劉錦，張洪翠，程圣，何欣遙，張敏

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，西南大學(xué)食品貯藏與物流研究中心，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室 (重慶)，重慶，400715)

每年全球生產(chǎn)超過(guò)1.05億t甘薯，中國(guó)是甘薯主要的生產(chǎn)大國(guó)[1]。甘薯的主要采后病害是軟腐病。軟腐病病原體匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)廣泛分布在空氣和土壤中，甘薯被其侵染后，由于快速發(fā)展的水漬病斑，塊根很快就會(huì)完全腐爛，整個(gè)腐爛過(guò)程可以在幾天內(nèi)完成。目前學(xué)術(shù)界對(duì)甘薯軟腐病的抑制研究多針對(duì)低溫貯藏而非常溫物流過(guò)程。常溫物流的溫濕度條件非常適宜匍枝根霉的生長(zhǎng)繁殖，且物流環(huán)境空氣中存在的匍枝根霉也極易浸染甘薯，而我國(guó)由于缺乏控溫及密閉運(yùn)輸工具，導(dǎo)致軟腐病的物流發(fā)病情況也比較嚴(yán)重，農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)上經(jīng)常出現(xiàn)甘薯腐爛的情況。

生姜作為天然香料已有2 000年的歷史[2]，其塊莖提取物中含有多酚化合物(6-姜酚及其衍生物)、揮發(fā)性精油、二苯基庚烷等，具有很高的抗氧化活性，抑菌功能強(qiáng)[3]。生姜提取物不僅對(duì)各種真菌病原體有抑制活性，如鐮刀菌(Fusariumudum)[4]、畫眉草彎孢菌(Curvulariaeragrostidis)和可可球二孢菌(Botryodiplodiatheobromae)[5]等，而且還能誘導(dǎo)增強(qiáng)果蔬免疫能力。目前有關(guān)生姜提取液用于抑制常溫物流下甘薯軟腐病的效果和機(jī)理還未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)使用體積分?jǐn)?shù)為0%、25%、50%、100%生姜提取液對(duì)軟腐病致病菌匍枝根霉同時(shí)進(jìn)行體外和甘薯活體實(shí)驗(yàn)，從活體和體外2個(gè)角度探究不同濃度生姜提取液處理對(duì)甘薯軟腐病的影響，并探討其作用機(jī)制，為生姜提取液在抑制甘薯軟腐病的實(shí)際應(yīng)用中提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從重慶市北碚天生農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)得同批采收的新鮮甘薯，品種為“紅心王”；新鮮生姜，表面完好無(wú)損，無(wú)發(fā)芽，購(gòu)于重慶市北碚區(qū)永輝超市；匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供；塑料筐，外尺寸為388 mm×305 mm×111 mm，內(nèi)尺寸為355 mm×275 mm×104 mm；PE塑料袋，尺寸為50 cm×60 cm，厚度為28 μm。

80%甘油(體積分?jǐn)?shù))、硼酸、Na2B4O7·5H2O、L-苯丙氨酸、EDTA、30%H2O2(體積分?jǐn)?shù))、鄰苯二酚、L-苯丙氨酸、Na2HPO4·2H2O、NaH2PO4·H2O、二硫蘇糖醇、蛋氨酸、乙二胺四乙酸二鈉、磷酸鉀、冰乙酸、無(wú)水乙酸鈉，成都市科龍化工試劑廠；聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇6000、TritonX-100、愈創(chuàng)木酚、重慶北碚化學(xué)試劑廠；β-巰基乙醇，AMRESCO公司；氯化硝基四氮唑藍(lán)，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用試劑，所有試劑等級(jí)為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS氣候箱，寧波東南儀器；H1650R離心機(jī)，湖南湘儀；UV-2450PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津；BXM-30R高壓蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)；KQ3200DB超聲波清洗器，昆山市超聲儀器；VD-850潔凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備。

