌漿蛋白表面疏水性，結(jié)果如圖2所示。

圖2 西式熏煮火腿不同加工環(huán)節(jié)肌漿蛋白表面疏水強(qiáng)度 的變化
Fig.2 Changes of different processing operations of western-style smoked ham on surface hydrophobicity of sarcoplasmic protein

由圖2可知，在西式熏煮火腿加工過程中，肌漿蛋白相對(duì)熒光強(qiáng)度先輕微降低再升高(P<0.05)，真空滾揉環(huán)節(jié)達(dá)到最大值后逐漸降低(P<0.01)，這可能與真空環(huán)境下，受到物理作用力后蛋白質(zhì)暴露更多疏水基有關(guān)。熒光強(qiáng)度所表征的表面疏水性殘基含量在加工過程中先輕微下降后增加，后逐漸降低。CHELH[22]的研究表明隨著加熱溫度的上升和加熱時(shí)間的延長(最高溫度70 ℃，加熱時(shí)間30 min)，肌原纖維蛋白的表面疏水性不斷升高。雖然蒸煮后肌肉肌漿蛋白巰基總量最高，但在西式火腿的蒸煮環(huán)節(jié)，蒸煮溫度為80 ℃時(shí)間2 h，蛋白質(zhì)在長時(shí)間蒸煮過程中發(fā)生變性且結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，故蛋白質(zhì)表面疏水性反而降低。

2.3 不同加工環(huán)節(jié)蛋白質(zhì)化學(xué)作用力變化

肌漿蛋白化學(xué)作用力變化及顯著性差異分析如表1所示。與原料肉相比，腌制、真空滾揉、斬拌和蒸煮過程中離子鍵相對(duì)含量顯著下降(P<0.05)。氫鍵相對(duì)含量除在蒸煮環(huán)節(jié)劇烈減少(P<0.05)外，在不同加工環(huán)節(jié)差異不明顯，蒸煮過程是一個(gè)加熱過程，加熱導(dǎo)致了氫鍵大量斷裂[22]。疏水相互作用相對(duì)含量在西式熏煮火腿加工過程中呈現(xiàn)上升的趨勢(P<0.05)，并在蒸煮環(huán)節(jié)達(dá)到最大值。與原料肉相比，二硫鍵相對(duì)含量在蒸煮環(huán)節(jié)最高(P<0.05)，蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生了交聯(lián)作用并促進(jìn)了二硫鍵的形成[23]，表明蒸煮后火腿蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密，凝膠強(qiáng)度增強(qiáng)。

表1 西式熏煮火腿不同加工環(huán)節(jié)化學(xué)作用力的變化Table 1 Changes of different processing operations of western-style smoked ham on chemical force of sarcoplasmic protein

注：同一列中不同小寫字母表示不同加工環(huán)節(jié)化學(xué)作用力具有顯著性差異(P<0.05)

2.4 西式熏煮火腿不同加工環(huán)節(jié)蛋白質(zhì)傅里葉變換紅外光譜分析

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)從平面到空間有一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸按序排列、二級(jí)結(jié)構(gòu)的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲、三級(jí)結(jié)構(gòu)在二級(jí)結(jié)構(gòu)上的折疊，和四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子空間排列[24]。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究主要分有兩類：一類是蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的解析，主要技術(shù)有X射線晶體衍射，核磁共振技術(shù)和電鏡技術(shù)[15]；一類是溶液中蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的研究，主要方法有熒光光譜法、傅里葉變換紅外光譜法、圓二色譜法和拉曼光譜法等[25]。通過傅里葉變換紅外光譜對(duì)西式熏煮火腿不同加工環(huán)節(jié)肌漿蛋白分子構(gòu)象進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 西式熏煮火腿不同加工環(huán)節(jié)蛋白質(zhì)傅里葉變換 紅外光譜圖
Fig.3 Fourier transform infrared spectra of sarcoplasmic protein at different processing operations of western-style smoked ham

2.5 西式熏煮火腿不同加工環(huán)節(jié)蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光光譜分析

蛋白質(zhì)變性會(huì)導(dǎo)致其構(gòu)象發(fā)生變化，從而改變芳香族氨基酸殘基的位置和微環(huán)境，芳香族氨基酸殘基可吸收紫外線入射光以發(fā)出熒光，因此內(nèi)源性熒光光譜可用于研究蛋白質(zhì)構(gòu)象[31]。

