黃柳云 梁瑩瑩 李江平 黃曉燕 韋玉金 許 遜

(柳州兩面針股份有限公司 545001)

牙膏是人們?nèi)粘Ｉ畹谋匦杵?，牙膏的品質(zhì)直接影響消費(fèi)者的使用感受和健康。牙膏在生產(chǎn)、使用過程及保質(zhì)期等各環(huán)節(jié)中，會因使用原料、生產(chǎn)環(huán)境等諸多因素的影響，而受到微生物的污染。當(dāng)微生物達(dá)到一定數(shù)量后，易出現(xiàn)產(chǎn)品的變色、變味及分離出水等質(zhì)量問題[1]。為了牙膏質(zhì)量的穩(wěn)定和消費(fèi)者使用的安全，牙膏中有必要加入一定量的防腐劑。

在我國2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中，被允許使用的防腐劑類型有51種。綜合考慮到抑菌效果、安全性以及價格，目前在牙膏防腐體系中常用的防腐劑有苯甲酸鈉、苯甲醇、尼泊金復(fù)合酯鈉等。在pH值較高的體系中，苯甲酸鈉的抑菌效果會明顯下降，石粉體系牙膏的pH值一般都較高，在該體系中使用苯甲酸鈉作為防腐劑效果不好[2]，故本實(shí)驗(yàn)選用以苯甲醇主，尼泊金為輔的防腐體系，通過LB肉湯抑菌實(shí)驗(yàn)，測試不同濃度的苯甲醇在單獨(dú)使用及與尼泊金丙酯鈉、尼泊金丁酯鈉復(fù)配后，對環(huán)境腐敗陽性細(xì)菌的抑菌能力，選擇具有良好效果的防腐劑樣例與牙膏基礎(chǔ)配方進(jìn)行牙膏樣品配制，進(jìn)行微生物挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證苯甲醇的防腐效果，為石粉牙膏的防腐體系研究提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

原料：苯甲醇(由湖北綠色家園提供)、尼泊金丙酯鈉、尼泊金丁酯鈉(由江南大學(xué)提供)。

菌種：大腸桿菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、銅綠假單胞菌(ATCC9027)、白色念珠菌(ATCC10231)、黑曲霉(ATCC16404)、平滑正青霉(ATCC10464)，標(biāo)準(zhǔn)菌種由廣東省微生物分析檢測中心提供。

從生產(chǎn)環(huán)境用水、原料以及變質(zhì)樣品中分離并鑒定的菌株：泛菌屬(Pantoea Gavini et al.,1989)JS079-123G、鹽單胞菌(Halotalea alkalilenta)JS079-123E、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus cineris)FX4、枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilis)FX14，由廣東省微生物分析檢測中心鑒定。

試劑：磷酸鹽緩沖液(PBS，0.03mol/L，pH值為7.2～7.4)；0.85%生理鹽水；卵磷脂、吐溫80-營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、TTC指示劑，均由廣州環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種制備

取細(xì)菌第3～6代的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物(18～24h)，用30ml0.03mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗下菌苔，制成菌懸液。大腸桿菌在450nm波長處吸光度(Optical Density，OD)為1.5～1.7的菌懸液；金黃色葡萄球菌在450nm波長處吸光度(Optical Density，OD)為1.4～1.6的菌懸液，用細(xì)菌計(jì)數(shù)板測定細(xì)菌的濃度為109cfu/ml，備用。將黑曲霉和繩狀青霉從甘油管中分別接種到PDA平板，置于恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)7d。培養(yǎng)好后用滅菌緩沖液PBS洗脫孢子，并稀釋至106cfu/ml，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，備用。

其中泛菌屬、鹽單胞菌制成109cfu/ml的環(huán)境腐敗陰性混合菌懸液，類芽孢桿菌屬、枯草芽孢桿菌制成109cfu/ml的環(huán)境腐敗陽性混合菌懸液，備用。

1.2.2LB肉湯抑菌實(shí)驗(yàn)

