方曉旭，杜春陽，宋 珊，史永紅，任韞卓，段惠軍

（河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室，河北石家莊050017）

慢性腎臟疾病（chronic kidney disease，CKD）的發(fā)生率持續(xù)升高，并且嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，腎臟持續(xù)的炎癥反應(yīng)與CKD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。壞死性凋亡（necroptosis）是細胞程序性死亡的一種新形式[2]，同時具有壞死和凋亡的特征，它是由受體相互作用蛋白（receptor-interacting protein，RIP）調(diào)控的非caspase依賴性的細胞死亡模式，其中，RIP1在壞死性凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到了關(guān)鍵作用。在疾病等機體異常狀態(tài)下，caspase-8生成顯著增多，啟動了機體的凋亡信號通路。Z-VAD-FMK是一種泛caspase抑制劑[3]，它可以完全抑制RIP1介導(dǎo)的procaspase-8蛋白水解活化，使機體凋亡信號通路被阻斷，進而使凋亡轉(zhuǎn)化為壞死性凋亡。不同的刺激與壞死性凋亡有關(guān)，最具特征的是腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），TNF-α聯(lián)合Z-VAD-FMK（T/Z）是誘導(dǎo)壞死性凋亡的經(jīng)典模型[4-5]。新近研究發(fā)現(xiàn)，壞死性凋亡參與了急性胰腺炎[6]、肝炎[7]及克羅恩病[8]的炎癥反應(yīng)，但在腎小管上皮細胞中，壞死性凋亡與炎癥關(guān)系如何，目前尚不清楚。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，壞死性凋亡抑制劑necrostatin-1（Nec-1）能夠減輕單側(cè)輸尿管梗阻小鼠的腎臟炎癥反應(yīng)[9]，提示壞死性凋亡在腎小管細胞的炎癥反應(yīng)中具有關(guān)鍵調(diào)控作用，但具體的調(diào)控機制還未明確。吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（ammonium pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC）是一種選擇性核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）抑制劑和抗氧化劑[10-11]，可以抑制許多細胞類型中NF-κB的活化，進而抑制NF-κB通路。本研究在前期實驗基礎(chǔ)上，采用T/Z刺激體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞，構(gòu)建壞死性凋亡的細胞模型；進一步用Nec-1和PDTC干預(yù)細胞，深入探討壞死性凋亡對T/Z刺激的腎小管上皮細胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控機制。

材料和方法

1 細胞

人腎小管上皮HK-2細胞購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心。低糖型DMEM培養(yǎng)基和DMEM/F12培養(yǎng)基1∶1配制，常規(guī)培養(yǎng)。分別給予HK-2細胞TNF-α（50 μg/L）、Z-VAD-FMK（50 μmol/L）、Nec-1（50 μmol/L）和PDTC（20 μmol/L）處理，于24 h后收集細胞觀察，重復(fù)細胞實驗5次。

2 主要藥品與試劑

TNF-α購自 PeproTech；Z-VAD-FMK和 Nec-1購自MCE；PDTC購自Abcam；RIP1過表達質(zhì)粒由Addgene公司惠贈；鼠源抗 RIP1、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκB激酶（IκB kinase，IKK）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和單核細胞趨化蛋白 1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）多克隆抗體購自Abcam；兔源多克隆抗caspase-3抗體購自Cell Signaling Technology；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細胞毒性檢測試劑盒購自Promega；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒和Opti-MEM培養(yǎng)基購自Thermo Fisher；IL-1β和MCP-1 ELISA試劑盒購自武漢六合生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega；Real-time PCR SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自TaKaRa。

3 主要方法

3.1 Western blot檢測蛋白水平 細胞用冰冷的PBS洗2遍，然后加入200 μL預(yù)冷的RIPA蛋白裂解緩沖液，冰浴30 min，用細胞刮均勻刮起細胞，收集到1.5 mL的EP管內(nèi)，4℃、12 000 r/min離心25 min，BCA法測定上清液蛋白濃度。按每孔30 μg細胞裂解蛋白上樣，SDS-PAGE分離，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上；5%脫脂奶粉37℃孵育1 h封閉PVDF膜，加入抗RIP1（1∶1 000）、caspase-3（1∶800）、IKK-α（1∶5 000）、NF-κB p65（1∶900）、p-NF-κB p65（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000）和MCP-1（1∶1 000）抗體，4℃過夜；室溫孵育1 h，洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠或山羊抗兔II抗（1∶5 000稀釋），37℃孵育1.5 h；洗膜后加入Pro-light HRP化學(xué)發(fā)光試劑，Odyssey Fc成像系統(tǒng)顯影，用UVP LabWorks 4.5分析軟件對Western blot條帶進行定量分析。