1.3 樣品處理

1.3.1 孢子懸浮液的制備

將Rhizopusstolonifer接種至PDA平板培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，待病原菌長(zhǎng)出孢子，再用無(wú)菌水清洗菌絲，通過(guò)8層紗布過(guò)濾，濾液即是孢子懸浮液。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，得到1×106CFU/mL的孢子懸浮液備用。

1.3.2 生姜提取液的制備

取生姜100 g，洗凈、切碎后研磨成勻漿，加入1 000 mL無(wú)菌蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，?0 ℃下150 W、40 kHz超聲波提取40 min，用已滅菌的雙層紗布過(guò)濾，即得生姜提取液原液[6]，置于4 ℃冰箱儲(chǔ)藏備用。

1.3.3 匍枝根霉體外實(shí)驗(yàn)

用無(wú)菌水將生姜提取液原液按比例稀釋為體積分?jǐn)?shù)25%、50%、100%的生姜提取液并配置相應(yīng)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)，以不加入生姜提取液PDA培養(yǎng)基為對(duì)照處理(CK)，121 ℃滅菌20 min，待PDA培養(yǎng)基冷卻至45 ℃左右倒平板備用。

1.3.4 匍枝根霉甘薯活體實(shí)驗(yàn)

挑選大小一致，無(wú)發(fā)芽，破皮少，兩端完整的甘薯，先用清水洗凈再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的酒精擦拭表面，晾干后備用。將甘薯隨機(jī)分成4組，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。采用體積分?jǐn)?shù)0%(CK)、25%、50%、100%的生姜提取液浸泡甘薯5 min，處理結(jié)束后于室溫下自然晾干。然后，用直徑3 mm的無(wú)菌打孔器在果實(shí)赤道部位等距離打3個(gè)孔(深3 mm)。4 h后，再分別向每個(gè)孔中加入20 μL匍枝根霉孢子懸浮液(1×106CFU/mL)。待菌液全部吸收后，將甘薯裝入塑料筐中，筐外套上PE塑料袋，模擬常溫物流環(huán)境，置于25 ℃、相對(duì)濕度(relative humidity，RH)85%～95%的環(huán)境中貯藏，每2 d測(cè)定1次指標(biāo)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)

1.4.1 匍枝根霉體外實(shí)驗(yàn)指標(biāo)

1.4.1.1 匍枝根菌絲菌落直徑

取1 μL匍枝根霉孢子懸浮液(1×106CFU/mL)點(diǎn)在配置好的體積分?jǐn)?shù)為25%、50%、100%的生姜提取液PDA平板中，以不含生姜提取液的PDA平板作為對(duì)照(CK)，待菌液全部吸收后密封平板，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，采用十字交叉法每隔24 h測(cè)定1次菌落直徑，每組3個(gè)平板。

1.4.1.2 匍枝根霉孢子萌發(fā)率和芽管長(zhǎng)度

采用凹玻片懸滴法[7]觀察生姜提取液對(duì)匍枝根霉孢子萌發(fā)及芽管生長(zhǎng)的影響。將體積分?jǐn)?shù)為25%、50%、100%的生姜提取液分別與1×106CFU/mL孢子懸浮液等體積混勻，以無(wú)菌水和1×106CFU/mL孢子懸浮液等體積混勻?yàn)閷?duì)照組(CK)。各處理組取40 μL滴加在凹玻片上，置于培養(yǎng)皿中于28 ℃下恒溫保濕培養(yǎng)，在顯微鏡40倍物鏡下每24 h觀察孢子萌發(fā)情況，計(jì)算孢子萌發(fā)率，并進(jìn)行顯微拍照，同時(shí)記錄芽管長(zhǎng)度，單位為μm。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。孢子萌發(fā)率參照徐大勇等[8]的方法計(jì)算。

1.4.2 匍枝根霉甘薯活體實(shí)驗(yàn)(樣品取果肉病斑處2 cm內(nèi)健康組織樣品測(cè)定)

