陳學(xué)敏，王小云，陸溫，鄭霞林

（廣西農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院 南寧市 530004）

蟲生真菌是一類寄生真菌，通過侵染進(jìn)入昆蟲體內(nèi)，并吸收昆蟲營養(yǎng)最終導(dǎo)致寄主死亡。其與化學(xué)殺蟲劑的作用方式不同，對環(huán)境和人體安全，常用于害蟲的生物防治[1]。目前，我國已報(bào)道的蟲生真菌種類超過400 種，其中綠僵菌Metarhiziumspp.和白僵菌Beauveriaspp.商業(yè)化推廣和應(yīng)用最為廣泛，并在農(nóng)林害蟲的管理方面發(fā)揮了重要作用[2]。例如，20 世紀(jì)80 年代我國廣東省就已應(yīng)用白僵菌控制馬尾松毛蟲Dendrolimus punctatus（Walker），防效達(dá)到80%，經(jīng)過多年治理其為害面積從6.667×105ha 降至2×104ha，是我國通過蟲生真菌控制林業(yè)害蟲最成功的案例之一[3]。然而，不同蟲生真菌對同一寄主的毒力存在差異，蔡守平等[4]利用4 株球孢白僵菌BbAX-02、BbAX-04、BbFZ-11 和BbHA-01，對馬尾松毛蟲4、5 齡幼蟲進(jìn)行毒力測定時(shí)，BbAX-02 和BbAX-04 的校正死亡率分別達(dá)到了100%和92.5%，而BbFZ-11 和BbHA-01則僅為27.5%和30%；同一蟲生真菌對不同寄主的毒力也存在一定差異，測定了9株白僵菌對小菜蛾P(guān)lutella xylostella（Linnaeus）2 齡幼蟲和煙粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）2 齡若蟲的毒力，結(jié)果顯示有6株在2種寄主之間表現(xiàn)出顯著差異[5]。因此篩選高毒力蟲生真菌有利于提高靶標(biāo)害蟲的防治效果。

朱紅毛斑蛾P(guān)hauda flammans（Walker）（鱗翅目Lepidoptera 毛斑蛾科Phaudidae 毛斑蛾屬Phauda）是榕屬Ficusspp.植物上的重要食葉害蟲，偏好小葉榕F.microcarpa（Miq.）和垂葉榕F.benjamina（L.）[6]。在我國，朱紅毛斑蛾主要發(fā)生在廣東、廣西、云南、海南及福建等南方省份[7-8]。成蟲主要產(chǎn)卵在樹梢頂端當(dāng)年生嫩葉或葉柄上[9]，幼蟲從樹冠頂層葉片開始取食，使榕樹出現(xiàn)“禿頂”現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)整株葉片被食光僅剩樹枝，不僅影響榕樹的生長發(fā)育，還影響景觀效果和生態(tài)效應(yīng)[10]。目前，針對該蟲的管理仍以化學(xué)防治為主[11]，但朱紅毛斑蛾的為害多發(fā)生在市區(qū)道路和公園等人群密集區(qū)，施用化學(xué)殺蟲劑不僅污染環(huán)境，還威脅周邊群眾的身體健康，因此急需找到安全有效的防治手段。研究蟲生真菌對朱紅毛斑蛾幼蟲的致病力，可為探索朱紅毛斑蛾的綠色防治提供參考資料。

本研究通過比較1株分離自朱紅毛斑蛾幼蟲僵蟲的球孢白僵菌PfBb 與3 種常用蟲生真菌（金龜子綠僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400、球孢白僵菌DSXJ-07）對朱紅毛斑蛾幼蟲的毒力，以期明確球孢白僵菌PfBb 的致病力，為利用蟲生真菌防治朱紅毛斑蛾奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

球孢白僵菌PfBb（課題組自備）、金龜子綠僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400和球孢白僵菌DSXJ-07（江蘇鹽城神微微生物菌種科技有限公司，鹽城，中國）。

1.1.2 供試?yán)ハx

采集廣西大學(xué)校園內(nèi)（22°83’N，108°29’E）為害垂葉榕的朱紅毛斑蛾幼蟲，帶回室內(nèi)后根據(jù)其頭殼寬度選擇4齡健康幼蟲作為試蟲[10]。將試蟲放入用75%酒精消毒后的塑料盒（半徑為4 cm，高度為15 cm）內(nèi)，10頭/盒，在溫度25±1℃、光照L16：D8 和pH 值75% ± 5%的條件下飼養(yǎng)。每天更換1次新鮮垂葉榕葉片作為食料。