西式熏煮火腿不同加工環(huán)節(jié)肌漿蛋白熒光發(fā)射光譜如圖4所示。由圖4可知原料肉肌漿蛋白的熒光峰位置在338 nm，腌制和蒸煮后肌漿蛋白的熒光峰位置相對(duì)于原料肉發(fā)生紅移，熒光峰位置分別為349 nm和352.96 nm，且蒸煮后熒光強(qiáng)度降低(P<0.05)，這與LEFEVRE等的研究結(jié)果大西洋鮭肌原纖維蛋白分子隨著加熱溫度的升高，內(nèi)源熒光強(qiáng)度逐漸降低的結(jié)果一致[32]。真空滾揉和斬拌后肌漿蛋白的熒光峰位置相對(duì)于原料肉發(fā)生藍(lán)移，熒光峰位置分別為327.96 nm和329.06 nm。熒光峰位置藍(lán)移表明熒光發(fā)射基團(tuán)處于更加疏水的環(huán)境中，蛋白分子的微環(huán)境發(fā)生了變化，也能反映出肌漿蛋白表面疏水性的增大[21]。這與肌漿蛋白表面疏水性結(jié)果一致。

圖4 西式熏煮火腿不同加工環(huán)節(jié)蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光光譜
Fig.4 Intrinsic fluorescence spectra of sarcoplasmic protein at different processing operations of western-style smoked ham

2.6 西式熏煮火腿不同加工環(huán)節(jié)蛋白質(zhì)紫外吸收光譜分析

蛋白中的色氨酸 (Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)殘基的芳香結(jié)構(gòu)對(duì)紫外光有吸收作用使得蛋白能夠吸收紫外光[33]。280 nm左右處的峰為蛋白中Trp、Tyr以及Phe殘基中共軛雙鍵的吸收峰，代表的是蛋白中氨基酸殘基微環(huán)境的變化，因此紫外線吸收光譜法可用于研究蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[34]。西式熏煮火腿不同加工環(huán)節(jié)蛋白質(zhì)紫外吸收光譜如圖5所示。

圖5 西式熏煮火腿不同加工環(huán)節(jié)蛋白質(zhì)紫外吸收光譜
Fig.5 Ultraviolet-visible spectra of sarcoplasmic protein at different processing of western-style smoked ham

由圖5可知，原料肉中肌漿蛋白紫外最大吸收峰波長(λmax)在284 nm處產(chǎn)生了特征吸收峰，與原料肉相比不同加工環(huán)節(jié)均發(fā)生了不同程度的紅移，腌制、真空滾揉、斬拌和蒸煮環(huán)節(jié)肌漿蛋白λmax分別紅移至293、299、294和297 nm，說明在西式熏煮火腿加工過程中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化或者受到溶劑效應(yīng)的影響，從而使λmax向長波方向移動(dòng)。與真空滾揉環(huán)節(jié)相比，斬拌環(huán)節(jié)λmax發(fā)生輕微藍(lán)移，說明斬拌后使得色氨酸和酪氨酸殘基暴露于蛋白質(zhì)表面，其所處微環(huán)境由非極性偏向極性[35]，這一結(jié)果與巰基總量、表面疏水性的結(jié)果相符合。

3 結(jié)論

在西式熏煮火腿加工過程中，肌漿蛋白巰基總量呈先逐漸降低再急速上升的趨勢，分別在斬拌環(huán)節(jié)最低、蒸煮環(huán)節(jié)最高，肌漿蛋白表面疏水強(qiáng)度則呈先輕微降低后升高再逐漸降低，分別在真空滾揉環(huán)節(jié)最高、蒸煮環(huán)節(jié)最低，表明真空環(huán)境下，受到物理作用力后蛋白質(zhì)暴露更多疏水基。離子鍵與氫鍵在西式熏煮火腿不同加工環(huán)節(jié)發(fā)生不同程度的斷裂，疏水相互作用則表現(xiàn)出上升趨勢，二硫鍵的形成與巰基含量相關(guān)，在蒸煮環(huán)節(jié)二硫鍵相對(duì)含量最高。肌漿蛋白酰胺A帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶均發(fā)生了移動(dòng)，且不同加工環(huán)節(jié)肌漿蛋白氨基酸殘基吸光度不同，說明蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變。紫外吸收光譜和內(nèi)源熒光光譜結(jié)果表明，不同加工環(huán)節(jié)對(duì)肌漿蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，在蒸煮環(huán)節(jié)尤為明顯，更多蛋白質(zhì)殘基暴露于蛋白質(zhì)表面。

肌漿蛋白在西式熏煮火腿加工中扮演了重要的角色，蛋白質(zhì)化學(xué)作用力與結(jié)構(gòu)變化表明肌漿蛋白有更多與風(fēng)味物質(zhì)結(jié)合的可能，在西式熏煮火腿實(shí)際加工過程中，可以將煙熏液的使用與產(chǎn)品感官品質(zhì)結(jié)合，本研究條件下在真空滾揉環(huán)節(jié)加入煙熏液為宜。