王新婷,李甦雁,范 巍,李 婕,馮瑞芳,張正培,季蘇娟

0引言

增生型糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)是糖尿病重要的微血管并發(fā)癥之一，也是造成視力損傷的主要致盲眼病。玻璃體切割術(pars plana vitrectomy，PPV)是目前治療嚴重PDR的主要方法，但由于新生血管膜以及視網膜前增殖膜與視網膜的連接較為緊密，剝離困難，術中活動性出血和醫(yī)源性裂孔增加了手術難度，嚴重影響手術療效。近年來研究發(fā)現(xiàn)，抗VEGF藥物能夠降低眼內VEGF的表達，不僅能抑制新生血管形成，而且還可以促進已形成的新生血管消退，從而減輕新生血管滲漏、加快出血吸收[1-2]。雷珠單抗是一種人源化抗VEGF Fab 段單克隆抗體，具有相對分子質量小、易穿透視網膜和生物利用率高等特點，能夠非特異性的結合多個具有生物學活性的VEGF-A異構體，通過降低VEGF的表達，從而減低血管的通透性并抑制病理性新生血管產生，玻璃體腔注射抗VEGF藥物作為PDR玻璃體切割手術前的輔助治療，能有效降低手術中及手術后并發(fā)癥[1]。曲安奈德(TA)屬于非水溶性含氟長效糖皮質激素，局部用藥吸收較為緩慢，具有較強的抗炎作用，能夠減輕細胞的免疫反應，從而降低血管通透性、減少異常新生血管的增加，TA具有抑制炎癥因子和血管生成因子的雙重作用，玻璃體腔注射糖皮質激素也在PDR的治療中表現(xiàn)出了較好的抗炎、抑制細胞增生的效果，TA作為玻璃體手術中的染色劑已經廣泛應用于臨床，也有少數(shù)學者將其作為PDR玻璃體切割術前的輔助用藥取得較好的療效[3-4]。盡管雷珠單抗和TA都可作為PDR患者術前的輔助藥物，但二者作用機制并不完全相同，既往研究發(fā)現(xiàn)，PDR患者玻璃體腔中多種細胞因子，如單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、單核細胞趨化蛋白3(MCP-3)、白介素-6(IL-6)、胎盤生長因子(PIGF)、血小板源性生長因子-AB/BB(PDGF-AB/BB)及血管內皮生長因子-A(VEGF-A)等水平明顯增加，提示以上因子在參與和推動PDR發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5-8]，這些細胞因子是否對雷珠單抗和曲安奈德的治療具有不同影響值得進一步探究，因此我們進行了一項前瞻性臨床研究，對比分析了PDR患者玻璃體手術前用雷珠單抗和曲安奈德預處理后各類細胞因子的變化，并且對術中出血情況進行了比較?，F(xiàn)將結果報告如下。

1對象和方法

1.1對象本研究為前瞻性研究，經醫(yī)院倫理委員會批準(批號：20140004)，患者均獲知情并簽署知情同意書。將2015-05/2017-02在我院確診的88例112眼PDR患者納入研究。采用ETDRS視力表對患者進行最佳矯正視力(BCVA)檢查，行裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡、眼壓、B超等相關輔助檢查。所有患者臨床表現(xiàn)均符合PDR國際臨床診斷標準[9]。納入標準：(1)大于18周歲的2型糖尿病患者, 自愿參與且可定期隨訪者；(2)確診為PDR，符合手術適應證；(3)空腹血糖≤8mmol/mL，糖化血紅蛋白值≤8%；(4)除患糖尿病外全身情況良好，無手術禁忌證者。排除標準：(1)1型糖尿??；(2)內眼手術史、外傷史以及伴其它各類視網膜疾病如ARMD、CRVO等；(3)B超或OCT顯示視網膜脫離累及黃斑區(qū)者；(4)血糖控制不佳、腎功能不全、心功能不全、腦梗、凝血功能障礙者。

