廖建良 周澤鑫

摘要：以黃精種子作為試驗(yàn)材料，研究了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑浸種、浸種時(shí)間對(duì)黃精種子萌發(fā)的影響，以篩選適合黃精種子萌發(fā)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑;用黃精的地下根莖作為組織培養(yǎng)的材料，以篩選出合適的培養(yǎng)基。結(jié)果表明，GA3、6-BA和IAA這3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑都能對(duì)黃精種子的萌發(fā)起到明顯的促進(jìn)作用。其中GA3對(duì)黃精種子萌發(fā)的促進(jìn)作用要優(yōu)于6-BA和IAA，在GA3質(zhì)量濃度為150 mg/L，浸種時(shí)間為24 h時(shí)，其發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)最大，分別為 90.00%、64.67%。24 h的浸種效果要優(yōu)于12 h。在黃精植物組織培養(yǎng)中，最佳的消毒滅菌方式為先用75%乙醇溶液浸泡15 s、后再用0.1% HgCl2溶液浸泡20 min。理想的芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA、MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA。最優(yōu)的增殖培養(yǎng)基為MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA，增殖系數(shù)達(dá)到 2.1，且不定芽長(zhǎng)勢(shì)良好。

關(guān)鍵詞：黃精;植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑;快速繁殖;組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S567.23+9.043 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）10-0168-05

收稿日期：2019-03-26

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃（編號(hào)：2017A020213031）;惠州市科技項(xiàng)目（編號(hào)：2016X0427042）;惠州學(xué)院植物學(xué)課程群優(yōu)秀教學(xué)團(tuán)隊(duì)（編號(hào)：TD2016003）;廣東省植物學(xué)精品共享課程[編號(hào)：粵高校（2017）24號(hào)];惠州學(xué)院項(xiàng)目（編號(hào)：hzu201703）。

作者簡(jiǎn)介：廖建良（1965—），男，廣東紫金人，碩士，教授，研究方向?yàn)樗幱弥参飳W(xué)。E-mail：chxnljl@163.com。

黃精為百合科（Liliaceae）黃精屬（Polygonatum）多年生草本植物，具有藥用、食用、觀賞和美容等價(jià)值。黃精的種類很多，按形狀不同，可分別為“大黃精”“雞頭黃精”“姜形黃精”。黃精主要含多糖、低聚糖、黃酮、蒽醌、皂苷、木脂素等化合物，以其根莖入藥，性平、味甘，為滋補(bǔ)上品，具有滋陰潤(rùn)燥、補(bǔ)腎益精、降血脂、降血糖、降血壓、提高人體免疫力、抗衰老等功效[1-5]。因此，在研制新藥和開(kāi)發(fā)保健品等方面黃精具有廣闊前景。由于人們對(duì)黃精的需求日益增加，野生黃精資源已遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)今生產(chǎn)需要，人工規(guī)模化種植成為黃精資源獲得的發(fā)展趨勢(shì)。黃精的繁殖方式為有性繁殖（種子繁殖）和無(wú)性繁殖（根莖繁殖）2種[6-7]，但其種子成熟后具較長(zhǎng)的休眠期，且種子在自然條件下發(fā)芽率極低，播種后第1年出苗率也低，從播種到收成的生長(zhǎng)歷程長(zhǎng)達(dá)5～6年，黃精生長(zhǎng)緩慢，藥材稀缺，黃精市場(chǎng)需求量日益增加[8-9]。而植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能打破種子休眠期，促進(jìn)種子活性，提高種子發(fā)芽率等，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑具有較強(qiáng)的針對(duì)性，很少的量就能達(dá)到明顯的效果[10-16]。目前植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于黃精繁殖的報(bào)道鮮少，所以本試驗(yàn)主要探討植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黃精萌發(fā)的促進(jìn)作用，找出適合廣東省惠州栽培黃精的最適濃度和浸種時(shí)間，以黃精根莖為組培材料，研究其組培過(guò)程中適合的培養(yǎng)基與合適的消毒方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、試驗(yàn)地點(diǎn)和時(shí)間

從廣東省惠州市羅浮山基地采集黃精果實(shí)和黃精苗，果實(shí)去除果皮，將新鮮的種子清洗干凈并在室內(nèi)陰涼處曬干水分，黃精苗移栽至大棚。研究地點(diǎn)在廣東省惠州市博羅石灣農(nóng)業(yè)推廣中心組培室及大棚，試驗(yàn)時(shí)間為2017年7月至2018年5月。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子處理試驗(yàn)

1.2.1.1 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理 選取顆粒飽滿的黃精種子分別浸泡在50、100、150、200 mg/L的IAA（吲哚乙酸）、GA3（赤霉素）、6-BA（6-芐氨基嘌呤）溶液中，分別處理12、24 h，再用蒸餾水漂洗 5 min 后，將其均勻置于墊有2層充分吸濕濾紙的培養(yǎng)皿中，于25 ℃的培養(yǎng)箱和黑暗條件下進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)，每個(gè)處理50粒種子，3次重復(fù)。

