王曉艷，權(quán)會琴，杜 虹，申煥君，王平忠

(空軍軍醫(yī)大學(xué) 唐都醫(yī)院 傳染病診療中心，陜西 西安 710038)

肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤之一，占所有腫瘤的5%以上[1-2]，每年全球約有50萬～100萬的新發(fā)病例[3]。HCC的發(fā)展具有與其他實體瘤類似的多步致癌過程，但有不同的病因。乙型肝炎(HBV)或丙型肝炎(HCV)病毒感染、大量酒精攝入、長期膳食暴露于黃曲霉毒素或氯乙烯，以及原發(fā)性血色素沉著癥等都與HCC發(fā)生發(fā)展有關(guān)[4]。其中，Wnt/β-catenin通路異?；罨瘜CC的發(fā)生發(fā)展可能起促進作用。

1 Wnt/β-catenin信號通路

Wnt是一種富含半胱氨酸的糖蛋白，其信號通路高度保守，在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，比如胚胎發(fā)育、體內(nèi)動態(tài)平衡和癌癥[5-6]。Wnt/β-catenin 信號通路與腫瘤有著密切的關(guān)系， 該通路的異常活化參與人類多種癌癥的發(fā)病過程。在Wnt信號通路中，F(xiàn)zd受體結(jié)合共受體LRP5/6形成復(fù)合體能夠激活Wnt經(jīng)典通路和Wnt非經(jīng)典通路。目前關(guān)于經(jīng)典通路研究得相對較多。正常情況下，經(jīng)典通路中β-catenin結(jié)合GSK3β, CKI, axin 和APC，GSK3β磷酸化β-catenin，隨后被泛素化并導(dǎo)致降解；在受到刺激時，GSK3β磷酸化LRP5/6，導(dǎo)致復(fù)合體解聚，阻止β-catenin降解并在細胞質(zhì)中積累，隨后轉(zhuǎn)入核內(nèi)并和轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，引起下游Wnt的不同靶基因的表達，調(diào)節(jié)生理過程。如圖1所示[7]。而在非經(jīng)典通路中，不需要β-catenin的介入，包括Wnt/Ca2+通路、PCP通路和JNK 信號通路[8]。研究發(fā)現(xiàn)一些拮抗劑可通過阻止Wnt/FZD/LRP5/6復(fù)合物的形成來調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路，例如DKKs、sFRP和Wnt抑制因子。Wnt/β-catenin信號通路的異?；罨軌?qū)е娄?catenin積累，促進HCC的發(fā)生發(fā)展[9]。

圖1 Wnt/β-catenin信號通路[7]Fig 1 Wnt/β-catenin signaling pathway[7]

2 DKK在肝癌發(fā)展中的作用

許多報道指出一些細胞外蛋白質(zhì)可以作為Wnt拮抗劑調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路，例如SFRP、WIF-1和DKK[10-11]。在脊椎動物中，DKK蛋白家族包括4個成員，分別為DKK1，DKK2，DKK3和DKK4，其具有不同的生化和生理特性。DKK家族共享兩個保守的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，N端的cysteine-rich對于每種類型的DKKs都是特異的，而C端在每個成員中是保守的。DKK在腫瘤細胞系或組織中的表達(結(jié)直腸癌、卵巢癌、胃癌和腎細胞癌)均有研究。本文主要綜述DKK家族在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

2.1 DKK1

1998年人們首次研究了DKK1在非洲爪蟾頭部發(fā)育中的作用。該研究組發(fā)現(xiàn)負責(zé)神經(jīng)板和頭部形成的胚胎細胞群分泌的DKK1抑制了爪蟾胚胎中Wnt信號通路[12-13]。后來Krupnik等[14]從人胎腎cDNA文庫中分離出DKK1克隆序列。人DKK1基因長度為1815 kb，蛋白由266個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約為29 kDa。有研究表明在肺腺癌中，DKK1由于表觀遺傳修飾表達降低，然而DKK1在另一些腫瘤中是過表達的，比如肝癌、肺癌、食道癌、骨肉瘤、卵巢上皮癌和多發(fā)性骨髓瘤。關(guān)于DKK1在肝癌中是致癌還是抑癌仍然存在分歧。

