楊莉莉，海博寧，邵吉民

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系，浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤研究所，浙江杭州310058）

人類(lèi)腫瘤的動(dòng)物異種移植模型是腫瘤研究的關(guān)鍵臨床前工具。目前最常用的動(dòng)物移植瘤模型是免疫缺陷小鼠模型。近十年來(lái)，由于斑馬魚(yú)（Danio rerio）與人類(lèi)基因組同源性高達(dá)70%，個(gè)體小，可大規(guī)?？焖俜敝?，胚體透明易于觀察，發(fā)育前一個(gè)月無(wú)適應(yīng)性免疫，以及成本低等原因[1-2]，這種動(dòng)物模型逐漸發(fā)展成為另一種相對(duì)快速且具有較高成本效益的人類(lèi)腫瘤體內(nèi)研究模型。本綜述中，我們討論了使用斑馬魚(yú)模型的優(yōu)勢(shì)及其局限性，并與小鼠模型進(jìn)行了對(duì)比；整理了目前斑馬魚(yú)移植瘤模型的構(gòu)建及不同的類(lèi)型；總結(jié)了該模型在抗腫瘤藥物研發(fā)和臨床治療研究中的應(yīng)用及其在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景。

1 斑馬魚(yú)模型的優(yōu)勢(shì)與局限性

1.1 生物學(xué)特性 斑馬魚(yú)在二十世紀(jì)六十年代成為發(fā)育遺傳學(xué)的典范生物。由于斑馬魚(yú)體外受精、體外發(fā)育、胚體完全透明的特征，使得研究者不僅能通過(guò)記錄特定細(xì)胞在胚胎發(fā)育中的分裂歷史，跟蹤觀察每一個(gè)細(xì)胞的發(fā)育命運(yùn)，同時(shí)也給遺傳操作和人工誘變提供了極為有利的條件[3]。斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育迅速，從單細(xì)胞受精卵發(fā)育至具有可辨認(rèn)的脊椎動(dòng)物體節(jié)、跳動(dòng)的心臟和正常的神經(jīng)系統(tǒng)，只需要1周時(shí)間[4]，因此應(yīng)用于藥物篩選大多在1周內(nèi)即可完成。斑馬魚(yú)模型不僅使實(shí)驗(yàn)周期大大縮短，實(shí)驗(yàn)通量大為提高，而且斑馬魚(yú)在出生后1周內(nèi)，胚胎只需置于培養(yǎng)皿中，其會(huì)消耗自身的卵黃作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，無(wú)需人工喂食或維護(hù)，只需偶爾更換培養(yǎng)基，極大地節(jié)約了實(shí)驗(yàn)空間和飼養(yǎng)消耗。

1.2 免疫學(xué)特性 斑馬魚(yú)的先天免疫系統(tǒng)至少在受精后2 d（2 d post-fertilization，2 dpf）時(shí)才發(fā)揮其功能，而在受精后約4～6周時(shí)其適應(yīng)性免疫在形態(tài)和功能上才趨于成熟[5-7]。因此如果在斑馬魚(yú)早期胚胎階段（囊胚階段至受精后48 h），即其適應(yīng)性免疫應(yīng)答尚未建立時(shí)，通過(guò)顯微注射建立異種移植則不需要免疫抑制劑處理。所以在斑馬魚(yú)早期胚胎中進(jìn)行的研究是在其不具有完全免疫能力情況下進(jìn)行的。

1.3 可視化特性 斑馬魚(yú)胚體透明可實(shí)現(xiàn)體內(nèi)細(xì)胞和亞細(xì)胞成像，使其體內(nèi)藥物作用效果變得可視化。而且，還可利用組織特異性表達(dá)熒光報(bào)告基因來(lái)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，目前已有的如標(biāo)記血管[8-9]、神經(jīng)元[10]、血液[11-12]、免疫細(xì)胞[13-14]等。盡管如此，斑馬魚(yú)的成像能力僅限于較早年齡的胚胎，隨著年齡的增長(zhǎng)，其胚胎變大且不透明，影響體內(nèi)成像。目前已有光片成像技術(shù)，或稱選擇性平面照明顯微鏡技術(shù)（selective planar illumination microscope，SPIM）[15-16]，允許更深的組織穿透和更小的光毒性，但還無(wú)法穿透成年斑馬魚(yú)的組織。