1.4.2.1 多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活性

參考DONG等[9]的方法，并稍作修改。稱取1.0 g甘薯鮮樣，加入5.0 mL提取緩沖液，在冰浴條件下將其研磨成勻漿，于4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液即為酶提取液。試管中加入4.0 mL 0.05 mol/L、pH 5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液和1.0 mL 0.05 mmol/L鄰苯二酚溶液，最后加入100 μL酶提取液。記錄在410 nm處的吸光度值變化，測(cè)定3 min，重復(fù)3次。1個(gè)PPO酶活性單位定義為引起1 min吸光度變化0.01的量，用U表示。

1.4.2.2 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性

參考OBERLEY[10]的方法，并稍作修改。稱取1.0 g甘薯鮮樣，加入5.0 mL提取緩沖液，冰浴研磨成漿，于4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液用于SOD活性測(cè)定。采用氮藍(lán)四唑還原法測(cè)定SOD的活性，并將在560 nm處的1 min的反應(yīng)體系產(chǎn)生氯化硝基四氮唑藍(lán)(nitroblue tetrazolium，NBT)還原抑制為50%定義為1個(gè)SOD酶活單位(U)。

1.4.2.3 過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)活性

參考DONG等[9]方法，并稍作修改。稱取1.0 g甘薯鮮樣，置于預(yù)冷的研缽中，加入5.0 mL提取緩沖液，在冰浴條件下將其研磨成勻漿，于4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液即為酶提取液。往試管中加入3.0 mL 0.025 mol/L愈創(chuàng)木酚溶液和500 μL酶提取液，再加入200 μL 0.5 mol/L H2O2溶液，迅速混合反應(yīng)。記錄在470 nm處的吸光度值變化，測(cè)定3 min，重復(fù)3次。1個(gè)POD酶活性單位定義為引起1 min 吸光度變化0.01的量，用U表示。

1.4.2.4 過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活性

參考曹健康等[11]的方法，并略作修改。稱取1.0 g甘薯鮮樣，加入5.0 mL提取緩沖液，冰浴研磨成漿，于4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液用于CAT活性測(cè)定。往試管中加入100 μL酶液和2.9 mL 0.02 mol/L H2O2，以蒸餾水作參比，測(cè)定反應(yīng)液在240 nm處的吸光度值。1個(gè)酶活性單位定義為1 g樣品在240 nm波長(zhǎng)處引起1 min吸光度變化0.01的量，用U表示。

1.4.2.5 抗環(huán)血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)活性

參考NAKANO等[12]的方法，并略作修改。稱取3.0 g甘薯鮮樣，加入5.0 mL提取緩沖液，冰浴研磨成漿，于4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液用于APX活性測(cè)定。往試管中加入100 μL酶液和2.6 mL反應(yīng)緩沖液，最后加入300 μL 2 mmol/L H2O2溶液?jiǎn)?dòng)酶促反應(yīng)。測(cè)定290 nm處的吸光度值，以1 g樣品APX酶促反應(yīng)體系在波長(zhǎng)290 nm處吸光度值降低0.01為一個(gè)酶活性單位，單位用U表示。

1.4.2.6 苯丙氨酸解氨酶(phenylalamine ammonia-lyase，PAL)活性

參照LISTER等[13]的方法并略有改進(jìn)。稱取1.0 g甘薯鮮樣，置于預(yù)冷的研缽中，加入5.0 mL提取緩沖液，在冰浴條件下將其研磨成勻漿，于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液即為酶提取液，用于PAL活性測(cè)定。往試管中加入1 mL酶提取液和1 mL 0.02 mol/L的L-苯丙氨酸溶液，對(duì)照管不加底物，再加1 mL蒸餾水，置于37 ℃水浴保溫60 min后，加入0.1 mL 6 mol/L HCl溶液以終止反應(yīng)。再次12 000 r/min離心10 min去除變性蛋白，于290 nm處測(cè)定吸光度。以1 g甘薯樣品組織1 h在290 nm處吸光度變化0.01為1個(gè)酶活單位，用U表示。

