裴芳藝，馬巖石，陳雪

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 科研處，黑龍江 齊齊哈爾，161000)

微生物胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)是細(xì)菌、真菌等生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞外的高分子量生物聚合物[1-2]，可通過(guò)有機(jī)溶劑沉淀、超濾、噴霧干燥及冷凍干燥等方法獲得[3]，具有價(jià)格便宜、提取工藝簡(jiǎn)單和安全性高的優(yōu)點(diǎn)[4-5]。微生物EPS具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗氧化、降低膽固醇等作用[6]，可應(yīng)用于醫(yī)療、制藥、乳品和化妝品等領(lǐng)域，受到人們廣泛關(guān)注[7]。DI等[8]發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)SB27 EPS具有顯著的體外抗腫瘤活性，當(dāng)0.6 g/L EPS作用HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞72 h時(shí)，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞抑制率為(77.19±3.56)%。馬文錦等[9]的研究顯示，膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)CICC 33013 EPS具有抗氧化活性功能，當(dāng)EPS質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、還原力分別為49.1%、51.2%、0.352。

葡糖桿菌屬(Gluconobactersp.)屬于醋酸菌科(Acetobacteraceae)[10]，包括白葡糖桿菌(G.albidus)、蠟狀葡糖桿菌(G.cerinus)、啤酒葡糖桿菌(G.cerevisiae)、弗氏葡糖桿菌(G.frateurii)、日本葡糖桿菌(G.japonicuss)、北碧葡糖桿菌(G.kanchanaburiensis)、近藤葡糖桿菌(G.kondonii)等[11-12]。Gluconobactersp.廣泛存在于環(huán)境中，對(duì)人和動(dòng)物安全無(wú)致病性[13]，主要應(yīng)用于生化產(chǎn)品開(kāi)發(fā)、酶學(xué)性質(zhì)研究和快速檢測(cè)3個(gè)方面[14]。郭丹釗等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Gluconobactersp. JS-1所產(chǎn)的EPS由P1(阿拉伯糖、木糖、半乳糖)、P2(鼠李糖、甘露糖)構(gòu)成，具有顯著的抗氧化活性。JAKOB等[16]發(fā)現(xiàn)，G.frateuriiTMW 2.767、G.cerinusDSM 9533、清邁新朝井桿菌(Neoasaiachiangmaiensis)NBRC 101099和巴厘島公崎桿菌(Kozakiabaliensis)DSM 14400的EPS產(chǎn)量較高，當(dāng)培養(yǎng)基中加入80 g/L蔗糖時(shí)，EPS產(chǎn)量為6～12 g/L，經(jīng)高效液相分析，分離得到的多糖以葡聚糖為主。HERMANN等[17]的研究顯示菌株K.baliensisDSM 14 400和N.chiangmaiensisNBRC 101099以小麥、全麥等為基質(zhì)的面團(tuán)中發(fā)酵48 h，均可產(chǎn)生EPS，且EPS產(chǎn)量與起始蔗糖含量成正相關(guān)，最高可產(chǎn)生0.049 kg/kg EPS。

本試驗(yàn)以自然發(fā)酵的草莓汁為試驗(yàn)材料，利用MRS-S產(chǎn)糖培養(yǎng)基篩選出高產(chǎn)EPS的菌株，通過(guò)顯微形態(tài)觀察、菌落形態(tài)觀察、生理生化鑒定以及16S rDNA技術(shù)對(duì)所獲得菌種進(jìn)行鑒定，并利用Neighbor-Joining法和Maximum-Parsimony法建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定菌株同源性和種屬水平。本研究不僅為EPS的生產(chǎn)提供菌種來(lái)源，也為今后利用Gluconobactersp.大規(guī)模生產(chǎn)EPS提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

草莓：采摘自齊齊哈爾市周邊某草莓采摘園。

供試菌株：CGMCC 1.565氧化葡糖桿菌(G.oxydans)，購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，用于生理生化檢定的模式菌株。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