1.4 局限性 斑馬魚(yú)的上述生物學(xué)特性使其與脊椎動(dòng)物發(fā)育而來(lái)的哺乳動(dòng)物小鼠模型相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但其依然存在著一些固有的局限性。首先，雖然斑馬魚(yú)與人類(lèi)基因組具有較高同源性，但其與人類(lèi)蛋白質(zhì)的差異不可避免地產(chǎn)生不同藥效[17]。其次，斑馬魚(yú)胚胎總體形態(tài)在1～5 dpf之間變化不大，但脈管系統(tǒng)和其它器官經(jīng)歷了廣泛擴(kuò)張和重塑[4，18]，此特點(diǎn)有助于發(fā)育研究，但在腫瘤研究中可能需要較穩(wěn)定的發(fā)育過(guò)程。攜帶移植瘤的斑馬魚(yú)飼養(yǎng)于34°C，低于人體生理體溫，移植瘤細(xì)胞的增殖速度不同于人類(lèi)體內(nèi)，而且移植瘤微環(huán)境與人類(lèi)腫瘤存在差異。再者，斑馬魚(yú)主要通過(guò)直接浸泡給藥，其藥物滲透率以及口服攝取率較難預(yù)測(cè)。盡管已有研究表明斑馬魚(yú)體內(nèi)的藥物分布、代謝和排泄與人類(lèi)相似，但是迄今為止幾乎沒(méi)有研究深入探索這些領(lǐng)域。此外，斑馬魚(yú)胚胎與幼魚(yú)體積小，實(shí)驗(yàn)操作較難，現(xiàn)有針對(duì)斑馬魚(yú)蛋白質(zhì)的抗體數(shù)量有限。這些優(yōu)缺點(diǎn)的總結(jié)見(jiàn)表1。

表1 斑馬魚(yú)和小鼠異種移植瘤模型的優(yōu)缺點(diǎn)Table 1.The advantages and limitations of zebrafish and mouse xenograft models

2 斑馬魚(yú)移植瘤模型的構(gòu)建和類(lèi)型

2.1 移植瘤構(gòu)建 對(duì)斑馬魚(yú)移植人類(lèi)腫瘤細(xì)胞時(shí)，每次可以顯微注入50～300個(gè)細(xì)胞，由于斑馬魚(yú)早期免疫功能缺失因而成瘤能力明顯，還可以利用斑馬魚(yú)的成像能力進(jìn)行體內(nèi)的深層次觀察。研究者們嘗試了斑馬魚(yú)的幾個(gè)注射部位用以模擬不同的癌癥階段。在斑馬魚(yú)受精卵發(fā)育至囊胚階段，卵黃是唯一可能的接種部位。Lee等[19]在斑馬魚(yú)發(fā)育的囊胚階段，約受精后3.5 h，將黑色素瘤細(xì)胞首次移植到囊胚期卵黃中，提供了腫瘤細(xì)胞在注射后長(zhǎng)達(dá)8 d的遷移行為證據(jù)。多數(shù)研究選擇2 dpf的胚胎作為異種細(xì)胞移植受體[20-21]，此時(shí)提供了更多注射部位的可能性。除了卵黃，另外兩個(gè)允許癌細(xì)胞直接釋放到血液循環(huán)中的接種部位是居維葉導(dǎo)管（位于卵黃囊的上部）和主靜脈（尾巴區(qū)域）[22-23]。根據(jù)移植部位的不同，可以追蹤不同的腫瘤發(fā)生發(fā)展表型，例如癌細(xì)胞的侵襲，外滲和轉(zhuǎn)移等[24]，或細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境的相互作用等[25]。

2.2 不同移植物 構(gòu)建斑馬魚(yú)移植瘤模型既可以應(yīng)用體外傳代的腫瘤細(xì)胞系，又可以使用患者來(lái)源的原代腫瘤細(xì)胞（patient-derived xenograft，PDX），而采用PDX構(gòu)建的移植瘤模型則能更好地模擬腫瘤細(xì)胞的真實(shí)行為。PDX通?？梢跃S持原始腫瘤的個(gè)體間遺傳異質(zhì)性，模仿患者中的疾病反應(yīng)，從而反映每個(gè)患者的獨(dú)特性[26]。

Marques等[27]首先研究并證實(shí)了斑馬魚(yú)可用于人類(lèi)PDX移植，為檢測(cè)原發(fā)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移行為提供了一種簡(jiǎn)單而快速的方法。他使用了多種癌細(xì)胞系以及來(lái)自胰腺癌，結(jié)腸癌和胃癌的原代人類(lèi)癌細(xì)胞。利用Tg（fli1a：：eGFP）斑馬魚(yú)評(píng)估了腫瘤細(xì)胞的侵襲和微轉(zhuǎn)移，并在體內(nèi)進(jìn)行了追蹤。Mercatali等[28]使用了來(lái)自乳腺癌患者骨轉(zhuǎn)移的PDX，并將PDX的行為與已建立的乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)患者原代細(xì)胞可從血管中滲出并侵入斑馬魚(yú)尾部造血組織（caudal hematopoietic tissue，CHT）。作者認(rèn)為斑馬魚(yú)可能是識(shí)別乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物以及預(yù)測(cè)治療反應(yīng)的良好臨床前模型。另一項(xiàng)研究調(diào)查了人類(lèi)白血病細(xì)胞的發(fā)病機(jī)理和藥物抑制作用，除細(xì)胞系外增加了從急性髓系白血病患者血液中分選出的CD34+白血病祖細(xì)胞，表明異種移植的癌細(xì)胞能夠在斑馬魚(yú)中存活，并被伊馬替尼和其他抗白血病藥物抑制[23]。

