晏子友，魏志鑫，羅富里△，萬鳴宏

（1江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西南昌330006；2江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西南昌330000）

大量證據(jù)表明，尿毒癥毒素，特別是蛋白結(jié)合類亞群，如硫酸吲哚酚（indoxyl sulfate，IS），不能通過日常血液透析有效清除，是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素之一[1-2]。先前的一項(xiàng)臨床研究表明，高血清IS水平與慢性腎臟疾病（chronic kidney disease，CKD）患者的心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）死亡率相關(guān)[3]。最近，有研究證實(shí)了IS在體外可通過增強(qiáng)氧化應(yīng)激上調(diào)心肌細(xì)胞的自噬水平[4]。但是，目前尚不清楚IS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬的更深層機(jī)制。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是小的內(nèi)源性非編碼RNA，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。據(jù)報(bào)道，miR-22是一種進(jìn)化保守的miRNA，在心臟組織中高度表達(dá)，并可作為心臟重塑的重要調(diào)節(jié)劑[5]。研究發(fā)現(xiàn)miR-22可調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的自噬[6]。巨噬細(xì)胞是尿毒癥微環(huán)境的重要組成部分，在很大程度上影響著CVD的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸[7]。外泌體（exosomes，Exos）是由包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞釋放的囊泡，內(nèi)含大量miRNAs[7-8]。本研究探討了IS刺激巨噬細(xì)胞分泌的外泌體對(duì)心肌細(xì)胞自噬的影響，分析IS是否通過調(diào)控外泌體的miR-22表達(dá)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬。

材料和方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)

人單核細(xì)胞株THP-1和大鼠心肌細(xì)胞株H9c2購(gòu)自ATCC。THP-1細(xì)胞在含有10%胎牛血清、青霉素（1×105U/L）和鏈霉素（100 mg/L）的RPMI-1640培養(yǎng)基（HyClone）中培養(yǎng)。H9c2細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（Thermo Scientific）中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 IS刺激巨噬細(xì)胞及外泌體分離 將THP-1細(xì)胞（5×108/L）接種到10 cm培養(yǎng)皿中。加入佛波酯（130 μg/L；Sigma）誘導(dǎo)24 h，棄去上清液，加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，然后加入IS（500 μmol/L；Sigma）處理細(xì)胞48 h。對(duì)照組加入相同體積PBS處理。

使用ExoQuick外泌體快速提取試劑盒（Biomars）從培養(yǎng)基上清液中分離外泌體。具體操作為：將培養(yǎng)基以3 000×g離心15 min以去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片，然后在預(yù)沖洗的離心過濾裝置（Amicon Ultra-15；Millipore）中以5 000×g離心30 min；通過渦旋進(jìn)一步將樣品與ExoQuick-TC試劑混合，孵育過夜，在4℃下以1 500×g離心30 min，取沉淀并重懸于無酶水中。

2.2 透射電子顯微鏡法觀察外泌體 將從細(xì)胞培養(yǎng)基中獲得的沉淀物洗滌并重懸于0.2%多聚甲醛中。取3 μL重懸的沉淀物液滴在Formvar-碳涂層的鎳電子顯微鏡（Electron Microscopy Sciences）格柵上，并在室溫下孵育5 min，用1.75%乙酸鈾酰染色，PBS洗滌格柵，并使其在室溫下半干燥，然后在H7500透射電子顯微鏡（HITACHI）中觀察外泌體。

2.3 高效液相色譜-熒光法（high-performance liquid chromatography with fluorescence detection，HPLCFLU）檢測(cè)外泌體中IS 參照文獻(xiàn)方法[9]用LC-20A+RF20A高效液相色譜系統(tǒng)（Shimadzu）檢測(cè)外泌體中是否存在IS。

2.4 RT-qPCR分析巨噬細(xì)胞及其外泌體中miR-22的水平 通過RNA提取試劑盒（Promega）提取總RNA。使用PrimeScipt RT試劑盒（TaKaRa）和莖環(huán)引物（5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGAGTG-3'）對(duì)分離的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用SYBR試劑盒（Bio-Rad）通過MX3000p實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Stratagene）進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。將反應(yīng)物在96孔板中于95℃擴(kuò)增5 min；然后95℃10 s、55.7℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。通過2-ΔΔCt法計(jì)算miR-22的相對(duì)表達(dá)。miR-22和內(nèi)參照U6的正向引物序列分別為5'-GCCTGAAGCTGCCAGTTGA-3'和5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物序列分別為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'和5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

2.5 巨噬細(xì)胞外泌體對(duì)H9c2細(xì)胞活力的影響H9c2細(xì)胞以每孔4×104個(gè)接種于96孔板，分為對(duì)照組和不同濃度外泌體組，每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。不同濃度外泌體組分別加入含10、20、30、40和50 mg/L外泌體的培養(yǎng)液；對(duì)照組加入不含外泌體等體積的培養(yǎng)液處理。處理48 h后，使用CCK-8試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）評(píng)估細(xì)胞活力。在37℃的黑暗環(huán)境中溫育1 h后，用Synergy HT多功能酶標(biāo)儀（BioTek）測(cè)量每個(gè)孔在450 nm的吸光度（A）。