葡萄糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、蜜二糖、纖維二糖、松三糖、核糖、棉子糖、鼠李糖、水楊苷、甘油、肌醇、木糖醇、甘露醇、山梨醇、七葉苷、馬尿酸、硝酸鹽、亞硝酸鹽、賴氨酸脫羧酶、尿素酶，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；海藻糖、菊糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、赤蘚糖醇、核糖醇、3%過(guò)氧化氫酶、淀粉、明膠、乙酰甲基甲醇(V-P)試劑、硫化氫、L-精氨酸，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；牛肉浸粉、酵母提取物、蛋白胨、瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、蔗糖、CH3COONa、K2HPO4、MnSO4、MgSO4·7H2O、檸檬酸銨、吐溫(均為分析純)，天津市江天化工技術(shù)有限公司。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)、Agarose LE瓊脂糖(RT101)、50×TAE Buffer(RT204)、GeneRed核酸染料(RT211)6×DNA電泳Loading(BufferRT201-01)、DL 15 000 DNA Marker(MD110-01)、DL 2 000 DNA Marker(MD114-01)、2×Taq PCR Mastermix(KT201-02)，天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，牛肉浸粉10，酵母提取物5，蛋白胨10，CH3COONa 5，K2HPO42，MnSO40.25，MgSO4·7H2O 0.58，檸檬酸銨2，吐溫1，121 ℃滅菌15 min，用于菌株培養(yǎng)。

MRS-S產(chǎn)糖培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基中加入100 g/L的蔗糖，用于產(chǎn)糖菌株的篩選。

MRS和MRS-S產(chǎn)糖固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基內(nèi)加入2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂粉。

1.1.4 儀器與設(shè)備

DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱、HZQ-211C落地振蕩器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CX31光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯公司；FE28pH計(jì)、AL204電子天平，梅特勒-托利多集團(tuán)；V-5000可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；22331Hamburg高速離心機(jī)、5804R臺(tái)式高速大容量冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司；C1000-touch PCR儀、ChemiDoc MP全自動(dòng)熒光和化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)糖菌株的初步分離篩選

將采摘的草莓搗碎，稱量25.0 g放入225 mL無(wú)菌水內(nèi)振蕩混勻，30 ℃培養(yǎng)24 h，梯度稀釋至10-7，每個(gè)梯度分別取0.1 mL涂布于MRS和MRS-S產(chǎn)糖固體培養(yǎng)基上，分別做2個(gè)平行樣，30 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落，反復(fù)純化3次，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 形態(tài)特征觀察[18-20]

將菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 120 r/min培養(yǎng)24 h，觀察該菌種生長(zhǎng)情況。將活化后的菌株采用三區(qū)劃線的方法，分別接種到MRS和MRS-S產(chǎn)糖平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落的大小、顏色、表面形態(tài)、黏稠度、質(zhì)地、邊緣等特征。

取少量發(fā)酵液滴在載玻片上，均勻涂布，經(jīng)革蘭氏染色后顯微鏡下觀察菌株形態(tài)。

1.2.3 高產(chǎn)EPS菌株的篩選

通過(guò)苯酚-硫酸法測(cè)定菌株發(fā)酵液中EPS的含量[21]，篩選產(chǎn)EPS量較高的菌株。取發(fā)酵液1.5 mL，離心，上清用去離子水適當(dāng)稀釋，取1 mL稀釋液與1 mL體積分?jǐn)?shù)為6%的苯酚溶液和5 mL濃H2SO4溶液混勻，靜置冷卻至室溫，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌株發(fā)酵產(chǎn)EPS的含量，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制參照李晶晶的方法[22]。

1.2.4 生理生化特征鑒定[18-20]

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，制備菌懸液，接種生化試劑管，30 ℃培養(yǎng)24 h后觀察。碳源主要包括葡萄糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、蜜二糖、纖維二糖、松三糖、核糖、棉子糖、鼠李糖、海藻糖、菊糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、水楊苷、甘油、肌醇、木糖醇、甘露醇、山梨醇、赤蘚糖醇、核糖醇、七葉苷、馬尿酸、淀粉。氮源主要包括硝酸鹽，亞硝酸鹽和賴氨酸脫羧酶、L-精氨酸。其他生化試驗(yàn)主要包括3%過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇(V-P)試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)。

1.2.5 16S rDNA序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

細(xì)菌基因組DNA提?。喝』罨姆N子液1.5 mL，10 000 r/min離心1 min，收集沉淀。按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取基因組DNA。以27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；1 492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′為引物進(jìn)行16S rDNA部分序列擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為25 μL 2×Taq PCR Mastermix；2 μL 模板DNA；1 μL 27F引物；1 μL 1 492 R引物；21 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠驗(yàn)證后，送上海生工生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果上傳NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得GeneBank登錄號(hào)。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中利用BLAST進(jìn)行序列比對(duì)，選擇相似度高的菌株，利用MEGA 5.0中Neighbor-Joining法[23]和Maximum-Parsimony法建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定菌株同源性和種屬水平。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建使用MEGA 5.0，繪圖使用Excel 2016，統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)菌株的篩選[24]