1.4.2.7 總酚含量

參照Z(yǔ)HOU等[14]方法，略有改動(dòng)。取1.0 g甘薯鮮樣，加入5 mL預(yù)冷的1%(體積分?jǐn)?shù))HCl-甲醇溶液，在研缽中冰浴研磨成勻漿，再于4 ℃、12 000 r/min條件下離心15 min，收集上清液待用。以1%HCl-甲醇溶液作為空白參比進(jìn)行調(diào)零，于波長(zhǎng)280 nm處測(cè)定溶液的吸光度值，重復(fù)3次。

1.4.2.8 類黃酮含量

參考ZHOU等[14]方法，稍有改動(dòng)。稱取1.0 g甘薯鮮樣，加入5 mL預(yù)冷的1%HCl-甲醇溶液，在研缽中冰浴研磨成勻漿，再于4 ℃、12 000 r/min條件下離心15 min，收集上清液待用。以1%HCl-甲醇溶液作為空白參比進(jìn)行調(diào)零，于325 nm處測(cè)定溶液的吸光度值，重復(fù)3次。

1.4.2.9 甘薯軟腐病發(fā)病率

同一時(shí)間每組中已發(fā)病甘薯數(shù)量與每組甘薯總數(shù)的百分比即為該組甘薯該時(shí)間軟腐病發(fā)病率，每組3個(gè)平行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，以SPSS 18采用單因素方差分析法進(jìn)行顯著性分析[15]，顯著水平為0.05，極顯著水平0.01。采用Origin 8.6制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 匍枝根霉體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 不同濃度生姜提取液對(duì)匍枝根霉菌絲菌落直徑的影響

由圖1-a可知，所有處理組匍枝根霉菌落直徑的擴(kuò)展均受到抑制，且隨著濃度的增長(zhǎng)抑制作用更好。處理組菌落直徑顯著小于CK組(P<0.05)。其中，100%組在前24 h并未生長(zhǎng)。第72 h，各組菌落生長(zhǎng)情況如圖1-b所示，處理組菌落直徑顯著小于CK組(P<0.05)。第120 h，CK組匍枝根霉已幾乎長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿，此時(shí)25%、50%、100%(體積分?jǐn)?shù))處理組菌落直徑分別為5.82、4.20、3.36 cm，顯著小于CK組(P<0.05)。綜上所述，100%生姜處理組對(duì)匍枝根霉的生長(zhǎng)具有較好的抑制效果。

a-不同濃度生姜提取液對(duì)匍枝根霉菌落直徑的影響;b-不同濃度 生姜提取液PDA平板培養(yǎng)匍枝根霉(72 h)
圖1 不同濃度生姜提取液對(duì)匍枝根霉菌落生長(zhǎng)的影響
Fig.1 Effects of different concentrations of ginger extract on the diameter ofR.stolonifercolonies

2.1.2 不同濃度生姜提取液對(duì)匍枝根菌絲孢子萌發(fā)率的影響

匍枝根霉屬于霉菌的一種，孢子是其重要的繁殖方式[16]，抑制了孢子的萌發(fā)意味著抑制了匍枝根霉的繁衍。如圖2所示，各組孢子萌發(fā)率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，第24 h CK組孢子快速萌發(fā)，而處理組萌發(fā)率顯著低于CK組(P<0.05)，100%和50%(體積分?jǐn)?shù))組無(wú)顯著差異(P>0.05)。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，CK組的孢子萌發(fā)率顯著高于處理組(P<0.01)，且各處理組之間差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，100%組孢子萌發(fā)率最低。綜上，生姜提取液可抑制匍枝根霉屬孢子萌發(fā)，且100%的生姜提取液效果最好。

圖2 不同濃度生姜提取液對(duì)匍枝根霉孢子萌發(fā)率的影響
Fig.2 Effects of different concentrations of ginger extract on the germination rate ofR.stoloniferspores

