劉 鑫，余 盈，何 蔚

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.2017級(jí)碩士研究生；2.2014級(jí)碩士研究生；3.藥理學(xué)教研室；4.江西省腦血管藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；5.心腦血管疾病防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 贛州 341000)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是老年人群癡呆的最常見類型，其主要臨床表現(xiàn)是進(jìn)行性記憶和認(rèn)知障礙、判斷力和日常生活自理能力下降，嚴(yán)重的患者甚至產(chǎn)生行為失常精神神經(jīng)癥狀。AD的主要神經(jīng)病理性特征有β淀粉樣蛋白(beta-amyloid，Aβ)沉積老年斑形成、神經(jīng)元內(nèi)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元丟失和突觸丟失等[1-2]。AD的發(fā)病與年齡相關(guān)，隨著老齡化進(jìn)程的加劇，AD的發(fā)病率逐年升高，已成為嚴(yán)重危害老年人健康的主要疾病之一。

歐前胡素(imperatorin)是傘形科中藥蛇床子、白芷、羌活的有效成分之一，是一種呋喃香豆素[3-5]。歐前胡素具有抗炎、抗氧化、抗焦慮、抗驚厥、舒張血管平滑肌、抗血栓形成和阻滯鈣通道等作用[5-8]。研究證實(shí)，歐前胡素對(duì)東莨菪堿和脂多糖誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙有明顯的改善作用[8-9]。本課題組前期研究顯示，歐前胡素有神經(jīng)保護(hù)作用，歐前胡素有抗腦缺血損傷的作用，另外，歐前胡素還有抗癡呆作用，在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，歐前胡素對(duì)Aβ1-42致AD癡呆模型小鼠的被動(dòng)回避性學(xué)習(xí)記憶障礙有明顯的改善作用，歐前胡素可減輕Aβ1-42致小鼠AD后腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制活性氧自由基的產(chǎn)生和抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力[10-11]。由于Aβ沉積及其觸發(fā)的炎癥反應(yīng)在AD的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用，本課題利用Aβ1-42誘導(dǎo)小鼠AD模型，采用八臂迷宮評(píng)估歐前胡素對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙的影響，檢測(cè)歐前胡素對(duì)大腦皮層和海馬中炎癥因子TNF-α和IL-1β產(chǎn)生及p-p38和p-ERK蛋白表達(dá)的影響，觀察歐前胡素對(duì)AD模型小鼠空間辨別學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用以及對(duì)大腦皮層和海馬組織中炎癥反應(yīng)的抑制作用，進(jìn)一步揭示歐前胡素防治AD的作用機(jī)制，為把歐前胡素開發(fā)用于防治AD提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)BALB/c小鼠，♂，體重20～25 g，贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證SCXK(贛)2014-0001。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》(國(guó)科發(fā)財(cái)字﹝2006﹞398號(hào))的相關(guān)規(guī)定，嚴(yán)格遵守美國(guó)NIH發(fā)布的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的保護(hù)和使用指南(NIH 出版 No. 85-23, 1996修訂)，并嚴(yán)格遵守用最少的動(dòng)物數(shù)量完成實(shí)驗(yàn)并盡量減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物痛苦的原則。

1.2藥品和試劑歐前胡素(純度>99.5 %，購(gòu)自中國(guó)食品藥品鑒定研究院，批號(hào)110826-201214)，用二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品)溶解，吐溫-80(Tween 80，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品)助溶后用生理鹽水稀釋至所需濃度，溶媒對(duì)照液為含12.5% DMSO + 2% Tween 80的生理鹽水；Aβ1-42(美國(guó)sigma公司產(chǎn)品)，TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒(美國(guó)R&D 公司產(chǎn)品)，p-p38、p38、p-ERK、ERK一抗抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品)，BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Pierce公司產(chǎn)品)，ETC化學(xué)發(fā)光液(美國(guó)Pierce公司產(chǎn)品)，Marker蛋白(美國(guó)Pierce公司產(chǎn)品)，PVDF膜(美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品)，其它試劑為市售分析純。

1.3主要儀器RMT-100八臂迷宮視頻分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，ChemiDocTMXRS+成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，Bio-Rad電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，Thermo Varioskan Flash全波長(zhǎng)讀數(shù)儀(美國(guó)thermo公司)，TS-1000型脫色搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)，多用途旋轉(zhuǎn)搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)，CR22GⅢ高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司)，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)。