2.6 巨噬細(xì)胞外泌體進(jìn)入H9c2細(xì)胞的內(nèi)在化 將巨噬細(xì)胞外泌體在37℃的黑暗環(huán)境中用PKH26（Sigma）標(biāo)記15 min后在PBS中洗滌3次，并在4℃以100 000×g離心2 h。然后，將標(biāo)記的外泌體添加到制備的H9c2細(xì)胞中分別共培養(yǎng)12和21 h。溫育后，將細(xì)胞用PBS洗滌1次，并用含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的 PBS將細(xì)胞核染色5 min。使用熒光顯微鏡觀察H9c2細(xì)胞攝取巨噬細(xì)胞外泌體的情況。

2.7 Western blot檢測(cè)H9c2細(xì)胞中外泌體表面標(biāo)志蛋白CD63及自噬相關(guān)蛋白P62和LC3的表達(dá) 使用RIPA裂解緩沖液從經(jīng)外泌體處理的H9c2細(xì)胞中（處理方法同2.5）提取總蛋白質(zhì)。BCA定量后，在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，將蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜與Ⅰ抗[抗CD63、P62、LC3及GAPDH抗體（1∶1 000）；購(gòu)自Cell Signaling Technology]在4℃孵育過夜。將膜與Ⅱ抗（1∶8 000；購(gòu)自Abcam）在室溫下孵育2 h。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)免疫復(fù)合物。

2.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，以每孔5×104個(gè)接種于24孔板，每孔加入含20 mg/L外泌體的培養(yǎng)液。然后用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑（Sigma）分別將miR-22模擬物（miR-22 mimic）和miR-22抑制物（miR-22 inhibitor）轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。加入相應(yīng)的亂碼miRNA作為對(duì)照（mimic NC和inhibitor NC）。處理48 h后，收集細(xì)胞并進(jìn)行上述測(cè)定。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)至少3次，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。使用單因素方差分析（one-way ANOVA）和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析組間差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 IS對(duì)巨噬細(xì)胞及其分泌的外泌體和H9c2細(xì)胞中miR-22表達(dá)的影響

在IS刺激下，通過透射電子顯微鏡在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中觀察到直徑在40～100 nm之間的圓形結(jié)構(gòu)，見圖1A，并且IS刺激的巨噬細(xì)胞中外泌體表面標(biāo)志蛋白CD63的水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），見圖1B，表明巨噬細(xì)胞在IS刺激下可分泌外泌體。此外，HPLC-FLU分析顯示IS已在外泌體提取過程中被清除掉，見圖2。與對(duì)照組相比，IS組巨噬細(xì)胞及其分泌的外泌體和H9c2細(xì)胞中miR-22的水平均顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖3。

Figure 2.HPLC-FLU analysis chromatogram of IS.A：macrophage-derived exosomes；B：macrophage-derived exosomes+IS.圖2 IS的HPLC-FLU分析色譜圖

2 外泌體進(jìn)入H9c2細(xì)胞的內(nèi)在化

外泌體與H9c2細(xì)胞共培養(yǎng)12 h后，部分PKH26標(biāo)記的外泌體位于H9c2細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中；21 h后，可見大部分外泌體位于H9c2s細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，見圖4。這些數(shù)據(jù)表明，巨噬細(xì)胞外泌體可被內(nèi)化到H9c2細(xì)胞中。

3 外泌體對(duì)H9c2細(xì)胞自噬的影響

Figure 3.The effect of IS on expression of miR-22 in the macrophages，macrophage-derived exosomes（Exos） and H9c2 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group.圖3 IS對(duì)巨噬細(xì)胞及其分泌外泌體和H9c2細(xì)胞中miR-22表達(dá)的影響

使用CCK-8法測(cè)定H9c2細(xì)胞的活力，結(jié)果顯示，隨著外泌體濃度的增大，H9c2細(xì)胞的活力逐漸降低（P＜0.05），見圖5A。與對(duì)照組相比，不同濃度外泌體均可顯著上調(diào)H9c2細(xì)胞中miR-22的水平，這種影響呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖5B。除了細(xì)胞活力降低和miR-22水平增加外，Western blot分析顯示，巨噬細(xì)胞外泌體的刺激降低了H9c2細(xì)胞P62的表達(dá)，并促進(jìn)了LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化，這種變化呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖5C，表明巨噬細(xì)胞外泌體刺激提高了H9c2細(xì)胞的自噬水平。

Figure 4.Representative photos of the H9c2 cells uptaking PKH26-labeled macrophage-derived exosomes at 12 and 21 h.圖4 PKH26標(biāo)記的巨噬細(xì)胞外泌體與H9c2細(xì)胞共培養(yǎng)12和21 h可內(nèi)化到H9c2細(xì)胞中