2.3 成年斑馬魚(yú)移植瘤模型 與胚胎不同，成年斑馬魚(yú)具有發(fā)育完全的免疫系統(tǒng)，因此需要防止移植排斥。輻照和藥物處理是用于免疫抑制的兩種最常用方法。低至20 Gy的單次放射劑量或25～250 mg/L的地塞米松足以形成免疫抑制[29-30]。最近，Yan等[31]建立了完全免疫缺陷的斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因品系（prkdc-/-，il2rga-/-），構(gòu)建了16種腫瘤細(xì)胞系及6種原代細(xì)胞的斑馬魚(yú)移植瘤模型，可飼養(yǎng)于37℃的類(lèi)似人體的生理環(huán)境中。他們的結(jié)果提示這種成年斑馬魚(yú)的異種移植模型可以作為與小鼠媲美的臨床前模型，在未來(lái)的腫瘤研究中具有相當(dāng)高的價(jià)值。表2總結(jié)了人類(lèi)腫瘤異種移植的斑馬魚(yú)模型。

表2 斑馬魚(yú)移植瘤模型類(lèi)型Table 2.Varity of zebrafish xenograft models

3 斑馬魚(yú)移植瘤模型在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用

3.1 新藥開(kāi)發(fā)的藥物藥效評(píng)價(jià) 2003年，美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院將斑馬魚(yú)列為僅次于大鼠和小鼠的第三重要實(shí)驗(yàn)生物（http：//www.fda.gov/forconsumers/consumerupdates/ucm343940.htm）。目前已有主要基于斑馬魚(yú)模型發(fā)現(xiàn)的新藥進(jìn)入臨床試驗(yàn)[39-40]。同時(shí)已有355例報(bào)道表明斑馬魚(yú)模型可作為藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中的基本工具[41]。斑馬魚(yú)移植瘤模型可用于發(fā)現(xiàn)和鑒定新型小分子的作用、以及優(yōu)化和改造化合物研究，確定藥效、毒性以及作用機(jī)理。表3概述了目前已報(bào)道的應(yīng)用斑馬魚(yú)移植瘤模型進(jìn)行藥物藥效評(píng)價(jià)的情況。

表3 斑馬魚(yú)移植瘤模型在新藥研發(fā)中的應(yīng)用Table 3.Applications of zebrafish xenograft models in drug development

目前大部分已報(bào)道的斑馬魚(yú)藥效研究通常使用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，通過(guò)表型實(shí)驗(yàn)或異種移植實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估化合物的抗腫瘤活性，可同時(shí)鑒定化合物對(duì)多種腫瘤類(lèi)型的抗腫瘤作用。抗腫瘤活性評(píng)價(jià)多采用共聚焦成像觀察腫瘤熒光強(qiáng)度、或?qū)唏R魚(yú)裂解后通過(guò)計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞得到。目前在藥物研發(fā)中，應(yīng)用斑馬魚(yú)模型研究的常見(jiàn)癌癥類(lèi)型有乳腺癌、白血病、肺癌和黑色素瘤等，表明斑馬魚(yú)移植瘤模型具有出色的通用性（表1）。由于血管生成和淋巴管形成是涉及腫瘤進(jìn)展和擴(kuò)散的關(guān)鍵過(guò)程，而斑馬魚(yú)胚胎透明性和帶有熒光脈管系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型使得血管和淋巴管形成可視化，因此斑馬魚(yú)移植瘤模型常用于靶向這些分子途徑的化合物的研究、發(fā)現(xiàn)抗血管和抗淋巴管形成的活性藥物等。此外，斑馬魚(yú)模型還涉及一些與胚胎發(fā)育有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路研究如TGFβ、Notch或Wnt通路等，以及細(xì)胞機(jī)制如凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控等的研究[51-52]。