2.1.3 不同濃度生姜提取液對(duì)匍枝根霉菌絲芽管長(zhǎng)度的影響

芽管是指無(wú)性孢子萌發(fā)時(shí)產(chǎn)生的管狀結(jié)構(gòu)，是菌絲體的雛形，抑制芽管長(zhǎng)度有利于抑制匍枝根霉的繁殖以及菌落的擴(kuò)大。由圖3-a可知，各組孢子芽管長(zhǎng)度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增長(zhǎng)。圖3-b為顯微鏡下培養(yǎng)24 h時(shí)各組孢子萌發(fā)的情況，可以看出50%和100%(體積分?jǐn)?shù))組孢子還未萌發(fā)，而CK組和25%組芽管已開始生長(zhǎng)。到48 h時(shí)，CK組芽管長(zhǎng)度已達(dá)到96.92 μm，且生長(zhǎng)速度較處理組快。第120 h時(shí)100%組芽管長(zhǎng)度僅為32.91 μm，比CK組低4.09倍，與CK組差異極顯著(P<0.01)。生姜處理組的芽管長(zhǎng)度在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中一直顯著低于CK組(P<0.05)。綜上，生姜提取液處理可以抑制R.stolonifer芽管的伸長(zhǎng)，其中100%體積分?jǐn)?shù)的抑制效果最好。

a-不同濃度生姜提取液對(duì)匍枝根霉芽管長(zhǎng)度的影響; b-24 h不同濃度生姜提取液匍枝根霉芽管生長(zhǎng)情況(比例尺50 μm)
圖3 不同濃度生姜提取液對(duì)匍枝根霉孢子芽管長(zhǎng)度的影響
Fig.3 Effects of different concentrations of ginger extract on the length ofR.stolonifermycelial tube

2.2 匍枝根霉甘薯活體實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 不同濃度生姜提取液處理對(duì)甘薯PPO活性的影響

在匍枝根霉侵入時(shí)，PPO酶不僅能催化多酚形成抗菌化合物醌類達(dá)到抗菌效果[17]，還能在果蔬細(xì)胞中誘導(dǎo)木質(zhì)素和木栓素的合成[18]；木質(zhì)素通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞壁，促進(jìn)水分運(yùn)輸和防止細(xì)胞壁多糖降解來(lái)防御病原體的侵染。由圖4可知，甘薯PPO活性總體呈上升趨勢(shì)。0～2 d，各組PPO活性均急速上升，也許是為了抵抗匍枝根霉侵染，也可能是因?yàn)榇蚩讜r(shí)甘薯表皮受到損害。各處理組PPO活性上升速度快于CK組。第4天時(shí)，100%組PPO活性極顯著高于50%組(P<0.01)，而這2個(gè)處理組的PPO活性又極顯著高于25%組和CK組(P<0.01)。在4～12 d，各組PPO活性都保持在較高水平，趨于穩(wěn)定。整個(gè)物流期間，25%組與CK組之間的差異都不太明顯，可能由于生姜提取液體積分?jǐn)?shù)較低，活性物質(zhì)在甘薯表皮附著少；而100%(體積分?jǐn)?shù))處理組與CK組之間一直保持著顯著差異(P<0.05)。物流結(jié)束時(shí)，CK、25%、50%、100%組PPO活性分別是最初的2.09、2.27、2.36、3.0倍?？偠灾?，生姜提取液處理能夠誘導(dǎo)甘薯PPO活性的升高。

圖4 不同濃度生姜提取液處理對(duì)甘薯PPO活性的影響
Fig.4 Effect of ginger extract treatment on PPO activity of sweet potato

2.2.2 不同濃度生姜提取液處理對(duì)甘薯SOD活性的影響

由圖5可知，各組甘薯SOD活性前期呈上升趨勢(shì)，后期保持穩(wěn)定。0～4 d，甘薯SOD活性升高急促，到第4天，CK、25%、50%、100%(體積分?jǐn)?shù))處理組SOD活性由最初的6.38 U/g增加至11.99、13.66、14.55、14.22 U/g，處理組顯著高于CK組(P<0.05)。第4天后，各組SOD活性保持穩(wěn)定。100%組和50%組SOD活性在8～12 d差異不大(P>0.05)，不過(guò)這2組SOD活性都顯著高于CK組和25%組(P<0.05)。