1.4方法

1.4.1小鼠AD模型的建立將Aβ1-42溶于滅菌注射用水中，密封后置37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育72 h。將小鼠用10%水合氯醛(350 mg·kg-1) 腹腔注射麻醉后，腦室內(nèi)注射參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行定位，用10 μL微量注射器在小鼠腦室內(nèi)(Bregma點(diǎn)后0.5 mm，中線旁開1.0 mm，深度2.5 mm)緩慢注射410 pmol (3.0 μL)凝聚態(tài)Aβ1-42，1 min注完，注射完后停留3 min再拔針。正常對(duì)照組小鼠腦室內(nèi)注射等體積滅菌注射用水。

1.4.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥雄性BALB/c小鼠48只，隨機(jī)分為4組，分別為正常對(duì)照組、AD模型組、AD模型+歐前胡素2.5 mg·kg-1和AD模型+歐前胡素5.0 mg·kg-1組，每組12只。AD模型+歐前胡素用藥組動(dòng)物在手術(shù)當(dāng)天開始腹腔注射給藥，1次/d，連續(xù)給藥13 d，正常對(duì)照組和AD模型組在相同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射溶媒10 mL·kg-1。

1.4.3八臂迷宮實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔注射給藥連續(xù)13 d后，進(jìn)行八臂迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，記錄小鼠的工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)(working memory errors，WME，即在同一次測(cè)試中小鼠再次進(jìn)入已吃過食粒的臂的次數(shù))、 參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)(reference memory errors，RME，即在同一次測(cè)試中小鼠進(jìn)入未放置食粒的臂的次數(shù))和總錯(cuò)誤次數(shù)(total errors，TE)。迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將動(dòng)物麻醉后斷頭取腦，分離出大腦皮層和海馬組織并分裝于冷凍管中，液氮中保存，用于各觀察指標(biāo)測(cè)定。

1.4.4小鼠大腦皮層和海馬組織中炎癥因子的測(cè)定按照試劑盒說明書配置勻漿介質(zhì)處理大腦皮層和海馬組織樣本，嚴(yán)格按照說明書的操作步驟，用ELISA檢測(cè)小鼠大腦皮層和海馬組織中TNF-α和IL-1β含量，蛋白定量采用BCA法。

1.4.5 WesternBlot檢測(cè)蛋白表達(dá)每組分別隨機(jī)取4只小鼠的部分大腦皮層和海馬組織，利用蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA法蛋白定量，實(shí)驗(yàn)各組取等量蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳，再轉(zhuǎn)膜至PVDF膜；將轉(zhuǎn)膜好的PVDF膜放置于含5%脫脂奶粉的TBST封閉液中，室溫下反應(yīng)1 h；封閉后加一抗抗體ERK(1∶1 000)、p-ERK(1∶2 000)、p38(1∶1 000)、p-p38(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min；再加用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗溶液(1∶5 000)，室溫下反應(yīng)2 h，用TBST洗膜3次，每次10 min；化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，掃描灰度值用Image J進(jìn)行測(cè)定分析。

2 結(jié) 果

2.1歐前胡素對(duì)AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙的影響八臂迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，正常對(duì)照組、AD模型組、歐前胡素2.5 mg·kg-1和5.0 mg·kg-1給藥組這4組小鼠在工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)、 參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)和總錯(cuò)誤次數(shù)三個(gè)指標(biāo)上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。通過LSD檢驗(yàn)顯示，與正常對(duì)照組比較，AD模型組小鼠的工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)、 參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)和總錯(cuò)誤次數(shù)較多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與AD模型組比較，歐前胡素2.5 mg·kg-1給藥組和5.0 mg·kg-1給藥組小鼠的工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)、參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)和總的錯(cuò)誤次數(shù)均較少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(對(duì)于2.5 mg·kg-1給藥組P均<0.05，對(duì)于5.0 mg·kg-1給藥組P均<0.01)(圖1)。說明歐前胡素可以改善AD模型小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶障礙。

圖1 歐前胡素對(duì)AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙的影響

注：Control：正常對(duì)照組，Model：AD模型組，IMP-L：歐前胡素 2.5 mg·kg-1組，IMP-H：歐前胡素5.0 mg·kg-1組；WME：工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)，RME：參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)，TE：總錯(cuò)誤次數(shù)。與正常對(duì)照組比較##P<0.01；與AD模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

2.2歐前胡素對(duì)小鼠大腦皮層和海馬中TNF-α和IL-1β的含量的影響ELISA結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、AD模型組、歐前胡素2.5 mg·kg-1和5.0 mg·kg-1給藥組這4組小鼠大腦皮層和海馬組織中TNF-α和IL-1β含量存在組間差異(P均<0.01)。通過LSD檢驗(yàn)顯示，與正常對(duì)照組相比，AD模型組大腦皮層和海馬兩個(gè)部位中 TNF-α和IL-1β的含量均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)；與AD模型組比較，歐前胡素兩個(gè)給藥組的TNF-α和IL-1β含量均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(對(duì)于2.5 mg·kg-1組P均<0.05，對(duì)于5.0 mg·kg-1組P均<0.01)，如圖2所示，說明歐前胡素可抑制Aβ1-42致小鼠AD后TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生。