通過(guò)苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=9.855x+0.009，R2=0.999。

通過(guò)觀察菌株在MRS-S平板上菌落形態(tài)，發(fā)現(xiàn)11株菌表面呈現(xiàn)黏稠狀，利用苯酚-硫酸法測(cè)定11株菌的EPS含量，發(fā)現(xiàn)其EPS產(chǎn)量分別為(9.13±0.61)g/L(PFY-T2)、(7.31±0.73)g/L(PFY-T3)、(4.53±0.31)g/L(PFY-T6)、(16.71±0.51)g/L(PFY-T8)、(19.41±0.71)g/L(PFY-1)、(17.11±0.82)g/L(PFY-3)、(18.26±0.73)g/L(PFY-4)、(22.93±0.61)g/L(PFY-7)、(23.81±0.51)g/L(PFY-8)、(15.83±0.54)g/L(PFY-P1)、(15.29±0.96)g/L(PFY-P6)。其中菌株P(guān)FY-7、PFY-8的產(chǎn)糖能力相對(duì)較高，因此，對(duì)這2菌株進(jìn)行下一步鑒定。

2.2 菌株形態(tài)觀察

菌株P(guān)FY-7、PFY-8在MRS和MRS-S產(chǎn)糖固體培養(yǎng)基上形態(tài)如圖1所示。在MRS平板上菌落較小，大小在3 mm左右，灰白色，隆起，邊緣整齊，表面光滑。在MRS-S產(chǎn)糖固體培養(yǎng)基上，菌落較大，有黏稠的液體覆蓋其上，挑起具有黏性。革蘭氏染色結(jié)果如圖2所示，菌體呈紅色、短桿狀排列，為革蘭氏陰性菌。

a-菌株P(guān)FY-7(MRS平板);b-菌株P(guān)FY-7(MRS-S平板)； c-菌株P(guān)FY-8(MRS平板);d-菌株P(guān)FY-8(MRS-S平板)
圖1 菌株P(guān)FY-7、PFY-8在MRS、MRS-S平板上的菌落形態(tài)
Fig.1 Colony morphology of strain PFY-7 and PFY-8 on MRS and MRS-S agar plate

a-菌株P(guān)FY-7；b-菌株P(guān)FY-7局部;c-菌株P(guān)FY-8； d-菌株P(guān)FY-8局部
圖2 菌株P(guān)FY-7、PFY-8顯微形態(tài)觀察(1 600×)
Fig.2 The microscopic morphology of strain PFY-7 and strain PFY-8

2.3 生理生化鑒定

參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]、《乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[19]、《伯杰細(xì)菌手冊(cè)》[20]，對(duì)菌株P(guān)FY-7、PFY-8的部分生理生化特性進(jìn)行研究，結(jié)果如表2所示。菌株P(guān)FY-7和PFY-8在肌醇、甘露醇的利用上存在明顯差異，2株菌在種上可能存在差異，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。2株菌的過(guò)氧化氫酶(接觸酶)試驗(yàn)為強(qiáng)陽(yáng)性，說(shuō)明可以催化過(guò)氧化氫分解成水和氧氣。葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)可以看出菌株為同型發(fā)酵。同化碳源試驗(yàn)可以判斷菌株對(duì)不同碳源的利用情況，結(jié)果為陽(yáng)性的說(shuō)明對(duì)該碳源利用較好，結(jié)果為陰性說(shuō)明不可以利用該碳源做為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果為弱陽(yáng)性說(shuō)明利用該碳源為唯一碳源發(fā)酵時(shí)菌株生長(zhǎng)受到抑制。七葉苷水解為陽(yáng)性，說(shuō)明菌株可以水解七葉苷，生成七葉亭，與檸檬酸鐵作用，生成黑色化合物。明膠液化試驗(yàn)為陰性說(shuō)明菌株不可以產(chǎn)生明膠蛋白酶。V-P試驗(yàn)陰性說(shuō)明菌株不能利用葡萄糖生成乙酰甲基甲醇。硫化氫產(chǎn)氣試驗(yàn)為陰性，說(shuō)明菌株不能分解有機(jī)硫化物。精氨酸水解試驗(yàn)為陰性，說(shuō)明菌株不能產(chǎn)生細(xì)菌水解酶，不能釋放出堿性物質(zhì)，而是分解葡萄糖產(chǎn)酸。尿素酶試驗(yàn)為陰性，說(shuō)明菌株不能分解尿素生成氨。PFY-7、PFY-8的生理生化特征與模式菌株Gluconobactersp.的生理生化性質(zhì)基本一致[18]。因此，初步判斷這2株菌屬于Gluconobactersp.。