p53是細胞中最重要的腫瘤抑制基因之一，可作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)大量靶基因的表達。Wnt基因是一個可以促進肝細胞癌變后增殖和轉(zhuǎn)移的原癌基因。研究發(fā)現(xiàn)，當p53功能消失時，Wnt能夠加劇腫瘤的發(fā)生。Wang等[15]用p53缺失的腺病毒載體轉(zhuǎn)染Hep3B細胞，RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)DKK1在20 h后開始表達，且逐漸增加，32 h達到高峰，提示p53可調(diào)節(jié)Wnt信號通路抑制劑DKK1。表明p53介導(dǎo)的DKK1對Wnt信號傳導(dǎo)具有拮抗作用。

全基因組DNA低甲基化和啟動子區(qū)特異性高甲基化可導(dǎo)致形成廣泛的癌癥，包括HCC[16]。過度的高甲基化可導(dǎo)致關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄沉默。這些基因包括，抗腫瘤基因、細胞增殖抑制基因(p16INK4A, p21, p27, RASSF1A, SOCS1-3)、細胞凋亡(CASP8)、轉(zhuǎn)移(E-Cadherin)和DNA修復(fù)(GSTP1)等。研究發(fā)現(xiàn)在肝硬化和肝癌組織中DKK1的甲基化程度均高于正常肝臟組織，并且mRNA水平降低，表明肝癌轉(zhuǎn)移是由于DKK1的甲基化修飾引起其表達沉默所致[17]。Liang等[18]通過MSP和RT-PCR研究，表明在癌組織中DKK1和DKK3的甲基化水平最高，mRNA水平最低。在Aza處理后，DKK1和DKK3的mRNA水平升高58.9～59.3倍。表明在肝癌組織中，DKK1由于其甲基化而表達下降。Qin等[19]將H7402改造成轉(zhuǎn)移肝癌細胞系M-H7402，通過相關(guān)檢測發(fā)現(xiàn)DKK1和磷酸化β-catenin在M-H7402中表達顯著下降，而β-catenin表達上調(diào)并且在細胞核中積聚，DKK1表達下降促進H7402細胞的轉(zhuǎn)移。另有研究發(fā)現(xiàn)， DKK1通過激活β-catenin/MMP7 信號通路促進HCC細胞遷移和侵襲發(fā)揮致癌作用[20]，表明DKK1可能作為一個HCC治療的潛在靶標。

然而，Yu等[21]得到了相反的結(jié)論，他們發(fā)現(xiàn)DKK1在轉(zhuǎn)移性肝癌細胞系中和肝癌復(fù)發(fā)病人中過表達，這意味著DKK1在肝癌中作為一個致癌因子而不是抑癌因子?？梢姡珼KK1在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用仍需進一步研究。

另外，研究發(fā)現(xiàn)miR-217通過負調(diào)控DKK1，激活Wnt/β-catenin信號通路，促進肝細胞癌的致瘤性[22]。此外，在臨床方面，有研究指出DKK1和AFP聯(lián)合應(yīng)用比單獨應(yīng)用AFP具有更好的診斷率，單獨使用AFP優(yōu)于DKK1和DKK3[23]。另一研究發(fā)現(xiàn)利用CSCs cDNA微陣列數(shù)據(jù)庫鑒定了DKK1 mRNA在HCC組織中的表達，可以反映HCC患者的腫瘤特異性，其有望成為HCC一個新的預(yù)后指標[24]。