3.2 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細胞毒性檢測 HK-2細胞接種于96孔板，刺激24 h后，收集細胞培養(yǎng)基上清，250×g離心4 min，分別取50 μL上清液于新的96孔板中，在各孔中加入50 μL CytoTox 96室溫避光孵育30min后，再加入50 μL終止液，用酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測吸光度（A）值，LDH從細胞內(nèi)的釋放量用細胞壞死百分比表示。

3.3 細胞轉(zhuǎn)染 構(gòu)建RIP1過表達質(zhì)粒，待細胞密度60%～70%進行轉(zhuǎn)染，準(zhǔn)備A、B兩個2 mL的EP管，A管中加入125 μL Opti-MEM培養(yǎng)基和5 μL Lipofectamine 3000 Reagent，B 管 中 加 入 125 μL Opti-MEM培養(yǎng)基、5 μL P3000 Reagent及1 μg RIP1質(zhì)粒，A、B管混勻，于細胞超凈臺上放置5 min，將混合液加入細胞培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染6 h做后續(xù)處理。

3.4 ELISA測定 收集細胞培養(yǎng)基，1 000×g離心25 min，各取50 μL上清于ELISA板中，再在每孔中加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體，密封條件下，37℃孵育60 min。棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液重復(fù)洗5次，再向每孔中加入50 μL底物A、B，37℃避光孵育15 min。在每孔中加入50 μL終止液，在450 nm波長處測定每孔的A值。

3.5 real-time PCR TRIzol法提取細胞總RNA后按試劑盒步驟反轉(zhuǎn)錄為cDNA。實時定量PCR采用20 μL反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s；95℃5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)。使用3個復(fù)孔的Ct值取平均值，采用公式2-ΔΔCt計算mRNA表達的相對倍數(shù)變化。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 T/Z條件下RIP1介導(dǎo)HK-2細胞壞死性凋亡

Western blot結(jié)果顯示，T組HK-2細胞壞死性凋亡相關(guān)指標(biāo)RIP1和凋亡相關(guān)指標(biāo)cleaved caspase-3的蛋白水平均增加，T/Z組RIP1的蛋白水平進一步增加，而cleaved caspase-3的蛋白水平降低（P＜0.01），見圖1A。LDH細胞毒性實驗結(jié)果顯示，與control組相比，T組HK-2細胞壞死百分比顯著增加（P＜0.05），T/Z組細胞壞死百分比進一步增加（P＜0.01）；與T/Z組相比，再加入Nec-1干預(yù)后（T/Z+N組）細胞壞死百分比顯著下降到（P＜0.01），見圖1B。上述結(jié)果提示T/Z可以誘導(dǎo)HK-2細胞發(fā)生壞死性凋亡。

Western blot結(jié)果顯示，與control組相比，轉(zhuǎn)染RIP1過表達質(zhì)粒（RIP1+）組HK-2細胞中RIP1的蛋白表達水平明顯增高，見圖1C。轉(zhuǎn)染RIP1過表達質(zhì)粒后，T/Z條件下（T/Z+RIP1+組）的HK-2細胞壞死百分比進一步增加（P＜0.01），見圖1D。上述結(jié)果提示RIP1介導(dǎo)了T/Z條件下HK-2細胞的壞死性凋亡。

2 T/Z條件下RIP1介導(dǎo)的壞死性凋亡對HK-2細胞IL-1β和MCP-1蛋白水平的影響

Western blot及ELISA結(jié)果顯示，與control組相比，T/Z組HK-2細胞的IL-1β和MCP-1蛋白水平增高；與T/Z組相比，Nec-1干預(yù)下調(diào)IL-1β和MCP-1的蛋白水平；反之，轉(zhuǎn)染RIP1過表達質(zhì)粒明顯上調(diào)IL-1β和MCP-1的蛋白水平（P＜0.01），見圖2。