總體而言，生姜提取液可以加快甘薯SOD活性的提升，使甘薯更有力地抵抗匍枝根霉的侵染。

圖5 不同濃度生姜提取液處理對(duì)甘薯SOD活性的影響
Fig.5 Effect of ginger extract treatment on SOD activity of sweet potato

2.2.3 不同濃度生姜提取液處理對(duì)甘薯POD活性的影響

POD涉及多種代謝過(guò)程，主要包括生長(zhǎng)素分解代謝，逆境脅迫耐受性反應(yīng)，細(xì)胞壁蛋白的交聯(lián)，以及肉桂醇在木質(zhì)素和木栓質(zhì)形成聚合之前的氧化[20]。從細(xì)胞壁水平的單木質(zhì)醇聚合到涉及自由基生成的機(jī)制，木質(zhì)化形成過(guò)程的多個(gè)層次都有POD的參與。

如圖6所示，各組甘薯POD活性都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。0～6 d，各組POD活性大幅上升，可能是由于微生物侵染以及打孔時(shí)對(duì)甘薯表面造成了破壞，POD活性上升以形成木質(zhì)化防御結(jié)構(gòu)。各組在0～4 d 無(wú)顯著差異(P>0.05)，表明生姜提取液處理在物流前期對(duì)甘薯POD活性影響不大。各組POD活性在第6天到達(dá)峰值，100%組與50%組顯著高于25%組和CK組(P<0.05)。第6天后，POD活性開始下降，100%組和50%組的POD活性在6～12 d顯著高于CK組(P<0.05)。直到物流結(jié)束時(shí)，100%組還極顯著高于其他3組(P<0.01)。由此，可知，在物流后期生姜提取液處理能夠有效抑制甘薯POD活性的降低，其中100%組最佳。

圖6 不同濃度生姜提取液處理對(duì)甘薯POD活性的影響
Fig.6 Effect of ginger extract treatment on POD activity of sweet potato

2.2.4 不同濃度生姜提取液處理對(duì)甘薯CAT活性的影響

CAT和APX是負(fù)責(zé)在植物氧化脅迫期間清除H2O2的主要酶[21]，CAT通過(guò)將果蔬體內(nèi)的H2O2分解為水和分子氧來(lái)達(dá)到清除效果。如圖7所示，甘薯CAT活性不斷降低。第2天時(shí)， CK、25%、50%、100%(體積分?jǐn)?shù))處理組CAT活性較初始值分別下降了7.18%、15.30%、17.90%、23.42%。0～14 d，處理組CAT活性一直顯著低于CK組(P<0.05)，并且生姜提取液處理體積分?jǐn)?shù)越高，CAT活性越低；其中，100%組CAT活性最低，顯著低于其余3組(P<0.05)，而25%組與50%組差別不大。CAT活性的降低有利于H2O2的累積，JIN等[22]研究表明MeJA降低了桃果實(shí)的CAT活性，提高了桃果實(shí)中H2O2水平，并猜測(cè)H2O2的累積可能是果實(shí)抗病機(jī)制的一部分，能夠提高果實(shí)的抗病性。綜上可知，生姜提取液處理能夠降低甘薯CAT活性，且體積分?jǐn)?shù)越高，活性越低。

圖7 不同濃度生姜提取液處理對(duì)甘薯CAT活性的影響
Fig.7 Effect of ginger extract treatment on CAT activity of sweet potato