制備100mL/瓶LB肉湯培養(yǎng)基于錐形瓶中，滅菌備用。以無菌操作將防腐劑按照作用濃度按比例加入100m的LB肉湯培養(yǎng)基中，制成抑菌溶液。取1ml含菌量為108cfu/ml的菌懸液接種于抑菌溶液中，作為試驗(yàn)組樣本；以同樣的方法將菌懸液接種不含防腐劑的LB肉湯中，作為陽性對照組樣本；取1瓶空白LB肉湯培養(yǎng)基作為陰性對照組樣本。將試驗(yàn)組樣本、陽性對照組樣本、陰性對照組樣本放置在37℃的搖床中振蕩培養(yǎng)48h，然后分別吸取振蕩后液各1mL，以瓊脂傾注法接種平皿，每個樣液接種兩個平皿，置于37℃培養(yǎng)48h，用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.3微生物挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)

本次實(shí)驗(yàn)參考化妝品、盥洗用品與香料協(xié)會(CTFA)、美國藥典的微生物挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)方法[3,4,5]以及實(shí)際生產(chǎn)情況，即將霉菌混合后制成106cfu/g的菌膏，細(xì)菌混合后制成107cfu/g的菌膏，分別取10g菌膏接種到90g牙膏樣品中，在第7d、14d、21d和28d用平板計(jì)數(shù)法檢測微生物的存活狀態(tài)。

1.3 樣品配置

1.3.1LB肉湯實(shí)驗(yàn)樣品

表1 LB肉湯抑菌實(shí)驗(yàn)樣品配比表 單位：%

原料分組1#2#3#4#5#6#7#8#9#10#山梨醇28282828282828282828苯甲醇0.50.40.30.20.10.30.30.20.20.5尼泊金丙酯鈉-----0.1-0.1-0.1尼泊金丁酯鈉------0.1-0.10.1

1.3.2微生物挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)樣品

依據(jù)LB肉湯實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇具有抑菌效果的防腐劑樣例與牙膏基礎(chǔ)配方進(jìn)行牙膏樣品配制，進(jìn)行微生物挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LB肉湯抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

LB肉湯抑菌實(shí)驗(yàn)主要根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)環(huán)境中產(chǎn)生的腐敗生物，進(jìn)行防腐劑配比的初篩實(shí)驗(yàn)。根據(jù)細(xì)菌在液體中通過快速長時間振蕩，快速增加微生物的數(shù)量以及增加微生物與防腐劑的接觸，以顯示其抑菌作用。試驗(yàn)根據(jù)平皿菌落計(jì)數(shù)判定其是否具有抑菌能力。LB肉湯抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 LB肉湯抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可見:①隨著苯甲醇濃度的增加，測試樣品對環(huán)境腐敗菌的抑菌效果逐漸增強(qiáng)；②苯甲醇與尼泊金丙酯鈉復(fù)配的抑菌效果，要優(yōu)于苯甲醇與尼泊金丁酯鈉復(fù)配的抑菌效果；③0.5%苯甲醇的抑菌效果與0.3%苯甲醇+0.1尼泊金丙酯鈉的抑菌效果相同。

2.2 挑戰(zhàn)性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)2.1中LB肉湯抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇1#、2#、3#、6#、10#五個防腐劑配比，復(fù)配碳酸鈣、山梨醇、K12、黃原膠以及潔凈水等原料進(jìn)行牙膏樣品配制。

判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)細(xì)菌在7d時下降到100cfu/g以下，7～28d全部為0，并且測試期間沒有增加，則視為效果優(yōu)良通過挑戰(zhàn)試驗(yàn)；若7d時下降到1000cfu/g以下，在7～28d內(nèi)菌數(shù)持續(xù)下降，并保持在100cfu/g以下，則視為通過；若7d時下降到1000cfu/g以上，在7～28d內(nèi)菌數(shù)持續(xù)下降，保持在100cfu/g以下，則視為勉強(qiáng)通過；若7d時下降到1000cfu/g以上，且在7～28d內(nèi)菌數(shù)無下降趨勢，則視為不通過。

霉菌在7d時下降到1000cfu/g以下，并且測試剩余的在合適的數(shù)據(jù)范圍內(nèi)沒有增加，則視為通過。

對標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌的挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌的挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對標(biāo)準(zhǔn)霉菌的挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)霉菌的挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對環(huán)境腐敗細(xì)菌的挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 環(huán)境腐敗細(xì)菌的挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3、4、5可知：