1.2 試驗(yàn)方法

將金龜子綠僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400、球孢白僵菌DSXJ-07 和球孢白僵菌PfBb 用0.05%吐溫-80 溶液配分別制成1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106和1.0×105孢子/mL 共5 個(gè)濃度處理，以0.05%吐溫-80 溶液為對照。采用浸蟲法，將試蟲浸入不同濃度的孢子液5 s后取出，用吸水紙吸去體表多余液體后置于塑料盒中飼養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)4 次，每個(gè)重復(fù)處理20 頭幼蟲。連續(xù)觀察10 d，每天8：00、16：00 和23：00 定時(shí)檢查朱紅毛斑蛾幼蟲死亡情況。發(fā)現(xiàn)幼蟲死亡則將其移出培養(yǎng)皿，并置于另一個(gè)經(jīng)過75%酒精消毒的培養(yǎng)皿內(nèi)保濕培養(yǎng)，觀察其蟲體是否長出菌絲，記錄僵蟲數(shù)，計(jì)算校正死亡率和僵蟲率。計(jì)算公式如下。

校正死亡率（%）= ［（處理組死亡率-對照組死亡率）/（1-對照組死亡率）］×100

僵蟲率（%）=（某處理感染球孢白僵菌的僵蟲數(shù)/某處理總蟲數(shù)）×100

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 19.0 軟件（IBM Corp., Armonk,New York, USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，通過Probit回歸（概率單位回歸）分析計(jì)算毒力回歸方程、LC50及95%置信區(qū)間；僵蟲率采用Tukey’s-HSD進(jìn)行單因素方差分析（P＜0.05）。采用GraphPad Prism 5 對生存曲線進(jìn)行對數(shù)秩檢驗(yàn)（Log-rank Test）及制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種蟲生真菌對朱紅毛斑蛾幼蟲的毒力

金龜子綠僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400、球孢白僵菌DSXJ-07 和球孢白僵菌PfBb 的不同孢子濃度處理朱紅毛斑蛾幼蟲后1～3 d的校正死亡率均較低，處理4～7 d 校正死亡率呈上升趨勢，處理8 d后校正死亡率基本維持在一定水平。

4種蟲生真菌不同濃度處理后，朱紅毛斑蛾幼蟲的校正死亡率存在差異（圖1）。不同濃度處理中，用球孢白僵菌PfBb 處理10 d 的校正死亡率均為最高，處理濃度為1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108和1.0×109孢子/mL 的校正死亡率分別為37.33%、62.67%、97.33%、100%和100%，通過對數(shù)秩檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌PfBb 處理的朱紅毛斑蛾幼蟲校正死亡率顯著高于相同濃度處理的其他3 種蟲生 真菌（105：x2= 22.12，df= 3，P＜0.05；106：x2=23.61，df=3，P＜0.05；107：x2=55.92，df= 3，P＜0.05；108：x2= 36.30，df= 3，P＜0.05；109：x2= 42.19，df= 3，P＜0.05）。然而，當(dāng)濃度為1.0×105、1.0×106和1.0×107孢子/mL時(shí)，金龜子綠僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400 和球孢白僵菌DSXJ-07 三者間差異不顯著（105：x2=0.02，df= 2，P= 0.9885；106：x2= 4.4，df= 2，P=0.1105；107：x2=0.97，df=2，P=0.6171）。

圖1 4種蟲生真菌對朱紅毛斑蛾幼蟲存活率的影響

處理時(shí)間相同時(shí)，4種蟲生真菌的LC50有所不同（表1）。處理時(shí)間為8 d 時(shí)，金龜子綠僵菌Mafz01 的LC50最高為3.1×108孢子/mL，球孢白僵菌PfBb的LC50最低為2.8×105孢子/mL。4種蟲生真菌對朱紅毛斑蛾幼蟲的毒力由大至小為球孢白僵菌PfBb＞球孢白僵菌DSXJ-07＞卵孢白僵菌400＞金龜子綠僵菌Mafz01。

表1 4種蟲生真菌對朱紅毛斑蛾幼蟲的毒力

2.2 不同蟲生真菌處理后朱紅毛斑蛾幼蟲僵蟲率

孢子濃度相同時(shí)，不同蟲生真菌處理后的朱紅毛斑蛾幼蟲僵蟲率差異顯著（105：F=72.440，df= 3，12，P＜0.05；106：F= 52.534，df= 3，12，P＜0.05；107：F= 125.806，df= 3，12，P＜0.05；108：F= 120.174，df= 3，12，P＜0.05；109：F= 56.048，df= 3，12，P＜0.05）（表2）。同種蟲生真菌不同孢子濃度處理后的朱紅毛斑蛾幼蟲僵蟲率差異顯著（金龜子綠僵菌Mafz01：F=37.286，df= 4，15，P＜0.05；卵孢白僵菌400：F= 62.406，df= 4，15，P＜0.05；球孢白僵菌DSXJ-07：F= 111.239，df= 4，15，P＜0.05；球孢 白 僵 菌PfBb：F=124.339，df= 4，15，P＜0.05）（表2）。球孢白僵菌PfBb在各濃度下侵染造成的朱紅毛斑蛾幼蟲僵蟲率顯著高于金龜子綠僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400 和球孢白僵菌DSXJ-07。在1.0×105、1.0×106和1.0×107孢子/mL 濃度下，金龜子綠僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400 和球孢白僵菌DSXJ-07三者的僵蟲率差異不顯著。