2.2 DKK2

DKK2作為DKK家族的一員，和其他成員不同，研究的報道最少。近年來，DKK2的表觀遺傳沉默現(xiàn)象在結(jié)直腸癌、胃癌[25]、腎癌[26]、卵巢癌[27]等諸多腫瘤中已被證實。在卵巢癌方面，Zhu等[27]體內(nèi)外實驗均發(fā)現(xiàn)DKK2的表達增強會抑制Wnt/β-catenin通路，進而抑制腫瘤生長。DKK2也可能是乳腺癌正常亞型的一種潛在的預(yù)后生物標志物。

Lin等[28]通過轉(zhuǎn)染Huh7細胞來研究DKK2在Wnt/β-catenin信號通路中的作用，發(fā)現(xiàn)DKK2可作為Wnt3a的拮抗劑來抑制細胞增殖，并且具有劑量依賴性。在DKK2缺陷型小鼠模型的研究顯示，小鼠DKK2的缺失與肝癌的發(fā)生和干細胞特性的富集有關(guān)?？傊珼KK2可能通過Wnt依賴和獨立機制在肝癌發(fā)生過程中發(fā)揮作用，可作為流行病學(xué)研究的生物標志物。此外，miR-197能夠誘導(dǎo)HCC細胞侵襲，DKK2通過β-catenin信號通路發(fā)揮作用。

另有研究發(fā)現(xiàn)，與相應(yīng)的非癌性肝硬化組織(16%，50例中8例)相比，HCC組織中DKK2啟動子區(qū)顯著甲基化(42%，50例中21例)，表明DKK2通過甲基化發(fā)揮其在肝癌中的作用[29]。DKK2與HCC預(yù)后的關(guān)系尚未見研究，仍有待進一步證實。在卵巢癌方面，Zhu等[27]體內(nèi)外實驗均發(fā)現(xiàn)DKK2過表達，其下游Wnt信號基因cyclin D1和c-Myc表達減少，進而抑制卵巢癌細胞的侵襲。

2.3 DKK3

DKK3可作為一種腫瘤抑制因子在肝癌中發(fā)揮作用。Hsieh等[30]報道指出，相較于人正常肝組織，DKK3 mRNA在人肝癌組織中表達水平降低。相較于肝硬化組織樣本，肝癌組織中DKK3甲基化發(fā)生頻率、甲基化水平更高，提示DKK3啟動子甲基化可能是肝硬化向肝癌轉(zhuǎn)變的一個重要事件[29]。此外， DKK3啟動子甲基化與肝癌手術(shù)切除后不久復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移后生存率降低有關(guān)。因此，DKK3基因甲基化在肝癌中具有重要意義，但具體機制尚不明確，有待進一步研究。

上述DKK3的研究均局限在肝癌組織中，血清中DKK3蛋白水平或DKK3啟動子甲基化目前尚未見報道。在乳腺癌和急性淋巴細胞白血病(ALL)中DKK3表達降低，DKK3可以作為這些疾病的潛在的治療靶點和診斷的生物標志物，但在肝癌中還未得到有力的證實。

微小RNA(miRNA)直接結(jié)合靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(UTR)沉默基因。因此，miRNA參與包括細胞存活，增殖，分化，凋亡，遷移，自噬，侵襲，血管生成和腫瘤發(fā)生等多種生物過程。近幾十年來，一些報道指出miRNA的失調(diào)與癌癥的發(fā)展和進展相關(guān)。MiRNA-125在許多物種中高度保守，miR-125b可直接結(jié)合DKK3的3′UTR區(qū)域(核苷酸626和648之間的序列)，下調(diào)DKK3表達，調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Pei等[31]發(fā)現(xiàn)GATA4是一種在肝母細胞瘤增殖期間抑制miR-125b表達并誘導(dǎo)DKK3活化的上游因子。GATA4/miR-125b/DKK3通路可能作為一個新型小兒肝母細胞瘤患者的治療靶點。值得關(guān)注的是，GATA4在哺乳動物肝臟發(fā)育中扮演著特定的角色。一些研究表明GATA4表達缺失發(fā)生在許多癌癥中，包括上皮性卵巢癌，腎上腺皮質(zhì)腫瘤，肝細胞癌和結(jié)直腸癌等，表明GATA4可以作為TSG起作用。