2.2.5 不同濃度生姜提取液處理對(duì)甘薯APX活性的影響

APX能催化抗壞血酸與H2O2發(fā)生氧化還原反應(yīng)，使H2O2被分解清除[23]。如圖8所示，甘薯APX活性波動(dòng)下降。CK組APX活性在0～2 d 就上升了29.88%，而3個(gè)處理組則有小幅下降，這可能是由于沒(méi)有經(jīng)過(guò)任何處理的甘薯在匍枝根霉侵染時(shí)，在甘薯細(xì)胞間隙產(chǎn)生的H2O2首先擴(kuò)散到胞質(zhì)溶膠中，其中細(xì)胞溶質(zhì)中的APX進(jìn)行定位，然后才進(jìn)入CAT范圍內(nèi)，并因?yàn)榧?xì)胞溶質(zhì)中的APX對(duì)H2O2的親和力高于CAT，間接誘導(dǎo)了APX活性的提升。0～6 d，處理組APX活性顯著低于CK組(P<0.05)。8～14 d，100%組顯著低于CK組和25%組(P<0.05)，50%組的APX活性除第10天外也顯著低于CK組(P<0.05)。由上可知，甘薯接種匍枝根霉后，生姜提取液處理能夠降低甘薯APX活性。KIM等[24]和LEE等[25]研究得出APX活性的降低有助于果蔬體內(nèi)H2O2的增加，H2O2能夠促進(jìn)細(xì)胞壁的木質(zhì)化，增強(qiáng)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，對(duì)病原菌侵染起到防御作用。

圖8 不同濃度生姜提取液處理對(duì)甘薯APX活性的影響
Fig.8 Effect of ginger extract treatment on APX activity in sweet potato

2.2.6 不同濃度生姜提取液處理對(duì)甘薯PAL活性的影響

PAL酶催化L-苯丙氨酸并同時(shí)生成酚類物質(zhì)[26]。有研究表明 PAL作為總酚、類黃酮等抗菌物質(zhì)的合成途徑，在匍枝根霉侵染時(shí)活性增強(qiáng)以保護(hù)甘薯免受病原菌的侵染[27]。由圖9可知，各組甘薯PAL活性先上升后下降。0～4 d，各組PAL活性持續(xù)增加，處理組增長(zhǎng)速度較CK組快，第4天時(shí)處理組PAL活性極顯著高于CK組(P<0.01)，表明生姜提取液處理能夠提升甘薯PAL活性。6 d 后，PAL活性開始降低，但是100%組仍保持較高水平，100%組和50%組極顯著高于CK組(P<0.01)。25%組與CK組在0～12 d 差異不顯著(P>0.05)，表明25%(體積分?jǐn)?shù))的生姜提取液處理對(duì)甘薯PAL活性影響不大。綜上，50%和100%(體積分?jǐn)?shù))生姜提取液處理能夠快速提升PAL活性，并延緩PAL活性的下降。這與生姜提取液在胡蘿卜的防腐研究中的結(jié)果相似[28]。CHANDRA等[29]研究得出PAL的反應(yīng)產(chǎn)物反式肉桂酸提供苯丙烷骨架，其用作木質(zhì)素生物合成的構(gòu)建亞單位，并表明PAL的激活是與果蔬抗病性相關(guān)的一般反應(yīng)。

圖9 不同濃度生姜提取液處理對(duì)甘薯PAL活性的影響
Fig.9 Effect of ginger extract treatment on PAL activity of sweet potato

2.2.7 不同濃度生姜提取液處理對(duì)甘薯總酚含量的影響

酚類物質(zhì)能夠抵御病原菌的侵害[30]。由圖10可知，各組甘薯總酚含量總體呈先上升后下降的趨勢(shì)。0～2 d，50%組和100%組總酚含量極顯著高于CK組和25%組(P<0.01)，這是因?yàn)樯崛∫褐泻写罅康姆宇惢衔颷30]，也有可能是在前2 d CK組和25%組的PAL活性受到抑制。4～6 d 各組總酚含量均上升，在第6天達(dá)到最大值，CK組、25%組、50%組和100%組分別從最初0.57 μg/g增加至1.39、1.45、1.49、1.62 μg/g，100%組顯著高于CK組(P<0.05)。6 d后，總酚含量開始下降，可能是因?yàn)榈?天后，各組PAL活性均迅速降低，而PPO酶活卻保持上升趨勢(shì)。8～14 d，100%組總酚含量最高，在10～14 d處理組顯著高于CK組(P<0.05)?？偠灾鄬?duì)于處理組而言，生姜提取液處理能夠保持甘薯較高的總酚含量以抵御病原菌的侵入。