1.2方法

1.2.1治療方法按照隨機數(shù)表法分為雷珠單抗組和曲安奈德組，采用推薦安全注射劑量雷株單抗0.5mg/0.05mL，曲安奈德4mg/0.1mL[4]。玻璃體腔注藥術：常規(guī)內眼手術消毒鋪巾，表面麻醉后，自顳上角鞏膜緣后3.5mm用25G穿刺刀穿刺后放置trocar(套管針)，25G玻璃體切割頭抽取玻璃體液0.5mL，隨后向玻璃體腔注射雷珠單抗0.5mg/0.05mL或曲安奈德4mg/0.1mL，再向玻璃體腔內注入BSS(平衡液)維持眼內壓，拔出trocar后用棉簽按壓30～60s，觀察有無出血、切口滲漏，注藥后給予左氧氟沙星滴眼液預防感染。將抽取的玻璃體液放入無菌EP管進行離心(溫度4℃，轉速3000r/min，10min)，-80℃冰箱保存。

玻璃體手術：兩組患者均于玻璃體腔注藥后7d行25G PPV手術，手術開始打開內眼灌注前再次抽取玻璃體液0.5mL，離心后放-80℃冰箱保存。兩組患者手術均由同一位玻璃體手術經驗豐富的醫(yī)師完成。

1.2.2檢測方法(1)雙抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測：采用ELISA檢測玻璃體中PIGF的濃度。按照試劑盒說明書將標準品按照200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、0pg/mL的不同濃度配置好后加入孔中，樣品孔中加入待測樣本玻璃體。通過加入一抗、孵育、洗滌等步驟，再加入底物試劑A、B后37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育15min加入終止液進行終止。孵育10min之內采用ELX808酶標儀測定各孔450nm吸光度值，繪制標準曲線，計算樣品PIGF濃度；(2)液相芯片分析檢測：96孔板中每孔分別加入標準品緩沖液、質控品以及患者玻璃體液后加入混勻稀釋好的微球，經過室溫震蕩孵育、離心、洗滌微球，所有操作嚴格按照試劑說明書進行，最終采用Luminex200多功能流式點陣儀測定樣品孔熒光強度中位值，使用5-parameters logistic方式計算標準品曲線，通過MILLIPLEX Analyst.V5.1軟件計算樣品中MCP-1、MCP-3、PDGF-AB/BB、IL-6、IL-8和VEGF-A的濃度。陰性質控品、陽性質控品的檢測結果均在QC Range范圍之內。(3)觀察兩組患者術中出血情況。

表1 兩組患者一般臨床資料比較

分組眼數(shù)年齡( x±s,歲)性別(男,%)糖尿病病程( x±s,a)糖化血紅蛋白( x±s,%)ETDRS字母數(shù)( x±s,個)眼壓( x±s,mmHg)PDR分期(眼)ⅣⅤⅥ雷珠單抗治療組5753.78±9.6721(36.8)11.52±5.367.06 ± 0.7321.23±2.4614.90±3.0023223曲安奈德治療組5555.89±8.1226(47.3)12.98±7.387.14 ± 0.6425.42±4.3114.60±2.6823716 t/χ2/U-0.981.25-1.32-0.56-0.43-0.55-1.17P0.330.260.240.570.610.590.24

時間PIGFMCP-1MCP-3IL-6IL-8PDGF-AB/BBVEGF-A注藥前65.36±15.162652.36±112.838.03±3.1037.32±4.04111.723±21.328.33±6.85315.16±14.34注藥1wk后19.42±6.342831.21±101.237.73±4.2652.42±5.32198.73±19.037.65±7.8321.32±2.54t5.3240.5640.672-2.342-5.3210.6213.451P0.0010.3240.5010.003<0.0010.5730.001