1.2.1.2 對(duì)照組處理 清水浸泡種子12、24 h做對(duì)照試驗(yàn)，置于墊有2層充分吸濕濾紙的培養(yǎng)皿中，于25 ℃的培養(yǎng)箱中在黑暗條件下進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)，每個(gè)處理50粒，3次重復(fù)。

1.2.1.3 發(fā)芽數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 種子萌發(fā)試驗(yàn)在25 ℃的培養(yǎng)箱中在無(wú)光條件下進(jìn)行，試驗(yàn)期間每天觀察種子發(fā)芽情況，以60 d為種子發(fā)芽期限，30 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，60 d時(shí)所得數(shù)據(jù)為最終的發(fā)芽率，胚根突破種皮即可視為發(fā)芽。

發(fā)芽率=60 d時(shí)種子總發(fā)芽數(shù)/總體種子數(shù)×100%;

發(fā)芽勢(shì)=30 d時(shí)種子總發(fā)芽數(shù)/總體種子數(shù)×100%。

1.2.2 黃精組培試驗(yàn)

1.2.2.1 不同消毒處理下的滅菌效果 切去健康黃精苗的葉片和根系，將黃精根莖中帶有小芽的那部分切下，放入錐形瓶中。在流水條件下用牙刷將其帶芽根莖上的雜質(zhì)刷洗干凈，后放入含有洗衣粉的水中浸泡10 min，再流水沖洗30 min。轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)，并盡可能剃除其表面的黑斑。用75%乙醇溶液浸泡消毒15、30 s，接著用無(wú)菌水沖洗3次，每次3 min，再用0.1% HgCl2溶液深入滅菌10、15、20 min。在無(wú)菌水中不斷晃洗3次，每次 3 min。將滅完菌的黃精根莖置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，再切去其與乙醇以及0.1% HgCl2接觸的傷口和塊莖上已壞死的組織，將其接種于MS培養(yǎng)基中，每瓶接種1個(gè)外植體，每個(gè)處理5瓶，重復(fù)3次，20 d后統(tǒng)計(jì)其污染率。

1.2.2.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)黃精不定芽的誘導(dǎo)效果 將黃精外植體按照最佳效果進(jìn)行滅菌處理后，將其移至5種不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶 1～2個(gè)芽，每個(gè)處理10瓶，10個(gè)芽為1個(gè)重復(fù)，重復(fù)3次，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)、觀察，30 d后統(tǒng)計(jì)其誘導(dǎo)情況。

誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出的芽個(gè)數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%。

1.2.2.3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黃精不定芽增殖的影響 待誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出不定芽且不定芽的數(shù)量足夠后，將含有分化出不定芽的塊莖切去芽苗，并切成1 cm3左右的小塊，接入不同激素組合的增殖培養(yǎng)基中，每瓶1～2個(gè)芽，每個(gè)處理10瓶，10個(gè)芽為一個(gè)重復(fù)，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)增殖情況。

增殖系數(shù)=（萌發(fā)總芽數(shù)-接種時(shí)的芽數(shù)）/接種時(shí)的芽數(shù)。

1.2.2.4 組織培養(yǎng)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，加入25 g/L的蔗糖、7 g/L的卡拉膠，再根據(jù)試驗(yàn)的需求添加不同質(zhì)量濃度的6-BA（6- 芐氨基嘌呤）、GA3（赤霉素）、NAA（萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）等激素，調(diào)節(jié)其pH值為5.8～6.0，配完后裝入培養(yǎng)瓶中，滅菌，滅菌條件為 121 ℃、131 kPa、20 min。滅菌完后將其放置于冷凝室降溫，當(dāng)其溫度為室溫時(shí)可接種，材料接完后置于（溫度保持在25 ℃左右）恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)，光照時(shí)間12 h/d，光照度2 100～2 500 lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度的GA3對(duì)黃精種子萌發(fā)的影響

從表1可以看出，浸種時(shí)間和GA3的質(zhì)量濃度都對(duì)黃精種子的萌發(fā)有影響，并且浸種時(shí)間24 h的效果要優(yōu)于12 h。隨著GA3質(zhì)量濃度的增加，黃精種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。GA3質(zhì)量濃度為0～150 mg/L時(shí)，隨著GA3質(zhì)量濃度的增加，黃精種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)也隨之增大。當(dāng)GA3質(zhì)量濃度為150 mg/L且浸種時(shí)間為24 h時(shí)，黃精種子萌發(fā)的發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)最大，分別為90.00%、64.67%。超過(guò)150 mg/L后，GA3對(duì)其萌發(fā)的促進(jìn)作用隨質(zhì)量濃度的增加而降低，但依舊高于CK組?？傊?，在0～200 mg/L之間，對(duì)比CK組，GA3對(duì)黃精的萌發(fā)具有明顯的促進(jìn)作用。