表2 菌株P(guān)FY-7和PFY-8的部分生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical results of the strain PFY-7 and strain PFY-8

注：“+”代表代謝反應(yīng)陽(yáng)性，“-”代表代謝反應(yīng)陰性，“w”代表代謝反應(yīng)弱陽(yáng)性

2.4 16S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

分別提取菌株P(guān)FY-7、PFY-8的基因組DNA，PCR反應(yīng)擴(kuò)增菌株的16S rDNA序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在1 500 bp處獲得清晰條帶，結(jié)果如圖3所示。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)FY-7與G.kondoniiHD385(GeneBank登錄號(hào)：KJ130330)的相似度為99.78%，菌株P(guān)FY-8與G.frateuriiSL13-7(GeneBank登錄號(hào)：AB819118)的相似度為99.78%。結(jié)果上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得GeneBank登錄號(hào)分別為MN960193和MN960194。

DL 2000 DNA Marker由DNA片段2 000、1 000、750、500、 250以及100 bp組成，共6條帶；泳道1為菌株P(guān)FY-7 的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道2為菌株P(guān)FY-8的擴(kuò)增產(chǎn)物
圖3 菌株P(guān)FY-7和PFY-8的16S rDNA PCR 擴(kuò)增結(jié)果
Fig.3 Electrophoregram of 16S rDNA amplification products of strain PFY-7 and strain PFY-8

由于單一的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)不足以準(zhǔn)確鑒定菌株種屬[24]，因此本試驗(yàn)分別采用Neighbor- Joining和Maximum-Parsimony法共同構(gòu)建菌株的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，參數(shù)BootstrapReplications設(shè)置為1 000，移除序列中的模糊位點(diǎn)，將菌株P(guān)FY-7與20株菌的核酸序列進(jìn)行比對(duì)，按比例繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖4所示?？芍狿FY-7菌株與G.kondoniiHD385的親緣關(guān)系在2種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中分別為63和70，結(jié)果比較接近，再結(jié)合NCBI基因序列比對(duì)結(jié)果和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，可以準(zhǔn)確判斷PFY-7菌株為G.kondonii，命名為G.kondoniiPFY-7。將菌株P(guān)FY-8與13株菌的核酸序列進(jìn)行比對(duì)，按比例繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖5所示。菌株在核糖醇中的生長(zhǎng)情況可以作為鑒別葡糖桿菌種間鑒定的特征[18]，其中能利用核糖醇的菌株可以初步判斷為G.frateurii，這與在NCBI上比對(duì)的結(jié)果相一致，同時(shí)，結(jié)合16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建的結(jié)果，即菌株P(guān)FY-8與菌株G.frateuriiSL13-7的親緣關(guān)系在2種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中均為62，結(jié)果一致，可以準(zhǔn)確判斷PFY-8菌株為G.frateurii，命名為G.frateuriiPFY-8。

a-Neighbor- Joining法;b-Maximum-Parsimony法
圖4 Neighbor- Joining和Maximum-Parsimony 法構(gòu)建菌株P(guān)FY-7的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
Fig.4 Phylogenetic tree of strain PFY-7 16S rDNA base on using Neighbor- Joining method and Maximum-Parsimony method

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從草莓發(fā)酵液中分離得到2株高產(chǎn)EPS的葡糖桿菌，其胞外多糖的含量分別為(22.93±0.61) g/L、(23.81±0.51) g/L。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)鑒定這2株菌為G.kondonii、G.frateurii。分別命出為G.kondoniiPFY-7和G.frateuriiPFY-8。因此，本試驗(yàn)不僅為EPS的生產(chǎn)提供了菌種來(lái)源，也為今后利用葡糖桿菌大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)EPS提供了理論基礎(chǔ)。

a-Neighbor- Joining法;b-Maximum-Parsimony法
圖5 Neighbor- Joining和Maximum-Parsimony 法構(gòu)建菌株P(guān)FY-8的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
Fig.5 Phylogenetic tree of strain PFY-8 16S rDNA base on using Neighbor- Joining method and Maximum-Parsimony method