表2 不同蟲生真菌處理后的朱紅毛斑蛾幼蟲僵蟲率

3 結(jié)論與討論

不同種類的蟲生真菌對同一寄主的致病力往往存在著差異，并且分離自第一寄主的蟲生真菌對該寄主的致病力一般高于分離自其他寄主的蟲生真菌，即蟲生真菌存在一定的寄主選擇性[12]。本研究對1株分離自朱紅毛斑蛾幼蟲僵蟲的球孢白僵菌PfBb，同市面上出售的3 種蟲生真菌（金龜子綠僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400 和球孢白僵菌DSXJ-07）進(jìn)行了致病力的比較研究，結(jié)果顯示不同蟲生真菌對朱紅毛斑蛾幼蟲的致病力存在差異，其中球孢白僵菌PfBb 對幼蟲的致病力最高。周建云等[13]比較了多種球孢白僵菌菌株對煙青蟲Heliothis assulta（Guenée）的毒力，發(fā)現(xiàn)自煙青蟲上分離得到的球孢白僵菌Bb062 的累積校正死亡率最高，達(dá)到91.07%±4.61%，致病力顯著高于分離自棉葉蟬Empoasca biguttula（Ishida）的球孢白僵菌Bb908等其他菌株。由于僵蟲率越高，蟲生真菌二次傳播的可能性越高，因此僵蟲率也是評價(jià)蟲生真菌致病力的一個(gè)重要指標(biāo)[14]。趙俊芳等[15]比較了4 株球孢白僵菌對柳膜肩網(wǎng)蝽Hegesidemus habrus（Drake）的致病力，結(jié)果顯示球孢白僵菌BF 處理后柳膜肩網(wǎng)蝽的死亡率為91.11%±10.18%，僵蟲率為84.44%±15.40%，而球孢白僵菌TST 處理后柳膜肩網(wǎng)蝽的死亡率為70.00%±14.53%，僵蟲率為44.44%±13.47%，表明蟲生真菌只有成功侵染并導(dǎo)致寄主死亡才能在蟲體上繁殖產(chǎn)生分生孢子，因此死亡率越高，僵蟲率也較高。

蟲生真菌對昆蟲具有寄主選擇性的原因目前尚不明確，但對蟲生真菌侵入蟲體過程的相關(guān)研究表明許多因素可能影響其寄主選擇性，包括孢子吸附、孢子萌發(fā)、侵入及其進(jìn)一步的生長等[16]。本研究結(jié)果表明，球孢白僵菌PfBb 對朱紅毛斑蛾幼蟲的致病力顯著高于金龜子綠僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400和球孢白僵菌DSXJ-07，表現(xiàn)出一定的寄主選擇性。通常情況下，致病力較低的蟲生真菌其分生孢子在寄主體表附著率低。例如，Altre 等[17]比較了8 株玫煙色棒束孢Isaria fumosorosea（Wize）對小菜蛾的致病力差異，發(fā)現(xiàn)致病力較低的菌株ARSEF1576 的孢子附著率低，推測球孢白僵菌PfBb 在朱紅毛斑蛾幼蟲體表具有較高的孢子萌發(fā)率。蟲生真菌的芽管穿透寄主體壁是侵染的重要環(huán)節(jié)，球孢白僵菌PfBb 對朱紅毛斑蛾幼蟲具有較高的致病力可能是其芽管比金龜子綠僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400和球孢白僵菌DSXJ-07有更強(qiáng)的穿透能力。例如，周哲宇等[5]比較了兩株球孢白僵菌Bb104和Bb120的致病力，結(jié)果表明2株球孢白僵菌Bb104和Bb120對煙粉虱和小菜蛾的致病力均存在顯著差異，并觀察到兩株球孢白僵菌的芽管在昆蟲體表的伸長速度存在差異，認(rèn)為芽管能否突破寄主體壁影響了蟲生真菌對不同寄主的致病力。此外，分生孢子在侵入過程中會(huì)產(chǎn)生酶類物質(zhì)幫助芽管侵入寄主體壁，如孢外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶等，研究表明孢外酶活力與蟲生真菌的毒力呈正相關(guān)關(guān)系[18]，但也有報(bào)道顯示孢外酶活力與蟲生真菌致病力無關(guān)。例如，曹偉平等[19]探究了4 株球孢白僵菌菌株胞外酶活力和毒力的關(guān)系，結(jié)果顯示酶活性最高的菌株HFW-05對小菜蛾的毒力高，而對棉鈴蟲的毒力低。但胞外酶活力與金龜子綠僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400、球孢白僵菌DSXJ-07 和球孢白僵菌PfBb 致病力間的關(guān)系尚不明確。因此，不同蟲生真菌對朱紅毛斑蛾幼蟲致病力差異的原因，還需要進(jìn)一步開展不同蟲生真菌在寄主體表萌發(fā)率、芽管發(fā)育情況以及胞外酶活力等方面的研究。

針對朱紅毛斑蛾幼蟲的防治，推薦使用濃度大于1.0×107孢子/mL 的球孢白僵菌PfBb，能取得較好的防治效果。但在自然條件下的防治效果尚需進(jìn)一步研究。