圖2 歐前胡素對(duì)小鼠大腦皮層和海馬中 TNF-α和IL-1β的含量的影響

注：Control：正常對(duì)照組，Model：AD模型組，IMP-L：歐前胡素 2.5 mg·kg-1組，IMP-H：歐前胡素5.0 mg·kg-1組。與正常對(duì)照組比較##P<0.01；與AD模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

2.3歐前胡素對(duì)p-p38、p38、p-ERK和ERK蛋白表達(dá)的影響無論是大腦皮層還是海馬組織中，4組小鼠p-p38/p38和p-ERK/ERK這兩個(gè)指標(biāo)均有差異(P均<0.01)。通過LSD檢驗(yàn)，AD模型組小鼠同正常對(duì)照組相比，大腦皮層和海馬中p-p38/p38和p-ERK/ERK的比值均更高(P均<0.01)；與AD模型組比較，歐前胡素2.5 mg·kg-1和5.0 mg·kg-1兩個(gè)給藥組p-p38/p38和p-ERK/ERK的比值均更低(對(duì)于2.5 mg·kg-1組P均<0.05，對(duì)于5.0 mg·kg-1組P均<0.01)(圖3)。

圖3 歐前胡素對(duì)p-p38、p38、p-ERK和ERK蛋白表達(dá)的影響

注：Control：正常對(duì)照組，Model：AD模型組，IMP-L：歐前胡素 2.5 mg·kg-1組，IMP-H：歐前胡素5.0 mg·kg-1組。與正常對(duì)照組比較##P<0.01；與AD模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

3 討 論

我們前期利用腦室內(nèi)注射Aβ1-42誘導(dǎo)小鼠AD模型，采用跳臺(tái)法觀察了歐前胡素能改善小鼠被動(dòng)回避反應(yīng)學(xué)習(xí)記憶障礙。本實(shí)驗(yàn)采用八臂迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察歐前胡素對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶障礙的影響，研究顯示，歐前胡素能減少迷宮實(shí)驗(yàn)工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)、參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)和總的錯(cuò)誤次數(shù)，說明歐前胡素可以改善AD模型小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶障礙。

大量研究證實(shí)，β淀粉樣蛋白沉積老年斑和神經(jīng)元內(nèi)纖維纏結(jié)是AD的重要神經(jīng)病理性特征，炎癥反應(yīng)在AD的病理生理變化中起著重要作用[13-14]。TNF-α和IL-1β是介導(dǎo)AD發(fā)病及病理變化的重要炎癥介質(zhì)，在AD患者和AD動(dòng)物模型的腦中都已觀察到TNF-α和IL-1β明顯升高，抑制TNF-α和IL-1β產(chǎn)生及炎癥反應(yīng)，可防止和減慢AD的發(fā)病及進(jìn)展[15-16]。我們的結(jié)果顯示，腦室內(nèi)注射Aβ1-42誘導(dǎo)小鼠AD后，大腦皮層和海馬組織中TNF-α和IL-1β的含量升高，歐前胡素給藥組TNF-α和IL-1β含量低于AD模型組，說明歐前胡素可抑制Aβ1-42致小鼠AD后炎癥因子TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路是真核細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)到細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，此通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡和死亡等多種生理過程。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 (extracellular regulated protein kinases，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和ERK5是哺乳類細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路的主要亞族。大量研究證實(shí)，p38和ERK激活在AD的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用，抑制p38和ERK的激活有減輕炎癥反應(yīng)和抗AD的作用[17-19]。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Aβ1-42誘導(dǎo)小鼠AD后可導(dǎo)致大腦皮層和海馬中p-p38和p-ERK蛋白表達(dá)增加，而歐前胡素治療組p-p38和p-ERK蛋白的表達(dá)比模型組降低，歐前胡素可抑制p38和ERK 的激活。

綜上所述，歐前胡素具有改善AD癡呆模型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙的作用，歐前胡素可抑制大腦皮層和海馬組織中炎癥反應(yīng)。結(jié)合我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，歐前胡素可減輕AD癡呆模型小鼠腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制活性氧自由基和脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，對(duì)AD小鼠的被動(dòng)回避性學(xué)習(xí)記憶障礙具有改善作用。我們的研究結(jié)果提示，歐前胡素有防治AD的作用，其作用機(jī)制部分可能通過抑制氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)有關(guān)。我們將進(jìn)一步揭示歐前胡素防治AD的作用機(jī)制，為把歐前胡素開發(fā)用于防治AD提供理論依據(jù)。