范曉旭，周美麗，楊春花，楊偉

(大理州食品檢驗(yàn)檢測院，云南 大理，671000)

藻類食品富含人體必需的氨基酸、蛋白質(zhì)、微量元素、小分子多糖等生物活性物質(zhì)，具有重要的營養(yǎng)、保健和醫(yī)療價(jià)值[1]。如被日本譽(yù)為“長壽菜”的羊棲菜以及“人類最理想的蛋白源”的螺旋藻就具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功效[2]。但由于受水源、農(nóng)藥等影響，易被重金屬污染，所以測定藻類食品中金屬元素含量具有重要意義[3]。周小瑞等[4]用微波消解-原子吸收法測定銅藻中多種微量元素。胡越等[5]用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定螺旋藻中16種礦物元素含量。電感耦合等離子質(zhì)譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)因其靈敏度高、檢出限低、抗干擾性強(qiáng)、可同時(shí)測定多元素，而被廣泛應(yīng)用[6]。

目前，常用的藻類樣品中礦物元素分析的前處理方法主要有干法灰化、濕法消解、微波消解等。干法灰化和濕法消解操作繁瑣，待測組分易被損失和污染；微波消解法用酸量大，反應(yīng)劇烈，污染環(huán)境，不利于實(shí)驗(yàn)人員的健康[7]。近年來高效、環(huán)保的超聲酶解法陸續(xù)被報(bào)道[8-10]。超聲酶解技術(shù)將超聲波萃取技術(shù)與酶萃取技術(shù)相結(jié)合，酶的生化作用可將蛋白質(zhì)斷裂為氨基酸從而釋放出其中的金屬元素，超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)以及熱效應(yīng)能夠促進(jìn)酶解反應(yīng)[11-12]。超聲酶解法具有提取率高、待測物不易揮發(fā)損失、反應(yīng)過程溫和、提取條件綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，在食品檢測、土壤分析等方面有較多應(yīng)用[13-14]。YILMAZ等[15]用超聲胃蛋白酶解-原子吸收法測定青蔥中的錳，試驗(yàn)通過比較胃蛋白酶、淀粉酶和胰蛋白酶的提取效果，確定胃蛋白酶為最佳提取劑，之后對pH值、酶的用量、超聲溫度等提取條件進(jìn)行優(yōu)化，從而得到青蔥中錳的最佳提取方案。

本工作通過螺旋藻超聲酶解條件的優(yōu)化，建立一種超聲酶提取-ICP-MS分析螺旋藻樣品中錳(Mn)、鋅(Zn)、鍶(Sr)、鎘(Cd)的方法，以期為藻類樣品中礦物元素的分析提供一種溫和、綠色、快速且準(zhǔn)確的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液：質(zhì)量濃度為10 μg/mL；調(diào)諧溶液：Ce、Co、Li、Mg、Tl、Y，質(zhì)量濃度為1 μg/L；內(nèi)標(biāo)溶液：Sc、Ge、Rh、In，質(zhì)量濃度為100 μg/mL，均購于美國Agilent公司；胃蛋白酶、纖維素酶，上海源葉生物科技有限公司；螺旋藻標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW10025)，地球物理地球化學(xué)勘查研究所；HNO3(AR)，德國Merck；鹽酸(GR)，國藥試劑；螺旋藻片、羊棲菜、海發(fā)菜、冰藻，市售。

1.2 儀器與設(shè)備

7900型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；微波消解儀，意大利Milestone公司；VB24 up趕酸儀，北京萊伯泰科公司；渦旋振蕩器，德國IKA公司；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；雷磁pHS-3C型PH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDL-40B高速臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；FW-100高速萬能粉碎機(jī)，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；電子分析天平，METLER TOLEDO。優(yōu)化后的ICP-MS工作條件如表1所示。