時間PIGFMCP-1MCP-3IL-6IL-8PDGF-AB/BBVEGF-A注藥前74.28±17.342789.32±143.546.89±2.8841.34±10.37104.34±14.249.45±2.45362.65±89.35注藥1wk后136.12±15.342038.21±105.346.32±1.3961.32±13.64108.32±20.319.72±4.21351.35±82.34 t-2.8154.2360.872-1.782-3.211-0.063-2.342P0.0070.0010.7820.0630.8210.8710.980

根據(jù)術中出血程度分為：(1)無或輕度出血：術中無出血或者點狀出血且能夠在短時間內自凝不影響手術操作，無需處理者；(2)中度出血：術中片狀出血，能自凝，但影響手術操作需要用玻璃體切割頭或笛針吸除；(3)重度出血：出血量較大，不能自行停止，影響手術視野，需要電凝止血。

2結果

2.1兩組患者基線資料比較本研究中共88例112眼，其中男47例59眼，女41例53眼；年齡31～73歲。雷珠單抗治療組43例57眼，曲安奈德治療組45例55眼。兩組患者年齡、性別、糖尿病病程、糖化血紅蛋白、視力、眼壓及PDR分期差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)，具有可比性。

2.2兩組患者玻璃體腔注藥前后玻璃體中細胞因子含量的比較兩組患者玻璃體腔注射藥物前后，玻璃體細胞因子PIGF、MCP-1、MCP-3、IL-6、IL-8、PDGF-AB/BB、VEGF-A濃度見表2、3。與注藥前比較，雷株單抗組注藥1wk后PIGF、VEGF-A表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.324、3.451，P=0.001)，而IL-6和IL-8表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=-2.342、-5.321，P=0.003、P<0.001)；MCP-1、MCP-3和PDGF-AB/BB的表達在雷珠單抗玻璃體腔注射前后的玻璃體中無顯著改變，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.564、0.672、0.621，P=0.324、0.501、0.573)。

曲安奈德組，與注藥前比較，注藥1wk后MCP-1的表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.236，P=0.001)，同時PIGF的表達增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=-2.815，P=0.007)。而MCP-3、IL-6、IL-8和PDGF-AB/BB、VEGF-A細胞因子的表達在接受曲安奈德玻璃體腔注射前后無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.872、-1.782、-3.211、-0.063、-2.342，P=0.782、0.063、0.821、0.871、0.980)。

雷珠單抗組和曲安奈德組注藥1wk后，雷珠單抗組PIGF、VEGF-A的表達較曲安奈德組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=-5.731、-4.443，P<0.001)，IL-8和MCP-1的表達較曲安奈德組增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.382、3.320，P=0.009、0.008)。IL-6、MCP-3和PDGF-AB/BB在兩組間無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.872、1.762、-1.621，P=0.671、0.382、0.521)，見圖1。

圖1雷珠單抗組和曲安奈德組玻璃體腔內細胞因子濃度變化A:PIGF; B:VEGF-A; C:IL-8; D:MCP-1。

圖2兩組患者手術中照片A:雷珠單抗組；B:曲安奈德組。

表4 兩組患者術中出血比較眼(%)

2.3兩組患者術中出血比較與曲安奈德組相比，雷株單抗組術中出血情況明顯低于曲安奈德組，差異有統(tǒng)計學意義(U=2.50，P=0.012)，見表4，圖2。

3討論

DR是一種病理過程較為復雜的病變，炎性細胞因子的釋放和VEGF的過度分泌在該過程中發(fā)揮重要作用[10-11]，且目前有研究觀察到玻璃體切割術前應用糖皮質激素或抗VEGF藥物均可有效增加手術安全性，減少術后并發(fā)癥的發(fā)生，術前玻璃體腔輔助藥物的應用已逐漸成為主要治療手段[12-13]。