①樣品10#在第7天，標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌、標(biāo)準(zhǔn)霉菌和環(huán)境腐敗細(xì)菌的總數(shù)從初始值降至1000cfu/g以下，7～28天細(xì)菌、霉菌以及環(huán)境腐敗菌總數(shù)沒有增加，且一直穩(wěn)定保持在100cfu/g以下，防腐效果最好。

②樣品6#在第7天標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌、環(huán)境腐敗菌從初始值降至1000cfu/g以上，雖14d～28d持續(xù)下降，但未能保持在100cfu/g以下，不能通過細(xì)菌挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)。而標(biāo)準(zhǔn)霉菌在第7天從初始值降至10cfu/g以下，且保持穩(wěn)定，通過霉菌挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)。

③單獨(dú)添加苯甲醇的石粉牙膏(樣品1#、2#、3#)防腐效果不理想，雖含量為0.5%和0.4%時，能勉強(qiáng)通過細(xì)菌挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)，但含量為0.3%時不能通過挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)。

④防腐效果由好至差排序?yàn)椋簶悠?0#--1#--2#--6#--3#。

2.3 二次挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)

因2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，環(huán)境腐敗細(xì)菌的挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不是很理想，而實(shí)驗(yàn)要更貼近實(shí)際生產(chǎn)，故在考慮了防腐體系的同時，重新設(shè)計(jì)石粉牙膏山梨醇配比，進(jìn)行二次環(huán)境腐敗細(xì)菌挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)，研究防腐體系與牙膏基質(zhì)配方的協(xié)同作用。調(diào)整后的配比如下，見表6。

表6 二次挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)配比 單位：%

編號山梨醇苯甲醇丙酯鈉丁酯鈉11#300.5--12#300.50.10.113#320.5--14#320.50.10.115#450.5--

對環(huán)境腐敗細(xì)菌的二次挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 環(huán)境腐敗細(xì)菌的二次挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表7可知：①樣品14#在第7天環(huán)境腐敗菌從初始值降至100cfu/g以下，且保持穩(wěn)定，能優(yōu)良通過環(huán)境腐敗細(xì)菌挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)。②樣品12#在第7天環(huán)境腐敗菌從初始值降至1000cfu/g以下，且保持穩(wěn)定，能通過環(huán)境腐敗細(xì)菌挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)。③單獨(dú)使用苯甲醇作為防腐體系時(樣品11#、樣品13#、樣品15#)，不能在第7天將環(huán)境腐敗菌從初始值降至1000cfu/g以下，提升效果不理想。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選擇了苯甲醇作為主要防腐劑進(jìn)行單方和復(fù)方防腐體系的篩選。通過采用LB肉湯抑菌實(shí)驗(yàn)及微生物挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)，分析驗(yàn)證苯甲醇的防腐效果。另外，考慮牙膏中的山梨醇等原料自身的抑菌作用和促進(jìn)防腐效果，以及苯甲醇在牙膏中的口感，故在進(jìn)行微生物挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)時，針對性的選擇一定添加量的苯甲醇配比進(jìn)行防腐效果比較。研究表明：①單獨(dú)使用苯甲醇作為防腐體系時，隨著苯甲醇含量的增加，防腐效果成正比；隨著山梨醇含量的增加，防腐效果提高不明顯。②苯甲醇與尼泊金丙酯鈉、尼泊金丁酯鈉復(fù)配作為防腐體系時，隨著山梨醇含量的增加，防腐效果成正比。③32%山梨醇+0.5%苯甲醇+0.1%尼泊金丙酯鈉+0.1%尼泊金丁酯鈉防腐體系最好。

說明，在建立苯甲醇系列的牙膏防腐體系時，除了要考慮防腐劑的用量外，同時還要考慮牙膏基質(zhì)等因素，使得樣品有條件地通過挑戰(zhàn)試驗(yàn)，使防腐體系對微生物有特強(qiáng)的抑殺作用；保證產(chǎn)品在生產(chǎn)、貯藏和使用時不容易被微生物污染，建立成本可控，更經(jīng)濟(jì)、更有效的防腐體系，保證產(chǎn)品品質(zhì)。