3 T/Z條件下RIP1介導(dǎo)的壞死性凋亡對HK-2細胞NF-κB通路的影響

Western blot結(jié)果顯示，與control組相比，T/Z組HK-2細胞中NF-κB通路相關(guān)蛋白IKK-α和NF-κB p65的水平增高，同時p-NF-κB p65蛋白水平也增高，再給予Nec-1干預(yù)則上述蛋白水平降低（P＜0.01）；與T/Z組相比，轉(zhuǎn)染RIP1過表達質(zhì)?？擅黠@上調(diào)HK-2細胞中上述蛋白的水平（P＜0.01），見圖3A。real-time PCR結(jié)果顯示，與control組相比，T/Z組HK-2細胞中NF-κB的mRNA表達水平增高，再給予Nec-1干預(yù)則NF-κB的mRNA表達水平下降（P＜0.01）；與T/Z組相比，轉(zhuǎn)染RIP1過表達質(zhì)?？擅黠@上調(diào)HK-2細胞中NF-κB的 mRNA表達水平（P＜0.01），見圖3B。這提示在T/Z條件下，RIP1介導(dǎo)的HK-2細胞壞死性凋亡激活了NF-κB通路。

4 T/Z條件下NF-κB通路參與RIP1介導(dǎo)的HK-2細胞炎癥

Western blot結(jié)果顯示，與control組相比，T/Z組HK-2細胞中 NF-κB 通路相關(guān)蛋白 IKK-α、NF-κB p65、p-NF-κB p65及下游分子IL-1β和MCP-1的水平增高，再給予PDTC干預(yù)后（T/Z+P組），上述蛋白水平降低（P＜0.01）；PDTC和Nec-1聯(lián)合干預(yù)HK-2細胞后（T/Z+P/N組），上述蛋白水平降低更明顯（P＜0.01），見圖4。這提示在T/Z條件下，NF-κB通路可能參與RIP1介導(dǎo)的HK-2細胞炎癥。

討 論

Figure 1.RIP1 mediated necroptosis of HK-2 cells under T/Z condition.A：Western blot was used to determine the protein levels of RIP1 and caspase-3；B：the release rate of LDH under T/Z and T/Z+N conditions；C：Western blot analysis of transfection of RIP1 over-expression plasmid in the HK-2 cells；D：the release rate of LDH in T/Z-treated cells with or without RIP1 over-expression.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs T group；&&P＜0.01 vs T/Z group.圖1 T/Z條件下RIP1介導(dǎo)HK-2細胞壞死性凋亡

Figure 2.The relationship between RIP1-mediated necroptosis of HK-2 cells and inflammation under T/Z condition.A：the levels of IL-1β and MCP-1 in the supernatant were measured by ELISA；B：Western blot results showed IL-1β and MCP-1 levels in cells.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs T/Z group.圖2 T/Z條件下RIP1介導(dǎo)的HK-2細胞壞死性凋亡和炎癥的關(guān)系

Figure 3.The relationship between RIP1-mediated necroptosis of HK-2 cells and NF-κB pathway under T/Z conditions.A：NF-κB pathway-related proteins were determined by Western blot；B：the mRNA expression of NF-κB was detected by real-time PCR.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs control group；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs T/Z group.圖3 T/Z條件下RIP1介導(dǎo)的HK-2細胞壞死性凋亡和NF-κB通路的關(guān)系

Figure 4.NF-κB pathway was involved in RIP1-mediated HK-2 cell inflammation under T/Z condition.The protein levels of NF-κB pathway-related molecules in the HK-2 cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs control group；&&P＜0.01 vs T/Z group；++P＜0.01 vs T/Z+P group.圖4 T/Z條件下NF-κB通路參與RIP1介導(dǎo)的HK-2細胞炎癥