研究中我們發(fā)現(xiàn)玻璃體腔注射雷珠單抗后，VEGF-A、PIGF的水平顯著降低；玻璃體腔注射曲安奈德后，VEGF-A的水平較注射前并無明顯改變，MCP-1的水平呈降低改變，由此進一步證實，雷珠單抗和曲安奈德分別在降低玻璃體腔內細胞生長因子和炎癥因子表達方面具有不同效應。此外，結合兩組玻璃體手術中觀察到的雷珠單抗組術中出血情況顯著低于曲安奈德組，證實在玻璃體切割術前使用雷珠單抗比曲安奈德更能減輕術中出血，有利于術者在手術過程中獲得清晰的手術視野。這與雷珠單抗本身是一段能夠辨識出人VEGF全部分異構體的單克隆抗體片段有關，同時由于雷珠單抗其分子量小，因此能夠更容易更快地穿透視網膜各層發(fā)揮抑制新生血管的作用[13]。Cui等[14]的研究也發(fā)現(xiàn)玻璃體手術前3～7d注射雷珠單抗可明顯降低術中出血的發(fā)生提高手術安全性和成功率，降低術后并發(fā)癥的發(fā)生，但與本研究不同的是該發(fā)現(xiàn)是與術中行TA注射的患者進行對比。術前應用雷珠單抗和曲安奈德對玻璃體手術中效果的差異性仍需進一步進行探討。

本研究中，我們比較了雷珠單抗和曲安奈德注藥前后的玻璃體血管生長因子和炎癥因子含量差異以及兩組間注藥后的各細胞因子的差異。雷珠單抗組玻璃體腔內VEGF-A、PIGF含量較注射前顯著降低；而曲安奈德組VEGF-A含量較注射前并無明顯改變，PIGF含量較之前有升高趨勢。PIGF是VEGF家族的重要成員，能通過VEGFR-1直接作用內皮細胞也可與VEGFR-1結合后抑制VEGF-A與VEGFR-1結合，從而使VEGF-A與VEGFR-2結合發(fā)揮其生物學作用。Yu等[15]研究發(fā)現(xiàn)在PDR患者玻璃體腔中VEGF和PIGF的含量均高于正常人。Forooghian等[16]從行玻璃體切割手術的DR患者中發(fā)現(xiàn)，術前注射雷珠單抗后其房水中PIGF的含量明顯降低，與我們的研究較為一致。VEGF-A、VEGF-B和PIGF可隨DR病程的增加而表現(xiàn)出上升趨勢[17]，有研究報道發(fā)現(xiàn)曲安奈德可抑制花生四烯酸的產生從而產生抗炎的作用導致血管生長因子的表達減弱[18]，由于作用環(huán)節(jié)較雷珠單抗更復雜，使得作用時間更緩慢可能是導致PIGF持續(xù)增高的重要原因，在本研究中觀察到玻璃體腔注射曲安奈德對PIGF有升高趨勢而對VEGF-A無明顯影響，由此我們推斷PIGF的升高及VEGF-A的持續(xù)異常分泌可能是影響曲安奈德有效阻斷DR持續(xù)發(fā)展的可能原因之一。