3.2 新藥開(kāi)發(fā)的藥物毒性及安全性評(píng)價(jià) 美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）和歐洲藥品評(píng)估局（European Agency for the Evaluation of Medicinal Products，EMEA）也已接受斑馬魚(yú)毒性和安全性評(píng)估數(shù)據(jù)用于新藥的批準(zhǔn)。斑馬魚(yú)的胚胎毒性試驗(yàn)包括急性毒性試驗(yàn)和早期生命毒性試驗(yàn)。急性毒性試驗(yàn)的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，一個(gè)是導(dǎo)致胚胎死亡的半數(shù)致死濃度（50%lethal concentration，LC50）；另一個(gè)是觀察到的胚胎異常表型，如胚胎凝結(jié)、未形成體節(jié)、缺乏心跳以及尾巴未從卵黃中脫出等[53]。早期毒性測(cè)試在受精后不久開(kāi)始，并在自由進(jìn)食階段或生命的前30 d結(jié)束，評(píng)估指標(biāo)為孵化、存活以及形態(tài)、行為和大小的異常[54]。在應(yīng)用斑馬魚(yú)模型進(jìn)行發(fā)育毒性和致畸評(píng)估時(shí)，通常使用12個(gè)主要觀察點(diǎn)（心臟、大腦、下頜、眼睛、肝臟、腸、軀干/尾巴/脊柱、肌肉/體節(jié)、身體色素沉著、循環(huán)系統(tǒng)、身體浮腫和出血）和8個(gè)次要觀察點(diǎn)（鰭、耳、鰾、紅細(xì)胞形成、腎囊腫、胰腺、運(yùn)動(dòng)性和體長(zhǎng)）來(lái)進(jìn)行藥物的評(píng)估[55]。

3.3 在臨床治療研究中的應(yīng)用 2017年，F(xiàn)ior等[37]應(yīng)用斑馬魚(yú)移植瘤模型篩選了晚期結(jié)直腸癌國(guó)際診療指南中的幾種主要治療方案。他們首先分析了5個(gè)傳代結(jié)直腸癌細(xì)胞系的斑馬魚(yú)移植瘤模型對(duì)兩種最常見(jiàn)一線化療方案FOLFOX和FOLFIRI的反應(yīng)，觀察到對(duì)FOLFIRI的總體敏感性高于對(duì)FOLFOX的敏感性，與之前Sadanandam等[56]報(bào)道一致。同時(shí)，他們又用HCT116KRASG13D斑馬魚(yú)移植瘤測(cè)試了二線推薦療法西妥昔單抗的敏感性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)HCT116KRASG13D移植瘤有效，與目前的臨床報(bào)告結(jié)果一致。他們的結(jié)果還表明，用于難治性轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌的三線藥物雷戈非尼在斑馬魚(yú)移植瘤中誘導(dǎo)凋亡并伴有腫瘤縮小，具有明顯的藥效。最后他們還運(yùn)用病人來(lái)源的原代腫瘤細(xì)胞構(gòu)建PDX用于FOLFOX治療，并能在五分之四的患者中預(yù)測(cè)病人術(shù)后3～6個(gè)月內(nèi)有無(wú)復(fù)發(fā)。

多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]抑制劑奧拉帕尼與DNA損傷劑替莫唑胺聯(lián)用，可有效抑制人尤文氏肉瘤的生長(zhǎng)，并已進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)[57-58]。2019年，Yan等[31]在Cell報(bào)道了利用免疫缺陷的成年斑馬魚(yú)移植瘤模型，采取口服方式，發(fā)現(xiàn)奧拉帕尼與替莫唑胺聯(lián)用能顯著抑制橫紋肌肉瘤的增殖。上述研究提示，斑馬魚(yú)移植瘤模型可用于臨床抗腫瘤藥物敏感性研究。

4 展望

動(dòng)物移植瘤模型對(duì)腫瘤治療尤其是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)具有重要的意義和價(jià)值。迄今研究表明，斑馬魚(yú)移植瘤是一種有用的腫瘤研究模型，尤其適用于大規(guī)?？焖俸Y選，便于研究者們盡快得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是對(duì)現(xiàn)有其它動(dòng)物模型系統(tǒng)有價(jià)值的補(bǔ)充。在此基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步應(yīng)用更高等的動(dòng)物模型模仿人類(lèi)體內(nèi)環(huán)境，進(jìn)行較長(zhǎng)期毒性、藥效以及藥代藥動(dòng)分析。腫瘤是高度異質(zhì)性的疾病，而且可以不斷演化。斑馬魚(yú)移植瘤模型可快速繁殖、高通量篩選以及成本低的特點(diǎn)，使得應(yīng)用該模型構(gòu)建臨床腫瘤組織來(lái)源的移植瘤、跟蹤癌癥的異質(zhì)性和不斷變化成為可能，從而幫助理解體內(nèi)腫瘤生物學(xué)過(guò)程和機(jī)制，并指導(dǎo)臨床個(gè)性化治療。