2.2 不同質(zhì)量濃度的6-BA對(duì)黃精種子萌發(fā)的影響

由表2可知，6-BA對(duì)黃精種子的萌發(fā)也具有促進(jìn)作用，并且不同質(zhì)量濃度和不同的浸種時(shí)間對(duì)其萌發(fā)的影響都不同，總體上看，浸種時(shí)間24 h的效果要優(yōu)于12 h。隨著質(zhì)量濃度的升高，黃精種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)呈現(xiàn)一個(gè)先增加后減少的趨勢(shì)。6-BA質(zhì)量濃度為0～100 mg/L時(shí)，隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加，黃精種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)也隨之增大。在6-BA的質(zhì)量濃度達(dá)到100 mg/L、浸種時(shí)間為24 h時(shí)，黃精種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)最大，分別為84.67%、60.67%。當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)100 mg/L后，6-BA對(duì)其萌發(fā)的促進(jìn)作用隨質(zhì)量濃度的增加而降低，但依舊高于CK組。

2.3 不同質(zhì)量濃度的IAA對(duì)黃精種子萌發(fā)的影響

由表3可知，IAA對(duì)黃精種子的萌發(fā)也具備一定的促進(jìn)作用，并且不同質(zhì)量濃度和不同浸種時(shí)間對(duì)其萌發(fā)的影響都不同。隨著質(zhì)量濃度的升高，黃精種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)呈現(xiàn)一個(gè)先增加后減少的趨勢(shì)。IAA質(zhì)量濃度為0～100 mg/L時(shí)，隨著IAA質(zhì)量濃度的增加，黃精種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)也隨之增大。在IAA質(zhì)量濃度達(dá)到100 mg/L時(shí)，黃精種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)最大，分別為80.67%、56.67%。當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)100 mg/L后，IAA對(duì)其萌發(fā)的促進(jìn)作用反而隨質(zhì)量濃度的增加而降低，并且在200 mg/L時(shí)，與對(duì)照組差異不大。IAA對(duì)黃精種子萌發(fā)的促進(jìn)作用較明顯。

2.4 不同消毒處理對(duì)黃精外植體的滅菌效果

由表4可知，0.1% HgCl2溶液浸泡時(shí)間越久，污染率越低，外植體的存活率也越高。0.1% HgCl2溶液浸泡時(shí)間為10 min、75%乙醇溶液為15 s時(shí)，污染率最高，為53.3%左右，而0.1% HgCl2溶液浸泡時(shí)間為10 min、75%乙醇溶液為30 s時(shí)，存活率最低，為33.3%左右。隨著75%乙醇溶液時(shí)間的增加，存活率不具有明顯增加的趨勢(shì)。從表4的5組處理中，處理3的效果最佳，因此，選擇其為最佳的消毒滅菌方式。

2.5 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)誘導(dǎo)不定芽的影響

由表5可知，NAA、IBA、IBA這3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑均可誘導(dǎo)芽的萌發(fā)，其中IAA和IBA的效果差異不大，出芽個(gè)數(shù)大致相同。在6-BA均為2 mg/L時(shí)，6-BA與IBA組合的誘導(dǎo)率和6-BA與IAA組合的誘導(dǎo)率高于6-BA與NAA組合的誘導(dǎo)率，所以IAA 0.5 mg/L和IBA 0.5 mg/L均適合黃精不定芽的誘導(dǎo)。隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加，不定芽的個(gè)數(shù)明顯增加，可看出3 mg/L的6-BA比2 mg/L的 6-BA在試驗(yàn)中誘導(dǎo)不定芽的個(gè)數(shù)更多，也就是在一定范圍內(nèi)，6-BA質(zhì)量濃度的增加有利于黃精誘導(dǎo)出更多不定芽。因此，MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA、MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA均可作為黃精的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

2.6 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑黃精不定芽增殖的影響

由表6可知，4種不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比的培養(yǎng)基增殖產(chǎn)生的不定芽生長(zhǎng)狀況均不錯(cuò)，其中 4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3的培養(yǎng)基生長(zhǎng)狀況最好， 但其增殖系數(shù)在6-BA質(zhì)量濃度相同的情況下不是最高，由此可看出GA3有利于不定芽的生長(zhǎng)，對(duì)不定芽的分化增殖效果也不低，但并不是最佳培養(yǎng)基。對(duì)比前3個(gè)處理組，4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA培養(yǎng)基的效果最佳，而NAA的效果最差，因此，適宜的增殖培養(yǎng)基為MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA。在6-BA質(zhì)量濃度相同時(shí)，IAA的增殖系數(shù)最大，效果最好，IAA對(duì)黃精不定芽的增殖效果要優(yōu)于GA3和NAA。從表現(xiàn)性狀上看，高質(zhì)量濃度的6-BA對(duì)黃精不定芽分化起著很重要的作用。

3 結(jié)論與討論