表1 ICP-MS工作條件Table 1 ICP-MS operating parameters

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

樣品經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎后過80目篩，置于干燥器中備用。

1.3.1.1 超聲胃蛋白酶提取法

稱取0.2 g(精確到0.001 g)螺旋藻樣品于15 mL離心管中，加入20 mg胃蛋白酶，再加入7.0 mL超純水，用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至1.0，渦旋混勻1 min，然后于45 ℃的超聲儀中水浴超聲20 min，在4 000 r/min的條件下離心10 min，取其上清液，用超純水定容至10 mL備用。測定前經(jīng)0.45 μm的水系濾膜過濾。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。

1.3.1.2 超聲纖維素酶提取法

稱取0.2 g(精確到0.001 g)螺旋藻樣品于15 mL離心管中，加入20 mg纖維素酶，再加入7.0 mL超純水，用0.1 mmol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.0，渦旋混勻1 min，然后于55 ℃的超聲儀中水浴超聲20 min，在4 000 r/min的條件下離心10 min，取其上清液，用超純水定容至10 mL備用。測定前經(jīng)0.45 μm的水系濾膜過濾。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。

1.3.1.3 超聲稀HCl(pH=1.0)提取法

與1.3.1.1相同的試驗(yàn)條件下，不加入胃蛋白酶進(jìn)行試驗(yàn)。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。

1.3.1.4 微波消解法

稱取0.2 g(精確到0.001 g)螺旋藻樣品于消解管中，參考GB 5009.268—2016[16]中第一法(ICP-MS法)的微波消解法進(jìn)行消解。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

本研究采用超聲酶解法提取藻類中的Mn、Zn、Sr和Cd。由于不同的提取劑、pH值、超聲溫度、酶的質(zhì)量、超聲時(shí)間和液料比對提取Mn、Zn、Sr、Cd會(huì)產(chǎn)生不同的影響，所以實(shí)驗(yàn)比較了螺旋藻樣品在不同提取條件時(shí)的提取效率。以傳統(tǒng)的微波消解法為對照，提取效率為不同提取條件下測定的樣品含量值與微波消解法測定的樣品含量值的比率，從而選擇出最佳配比組合。

2.1.1 提取劑的選擇

根據(jù)螺旋藻蛋白質(zhì)含量高且具有細(xì)胞壁的特性，分別選擇胃蛋白酶、纖維素酶和稀HCl(pH=1.0)作為提取劑，考察不同的提取劑對螺旋藻中Mn、Zn、Sr、Cd提取效果的影響。結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明，采用胃蛋白酶的提取效果最佳，提取效率為93%～100%；稀HCl(pH=1.0)的提取效率為83%～91%；纖維素酶的提取效率均低于60%。選擇胃蛋白酶為提取劑作進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

圖1 提取劑對Mn、Zn、Sr、Cd提取效率的影響
Fig.1 Influence of extracting agent on extraction efficiency of Mn, Zn, Sr and Cd

2.1.2 pH值的優(yōu)化

按照1.3.1.1試驗(yàn)方法，在其他條件不變的情況下，考察pH為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0時(shí)，螺旋藻中Mn、Zn、Sr、Cd的提取效率。結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明，提取效率隨pH值的增加而降低后趨于平穩(wěn)。pH值對酶反應(yīng)速率的影響較大，胃蛋白酶的最適pH為1～2[17]，過高的pH值環(huán)境會(huì)導(dǎo)致酶蛋白的變性。選擇pH值為1.0最優(yōu)。

圖2 pH值對Mn、Zn、Sr、Cd提取效率的影響
Fig.2 Influence of pH on extraction efficiency of Mn, Zn, Sr and Cd

2.1.3 超聲水解溫度的優(yōu)化

相同的試驗(yàn)條件下，考察超聲水解溫度為25、35、40、45、50和60 ℃時(shí)對Mn、Zn、Sr、Cd提取效果的影響。結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，當(dāng)溫度為45或50 ℃時(shí)，Mn、Zn、Sr、Cd提取率均在95%以上，但溫度過低或過高時(shí)提取率均呈下降趨勢。溫度過低會(huì)使胃蛋白酶的活性受到抑制，過高會(huì)破壞胃蛋白酶分子中多肽鏈的鏈接。選擇最佳超聲水解溫度為45 ℃。