另外，有研究報道，DR患者房水和玻璃體液中MCP-1、IL-6、IL-8等炎癥因子濃度顯著增加，且與DR患者黃斑水腫的發(fā)生密切相關[19-24]。MCP-1在部分炎癥、免疫疾病中發(fā)揮重要作用，是一種重要的炎癥因子，可參與多種視網膜疾病病理過程。當視網膜發(fā)生炎癥反應時，MCP-1表達明顯上升，升高的MCP-1可以募集單核-巨噬細胞向炎癥部位遷移，促進小膠質細胞活化，在損傷部位吞噬細胞碎片等[25]。Kunikata等[26]在孔源性視網膜脫離的研究中發(fā)現(xiàn)，玻璃體注射曲安奈德后，增加的MCP-1被明顯抑制。在對糖尿病黃斑水腫患者治療的研究中有報道指出，曲安奈德可能通過降低MCP-1等因子的分泌減少視網膜血管的滲漏[27]。本研究中也觀察到PDR玻璃體腔注射曲安奈德后MCP-1的濃度明顯降低，說明MCP-1是曲安奈德在抗炎反應中參與的重要炎癥因子。同時，研究中我們還發(fā)現(xiàn)，雷珠單抗組IL-6和IL-8較注藥前出現(xiàn)明顯增加。IL-6屬于多功能的細胞因子，是感染和外傷急性期反應中發(fā)揮重要作用的主要誘導因子，可引起炎性細胞分泌、刺激內皮細胞增殖、增加內皮細胞通透性等多種病理改變。Naldini等[28]研究發(fā)現(xiàn)IL-6等細胞因子與VEGF有類似特征，均可被低氧所誘導新生血管形成。此外，慢性高血糖刺激可明顯促進胰島細胞分泌IL-6[29]，即使阻斷VEGF的分泌，IL-6的表達仍顯著增加可能是本研究中使用雷珠單抗后IL-6上調的可能原因之一。IL-8是嗜中性粒細胞的主要趨化因子，可參與促進血管的生成過程。有研究者在使用雷珠單抗玻璃體腔注射后，觀察到DR患者房水中IL-8的表達升高，并認為VEGF-A抑制后，IL-8之所以出現(xiàn)升高現(xiàn)象可能不是依賴于HIF-1α途徑而是通過調控NF-κB的表達引起的[16]。而有研究指出注射時穿刺或藥物作用過程中的急性反應或視網膜缺血缺氧所致的調節(jié)結果是導致玻璃體腔注射雷珠單抗后IL-6和IL-8升高的可能原因[30]。由此可見，玻璃體腔注射雷珠單抗后IL-6和IL-8的升高可能是多種因素作用的共同結果。

此外，在本研究中，無論是組內注藥前后對比，還是組間進行比較，均未發(fā)現(xiàn)PDGF-AB/BB以及MCP-3的改變。PDGF-AB/BB與VEGF具有顯著的同源性，可促進細胞生長并參與細胞運動。有研究發(fā)現(xiàn)，PDGF是視網膜色素上皮細胞生長的自分泌刺激物，參與視網膜創(chuàng)傷修復和視網膜前膜形成[31]。PDGF-AB/BB表達的增高可導致神經膠質細胞的非血管相關增殖，參與調節(jié)PDR中血管和非血管細胞的增殖形成[32]。MCP-3是一種多功能趨化因子，具有促炎癥作用，與MCP-1共享MCP-1受體，但親和力相對較低。有研究表明MCP-1和MCP-3共同參與了受傷部位單核細胞的激活和補充，因此本研究除MCP-1外同時也對MCP-3進行了檢測。目前針對MCP-3在眼部的疾病研究中相對較少，近期Wang等[33]發(fā)現(xiàn)原發(fā)性閉角型青光眼患者的房水中MCP-3輕度增加，可能參與了病程的進展。研究中，我們觀察到PDGF-AB/BB和MCP-3注藥前明顯低于其他因子分泌，可能是其藥物作用不明顯的原因之一。此外，PDR患者中未被抑制的PDGF-AB/BB和MCP-3持續(xù)分泌可長期對視網膜造成破壞，可能是雷珠單抗和曲安奈德治療效果不佳的原因。

玻璃體切割手術前聯(lián)合應用雷珠單抗及曲安奈德玻璃體腔給藥可從不同方面減少DR術中出血發(fā)生率，提高手術效率，本研究對玻璃體腔注射雷珠單抗及曲安奈德在DR中的調控因素及臨床效果進行了初步探索及比較分析，但由于DR發(fā)病機制的復雜及藥物作用的調控作用，其具體機制仍有待進一步探究。

本研究為前瞻性隨機對照非盲研究，雖然不能完全排除干擾因素，但隨機分組能減少一些選擇偏倚，此外為盡量減少選擇偏倚，所有患者均嚴格按納入標準選擇，所得結果真實可靠。