Figure 5.Effects of macrophage-derived exosomes（Exos）on the viability and autophagy of H9c2 cells.A：the effect of Exos on the viability of H9c2 cells；B：the effect of Exos on the expression of miR-22 in the H9c2 cells；C：the effect of Exos on the protein expression of autophagy markers P62 and LC3 in the H9c2 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖5 外泌體對(duì)H9c2細(xì)胞活力和自噬的影響

4 miR-22促進(jìn)外泌體誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬

在巨噬細(xì)胞外泌體刺激下，用miR-22抑制物轉(zhuǎn)染的H9c2細(xì)胞比用陰性對(duì)照miRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞具有更高的活力，而與miR-22模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞表現(xiàn)出更高的活力，見圖6A。探討miR-22表達(dá)的改變是否會(huì)影響自噬的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在巨噬細(xì)胞外泌體刺激條件下，miR-22模擬物轉(zhuǎn)染的H9c2細(xì)胞與相應(yīng)的陰性對(duì)照miRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比具有顯著更高的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率及更低的P62蛋白表達(dá)水平；而miR-22抑制物則產(chǎn)生了相反的結(jié)果，見圖6B。這些結(jié)果證實(shí)了miR-22在一定程度上參與了巨噬細(xì)胞外泌體促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬的過程。

討 論

透析患者的心血管疾病具有復(fù)雜且多方面的病理生理學(xué)特征，與收縮和舒張功能障礙、容量超負(fù)荷、動(dòng)脈高血壓和交感神經(jīng)活化均有關(guān)[10]。除了這些傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素外，越來越多的證據(jù)表明，尿毒癥毒素可能與CKD患者的CVD發(fā)展有關(guān)[2-3]。IS是腸道來源的尿毒癥毒素，近年來研究顯示其對(duì)心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞具有促肥大、促纖維化和促炎作用[11]。在一項(xiàng)針對(duì)258名尿毒癥患者的多中心研究中，IS水平升高與隨后的心力衰竭相關(guān)[12]。巨噬細(xì)胞是尿毒癥微環(huán)境的重要組成部分之一，先前研究發(fā)現(xiàn)IS可直接調(diào)控巨噬細(xì)胞的功能，促進(jìn)其介導(dǎo)的心肌纖維化[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，IS刺激下可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌外泌體，并且外泌體與H9c2細(xì)胞共培養(yǎng)可顯著增加H9c2細(xì)胞的自噬水平。因此，巨噬細(xì)胞分泌的外泌體可能在IS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬中發(fā)揮重要作用。

外泌體是新近發(fā)現(xiàn)的一類小囊泡，被認(rèn)為是細(xì)胞間通信的主要方式之一，其分泌可見于包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的幾乎所有細(xì)胞[15]。外泌體的主要特征包括杯狀形態(tài)、40～100 nm直徑和特定脂質(zhì)筏蛋白如CD63的富集[16]。本研究觀察到巨噬細(xì)胞分泌的外泌體的直徑在40～100 nm之間，呈圓形結(jié)構(gòu)。外泌體中含有大量miRNAs，其中一些miRNAs已成為心血管疾病基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子。先前的研究表明，循環(huán)miR-22可以通過靶向p38α來促進(jìn)饑餓心肌細(xì)胞的自噬[5]。此外，據(jù)報(bào)道m(xù)iR-22過表達(dá)可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中的自噬，這表明miR-22在細(xì)胞自噬中具有重要作用[6]。本研究中，IS刺激可顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞及其分泌的外泌體中miR-22的上調(diào)，并且miR-22上調(diào)可顯著促進(jìn)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，同時(shí)降低P62蛋白的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miR-22抑制物則產(chǎn)生了相反的結(jié)果。LC3是關(guān)鍵的自噬調(diào)節(jié)蛋白，有Ⅰ型和Ⅱ型兩個(gè)亞型，其中，LC3-Ⅱ型蛋白的生成與自噬的發(fā)生有關(guān)[17]。P62在細(xì)胞質(zhì)中合成，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，P62與LC3-Ⅱ蛋白結(jié)合，并在自噬溶酶體中降解[17]。因此，P62水平會(huì)隨著自噬的發(fā)生而降低。這些結(jié)果證實(shí)了miR-22參與了巨噬細(xì)胞外泌體誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬。

Figure 6.miR-22 promoted autophagy of H9c2 cells induced by macrophage-derived exosomes（Exos）.A：the effect of miR-22 mimic and miR-22 inhibitor on the viability of H9c2 cells induced by Exos；B：the effects of miR-22 mimic and miR-22 inhibitor on the protein expression of autophagy markers P62 and LC3 in the H9c2 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs mimic NC+Exos group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs inhibitor NC+Exos group.圖6 miR-22促進(jìn)巨噬細(xì)胞外泌體誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞自噬

綜上所述，IS刺激的巨噬細(xì)胞可通過外泌體途徑上調(diào)心肌細(xì)胞miR-22的表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞的自噬反應(yīng)。這揭示了一種新的心肌細(xì)胞在尿毒癥微環(huán)境下發(fā)生自噬的調(diào)控機(jī)制。