圖3 超聲溫度對Mn、Zn、Sr、Cd提取效率的影響
Fig.3 Influence of extraction temperature on extraction efficiency of Mn, Zn, Sr and Cd

2.1.4 酶添加量的優(yōu)化

分別在樣品中加入5、10、20、30、40、50 mg的胃蛋白酶。結(jié)果如圖4所示，酶用量為20 mg時(shí)各元素提取效率均能在96%以上；酶添加量為5 mg時(shí)，提取效率低于86%，酶量過低不利于酶與底物的充分反應(yīng)；酶量增加提取速率也不再提高，過量的酶會(huì)包裹原料顆粒，不利于產(chǎn)物的溶出。結(jié)合經(jīng)濟(jì)性最終選擇酶添加量為20 mg。

圖4 酶添加量對Mn、Zn、Sr、Cd提取效率的影響
Fig.4 Influence of amount of enzyme on extraction efficiency of Mn, Zn, Sr and Cd

2.1.5 超聲時(shí)間的優(yōu)化

分別超聲酶解樣品5、10、20、30、40、50 min。結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明，隨著超聲時(shí)間的增加Mn、Zn提取效率也提高，并在20 min后趨于平穩(wěn)，超聲時(shí)間延長可增加原料與提取液的接觸時(shí)間。Sr、Cd隨超聲時(shí)間的變化無明顯差異。選擇最優(yōu)超聲時(shí)間為20 min。

圖5 超聲時(shí)間對Mn、Zn、Sr、Cd提取效率的影響
Fig.5 Influence of ultrasonic time on extraction efficiency of Mn, Zn, Sr and Cd

2.1.6 液料比的優(yōu)化

不同的液料比對Mn、Zn、Sr、Cd提取效率的影響如圖6所示。當(dāng)液料比(mL∶g)為2∶0.2和4∶0.2時(shí)，Mn的提取效率低于80%，當(dāng)液料比(mL∶g)為6∶0.2時(shí)，Mn提取效率迅速提高，達(dá)最大值98%；Zn的提取效率隨液料比的增加而增加，并在液料比(mL∶g)為7∶0.2時(shí)趨于穩(wěn)定；Sr的提取效率在液料比(mL∶g)為4∶0.2時(shí)趨于穩(wěn)定并且達(dá)90%以上；當(dāng)液料比(mL∶g)為2∶0.2時(shí)，Cd提取效率低于50%，當(dāng)液料比(mL∶g)為7∶0.2及以上時(shí)，Cd提取效率達(dá)100%。綜合考慮提取效率和成本，選擇最佳液料比(mL∶g)為7∶0.2。

圖6 液料比對Mn、Zn、Sr、Cd提取效率的影響
Fig.6 Influence of solvent to substrate ratio on extraction efficiency of Mn, Zn, Sr and Cd

2.2 ICP-MS的干擾及校正

本實(shí)驗(yàn)選用7Li、89Y和205Tl作為矯正因子使儀器分辨率在0.65～0.80 amu，氧化物(156/140)≤2%，雙電荷(70/140)≤3.0%，根據(jù)豐度高、干擾小的原則選擇最佳同位素55Mn、66Zn、88Sr、111Cd，使用八級桿氦模式及四級桿質(zhì)量過濾器消除質(zhì)譜型干擾。通過加入1 μg/mL的45Sc、72Ge、103Rh、115In內(nèi)標(biāo)混合溶液，采用與樣品溶液相同濃度的鹽酸配制標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行基體匹配消除基體效應(yīng)。

2.3 線性關(guān)系與檢出限

分別配制0.0、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的Cd元素標(biāo)準(zhǔn)溶液系列和0.0、20.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0 μg/L的Mn、Zn、Sr元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以質(zhì)量濃度為1 000 μg/L的115In、45Sc、72Ge、103Rh分別作為111Cd、55Mn、66Zn、88Sr的內(nèi)標(biāo)元素進(jìn)行校正。對試劑空白溶液連續(xù)進(jìn)行11次測定，計(jì)算方法檢出限。線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限如表2所示。結(jié)果表明，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，各元素線性良好，相關(guān)系數(shù)均≥0.999 6。超聲酶解法對酸的需求量少，反應(yīng)溫和，檢出限為0.001 5～0.086 2 mg/kg。