圖10 不同濃度生姜提取液處理對(duì)甘薯總酚含量的影響
Fig.10 Effect of ginger extract treatment on total phenol content in sweet potato

2.2.8 不同濃度生姜提取液處理對(duì)甘薯類黃酮含量的影響

類黃酮是多酚化合物的亞組之一[32]，具有抗氧化能力以及抗菌活性。如圖11所示，各組類黃酮含量先上升后下降。0～2 d，各組類黃酮含量快速上升，且生姜提取液體積分?jǐn)?shù)越高，上升速度越快。2～6 d CK組、25%組和50%組類黃酮含量變化不大，100%組顯著上升，表明高濃度生姜提取液有益于類黃酮化合物的積累，原因可能是高濃度生姜提取液能在此期間顯著提高PAL活性。第6天時(shí)，3個(gè)處理組之間差異極顯著(P<0.01)。第6天過(guò)后，各組類黃酮含量開始下降。整個(gè)過(guò)程(除第12天)，100%組類黃酮含量均顯著高于其他3組(P<0.05)，50%組次之，25%組效果較差。結(jié)果表明，生姜提取液處理能夠快速提升甘薯類黃酮含量，且體積分?jǐn)?shù)越高，效果越好。

圖11 生姜提取液處理對(duì)甘薯類黃酮含量的影響
Fig.11 Effect of ginger extract treatment on flavonoids content in sweet potato

2.2.9 不同濃度生姜提取液處理對(duì)甘薯類軟腐病發(fā)病率的影響

由圖12可知，CK組在第2天開始發(fā)病，此時(shí)處理組均未發(fā)病。第4天，25%組、50%組開始發(fā)病，100%組未見(jiàn)發(fā)病，處理組發(fā)病率均顯著低于CK組(P<0.05)。100%組在第6天開始發(fā)病，發(fā)病率為3.33%，此時(shí)CK組發(fā)病率高達(dá)46.67%。第12天，CK組甘薯全部發(fā)病，25%組、50%組和100%組的發(fā)病率分別為60.00%、30.00%、13.33%，4個(gè)組之間存在極顯著差異(P<0.01)，表明生姜提取液能夠延緩甘薯軟腐病的發(fā)作，且延緩效果與生姜提取液的體積分?jǐn)?shù)成正比。

圖12 不同濃度生姜提取液對(duì)甘薯軟腐病發(fā)病率的影響
Fig.12 Effect of ginger extract on the incidence of sweet potato soft rot

3 結(jié)論

甘薯軟腐病是由真菌病原體匍枝根霉引起的，是影響甘薯常溫物流的重要病害之一。本文使用體積分?jǐn)?shù)為0%、25%、50%、100%生姜提取液對(duì)匍枝根霉進(jìn)行體外和甘薯活體實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明體外培養(yǎng)試驗(yàn)中生姜提取液處理對(duì)常溫時(shí)匍枝根霉的菌絲生長(zhǎng)、孢子的萌發(fā)以及孢子芽管的生長(zhǎng)均有抑制作用，且效果與體積分?jǐn)?shù)呈正比；活體實(shí)驗(yàn)中生姜提取液處理能夠提高常溫物流條件下甘薯SOD酶活同時(shí)抑制CAT、APX活性，有利于H2O2積累，阻止匍枝根霉的侵染，PPO、POD活性得到增強(qiáng)以促進(jìn)細(xì)胞形成木質(zhì)化屏障，較高的PAL活性則提高了總酚和類黃酮含量，從宏觀上看生姜提取液能有效降低常溫物流條件下甘薯軟腐病發(fā)病率且沒(méi)有異味殘留。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明生姜提取液不僅可以直接抑制匍枝根霉生長(zhǎng)，還能通過(guò)調(diào)節(jié)甘薯的生理變化抵御匍枝根霉侵染，且隨著生姜提取液體積分?jǐn)?shù)的提高，效果更佳。