壞死性凋亡是一種受調(diào)節(jié)的細胞死亡類型，其與壞死具有相似的形態(tài)學(xué)特征（早期包膜完整性破壞，細胞體積及胞內(nèi)細胞器腫脹）[2]，而壞死是一種被動的，不受管制的細胞死亡形式。在質(zhì)膜透化后，一般FasL/TNF通過激活Fas/TNFR1死亡結(jié)構(gòu)域，相繼形成RIP1的TNFR復(fù)合體Ⅰ和TNFR復(fù)合體Ⅱ，繼而活化caspase級聯(lián)反應(yīng)而啟動常規(guī)的細胞凋亡。但在此途徑中TNFR復(fù)合體Ⅱ中的RIP1會與RIP3緊密結(jié)合并相互磷酸化，活化的RIP3進一步導(dǎo)致其底物混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白磷酸化[12]，觸發(fā)細胞通透化和細胞破壞，繼而啟動壞死性凋亡。T/Z是經(jīng)典的壞死性凋亡模型[4-5]。Z-VAD-FMK是一個泛caspase抑制劑，TNF-α誘導(dǎo)的procaspase-8蛋白水解活化被Z-VAD-FMK完全抑制，使得RIP1的裂解減少，進而使細胞發(fā)生壞死性凋亡。LDH是一種極為穩(wěn)定的細胞質(zhì)酶，存在于正常細胞的胞質(zhì)中，正常時不能通過細胞膜，當(dāng)細胞受損或死亡時可釋放到細胞外，所以細胞死亡數(shù)目與細胞培養(yǎng)上清中的LDH活性成正比。本研究發(fā)現(xiàn)單獨給予HK-2細胞TNF-α刺激，可以同時發(fā)生壞死性凋亡和凋亡，TNF-α和Z-VAD-FMK聯(lián)合刺激HK-2細胞，凋亡途徑受到抑制，壞死性凋亡途徑被激活；進一步轉(zhuǎn)染RIP1過表達質(zhì)粒，T/Z+RIP1+組與T/Z組相比HK-2細胞壞死百分比顯著升高，提示T/Z條件下RIP1介導(dǎo)了HK-2細胞壞死性凋亡。

壞死性凋亡參與多種疾病炎癥的發(fā)生，如心力衰竭[13]、克羅恩病[8]、肝炎[7]、急性胰腺炎[6]、急性腎損傷[14]、順鉑治療小鼠的腎功能障礙[15]及糖尿病心肌病[16]等。本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α和Z-VAD-FMK聯(lián)合刺激HK-2細胞后IL-1β和MCP-1的表達水平均有明顯提高，提示在T/Z條件下，RIP1介導(dǎo)的HK-2細胞壞死性凋亡的發(fā)生與炎癥有關(guān)，但壞死性凋亡調(diào)節(jié)炎癥的機制報道尚少。

Nec-1是一種有效的RIP1抑制劑[17-18]，能夠抑制RIP1的活化，并隨后阻斷壞死體的形成，最終阻斷壞死性凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)給予T/Z組HK-2細胞Nec-1干預(yù)后細胞壞死百分比顯著減少，NF-κB的mRNA表達水平下降，NF-κB通路相關(guān)蛋白IKK-α、NF-κB p65和p-NF-κB p65的蛋白水平也明顯降低，提示在T/Z條件下，RIP1介導(dǎo)的HK-2細胞壞死性凋亡激活了NF-κB通路。

PDTC是NF-κB的特異性抑制劑[10-11]，可通過抑制NF-κB p65亞單位或IκB的降解來抑制NF-κB的激活。我們進一步給予T/Z組HK-2細胞PDTC干預(yù)，NF-κB 通路相關(guān)蛋白 IKK-α、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IL-1β和 MCP-1的蛋白水平降低，Nec-1和PDTC聯(lián)合干預(yù)HK-2細胞，對上述指標(biāo)的抑制程度更顯著。這提示在T/Z條件下，NF-κB通路可能參與RIP1介導(dǎo)的HK-2細胞炎癥。

綜上所述，RIP1介導(dǎo)的壞死性凋亡可以誘導(dǎo)腎小管上皮細胞發(fā)生炎癥反應(yīng)；NF-κB通路可能參與這一過程，抑制NF-κB通路可以減輕RIP1介導(dǎo)的壞死性凋亡引發(fā)的腎小管炎癥反應(yīng)。這些結(jié)果可為慢性腎臟疾病的治療提供新的思路。