表2 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 The linear regression equation, correlation coefficients and detection limit

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

按照優(yōu)化的超聲酶解條件，對螺旋藻樣品進(jìn)行6份平行試驗(yàn)，分別測定55Mn、66Zn、88Sr、111Cd元素含量，并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)。結(jié)果如表3所示，結(jié)果表明，優(yōu)化的超聲酶解法用于螺旋藻中55Mn、66Zn、88Sr、111Cd的測定其RSD在0.36%～3.51%，測定結(jié)果有較好的一致性，方法重復(fù)性良好。

表3 超聲酶解法測定結(jié)果及精密度(n=6)Table 3 The determination results and precision by ultrasonic enzyme extraction(n=6)

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取螺旋藻樣品0.2 g，置于離心管中，分別加入3個(gè)濃度水平的55Mn、66Zn、88Sr、111Cd混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同的試驗(yàn)條件下進(jìn)行測定，計(jì)算樣品加標(biāo)回收率。結(jié)果如表4所示，超聲酶解提取法的加標(biāo)回收率在89.5%～107.8%，回收率較好，說明該法準(zhǔn)確可靠。

表4 超聲酶解法的加標(biāo)回收率(n=3)Table 4 Recovery rate of ultrasonic enzyme extraction(n=3)

2.6 質(zhì)控樣品校驗(yàn)

為進(jìn)一步驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，按照優(yōu)化的樣品前處理方法對國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)螺旋藻(GBW10025)進(jìn)行測定，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的55Mn、66Zn、88Sr、111Cd測定值均在標(biāo)準(zhǔn)值范圍之內(nèi)，符合證書要求。結(jié)果如表5所示。

表5 螺旋藻(GBW10025)測定結(jié)果(n=3)Table 5 Determination results of spirulina (GBW10025)(n=3)

2.7 藻類樣品的測定

采用優(yōu)化好的前處理及檢測方法，對市售的藻類食品(羊棲菜、冰藻、海發(fā)菜)中的55Mn、66Zn、88Sr、111Cd進(jìn)行測定。并與微波消解法的測定值相比計(jì)算提取效率，測定結(jié)果如表6所示。結(jié)果顯示，羊棲菜、冰藻、海發(fā)菜中的55Mn、66Zn元素提取率均在84%以上，88Sr、111Cd元素均在94%以上。相較傳統(tǒng)的微波消解法，超聲酶解法用酸量少、耗時(shí)短且反應(yīng)過程溫和，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，用于藻類食品中Mn、Zn、Sr、Cd的提取具有一定的普適性。

表6 藻類樣品測定結(jié)果(n=3)Table 6 Determination results of algal samples(n=3)

3 結(jié)論

本研究建立了超聲酶解提取-ICP-MS法測定藻類中Mn、Zn、Sr、Cd含量的分析方法。通過選擇合適的提取劑及優(yōu)化酶解條件獲得了元素的最佳提取效果。該法精密度和準(zhǔn)確度良好，對國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)螺旋藻(GBW10025)進(jìn)行處理，測定結(jié)果均在參考值范圍內(nèi)。與國家標(biāo)準(zhǔn)中的微波消解法相比，藻類食品中Mn、Zn、Sr、Cd的提取率均在84%以上。與傳統(tǒng)的前處理方法相比，該法操作簡單，用酸量少，綠色節(jié)能，反應(yīng)過程無物料損失且無副反應(yīng)發(fā)生。整個(gè)前處理過程可在40 min內(nèi)完成，且不需要趕酸，更加高效快速。超聲酶解提取技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景，在以后的工作中可以進(jìn)一步開展不同的酶在其他食品元素中提取的研究。