2.4 DKK4

DKK4是DKK家族中最小的成員，目前有研究證實DKK4是Wnt信號通路中重要的調(diào)節(jié)因子，與肝癌和結(jié)腸癌相關(guān)[32]。據(jù)報道，DKK4過表達能夠抑制細胞增殖、遷移和侵襲；相反通過shRNA敲低DKK4則可促進細胞增殖和侵襲[33]，且在DKK4過表達裸鼠模型中觀察到腫瘤尺寸變小。此外，DKK4高表達組的肝癌患者總生存率高于DKK4低表達組，證實DKK4能夠抑制腫瘤進展。

DKK4作為Wnt信號通路的重要調(diào)節(jié)因子，在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Fatima等[34]通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)在HCC組織中DKK4 mRNA的表達下降47%，免疫組化分析發(fā)現(xiàn)相較于非肝癌組織，癌組織中DKK4蛋白表達減少58%左右。另有研究發(fā)現(xiàn)在44個腫瘤組織中DKK4 mRNA表達下降56.8%，以及芯片發(fā)現(xiàn)DKK4在肝癌組織和癌旁組織的表達均低于正常肝臟組織。這表明DKK4可能通過抑制Wnt/β-catenin信號而發(fā)揮抑癌作用。通過瞬時轉(zhuǎn)染DKK4的腫瘤細胞中細胞質(zhì)中β-catenin水平下降，下游分子c-Jun，cyclinD1和CD44水平下調(diào)[34]，而細胞核中β-catenin的變化未見報道，表明DKK4無法單獨抑制經(jīng)典Wnt信號通路，需要其他因子輔助。

在HCC細胞系中過表達DKK4后總GSK3β的水平?jīng)]有變化，但是磷酸化的GSK3β下降。LiCl抑制GSK3β后通過穩(wěn)定β-catenin能減少DKK4表達，進而抑制腫瘤細胞的增殖[33]。總之，活化的GSK3β對DKK4介導(dǎo)的抑制作用和β-catenin磷酸化十分重要。有研究報道大多數(shù)DKK4在細胞質(zhì)中表達。β-catenin主要聚集在肝癌細胞的細胞質(zhì)和細胞核中，但在鄰近的肝組織中，發(fā)現(xiàn)β-catenin主要聚集在細胞膜和細胞質(zhì)中，且表達下降。DKK4與細胞核中的β-catenin水平呈負相關(guān)。表明DKK4可以調(diào)節(jié)β-catenin入核而發(fā)揮作用。

此外，有文獻報道，在T3介導(dǎo)下， TR能夠結(jié)合DKK4基因啟動子區(qū)1645-1629核苷酸，上調(diào)了DKK4水平，進而抑制肝癌細胞Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化及腫瘤進展[35-36]。同時，在高糖條件下，c-Myc、DKK4和β-catenin之間的相互作用可促進肝癌細胞增殖。高糖會減少DKK4蛋白并激活經(jīng)典的Wnt信號，進而將β-catenin轉(zhuǎn)運到細胞核中，加速HCC細胞增殖。這些結(jié)果證明DKK4抑制了高糖誘導(dǎo)的β-catenin依賴的HCC細胞增殖[33]。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，DKK家族成員在肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有不同的作用，其多種表達調(diào)控機制在疾病的預(yù)警方面也有重要意義。盡管Wnt/β-catenin信號通路抑制劑DKK在肝癌發(fā)生發(fā)展進程中起到了關(guān)鍵的作用，但仍然有一些細節(jié)尚不清楚，如DKK1致癌或者抑癌作用與什么因素有關(guān)？DKK2在肝癌預(yù)后方面是否發(fā)揮作用？DKK3在肝癌組織中甲基化下調(diào)的具體作用機制是什么？等問題尚待進一步闡明。因此，深入理解Wnt/β-catenin信號通路抑制劑DKK家族成員的具體作用機制，闡明其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的研究具有重要意義。