宣偉軍，黃力毅，宣毅，唐俊波，韋瑀龍

(1. 廣西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院耳鼻咽喉科，南寧 530023； 2. Harvard Medical School，Harvard University，Boston，MA 02114，USA； 3. School of Engineering，Tufts University，Medford，MA 02155，USA； 4. 廣西中醫(yī)藥大學瑞康醫(yī)學院制藥廠，南寧 530011)

老年性聾(Presbycusi)又稱年齡相關(guān)性聽力損失(Age—related hearing loss，AHL)，隨著世界人口的老年化，其發(fā)病率逐年遞增[1]，其病因病機復雜，防治極其困難，是當前耳科學研究的重要熱門課題之一[2-4]。 前期研究表明，中藥復方健耳劑在普通光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)具有明顯對抗C57BL/6J 小鼠老年性耳蝸毛細胞、耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(spiral ganglion neurons，SGN)凋亡，以及保護聽功能的藥效作用[5-7]，但以往缺如小鼠老年性耳蝸神經(jīng)細胞形態(tài)學電鏡超微觀察以及中藥細胞靶向作用機制研究，因此，我們繼續(xù)選擇C57BL/6J 小鼠作為AHL模型，利用透射電鏡重點觀察老年性耳蝸外毛細胞(outer hair cell，OHC)、SGN 細胞核超微結(jié)構(gòu)改變，利用形態(tài)學多重免疫熒光技術(shù)，配合激光共聚焦顯微鏡重點觀察SGN 中神經(jīng)元特異性核抗原蛋白(neuron-specific nuclear antigen，NeuN)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)定位表達，以及中藥干預影響作用，以進一步揭示其對抗細胞凋亡以及靶向作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級1 月齡剛斷奶健康C57BL/6J 小鼠22只，雌雄各半，體重16 ～18 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)公司提供【SCXK(京)2012-0001】，清潔級別一級，飼養(yǎng)于本單位SPF 動物實驗室【SYXK(桂)2019-0001】，所有操作均符合廣西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理學要求(審批號：IACUC 20161015)。

1.1.2 藥物

復方健耳劑主要由葛根、丹參、黃芪、骨碎補等組成，由廣西中醫(yī)藥大學瑞康醫(yī)學院制藥廠制備。經(jīng)過水煮、濃縮、烘干、反復粉碎和過篩等流程，制成每克藥粉相當于6.63 g 生藥材。 按照《中藥藥理研究方法學》[8]小鼠與成人用量換算法，計算出該藥的小鼠用量定為1.83 g/(kg·d)。

1.1.3 試劑和儀器

VECTASHIELD HardSet Mouting Medium withDAPI(Vector，H-1500)，NeuN 一抗(Millipore，MAB377)，BDNF 一 抗(Thermofisher，OSB00017 W)，二抗Goat anti-Rabbit IgG (H+L)，Alexa Fluor Plus 488 (Invitrogen，PIA32731)、二抗Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody，Alexa Fluor Plus 555 ( Invitrogen，PIA32727 )，Vector LaboratoriesSupplier Diversity Partner H3300(Fishersci，NC9401067)，碳酸鈉緩沖液(Electron Microscopy Sciences，11652)，樣品組織自動處理器LYNX II Automated Tissue Processor ( Electron Microscopy Sciences，L12600)，甲苯胺藍染色劑(Electron Microscopy Sciences，14950)，tEpon-812 環(huán)氧樹脂(Tousimis，3131)，NMA-ultrapure(Tousimis，3143)，DDSA ( Dodecenyl Succinic Anhadrite )(Tousimis，3123)，DMP-30 (Dimethylaminomethyl)Phenol(Tousimis，3103)。 透射電鏡型(Philip CM10 TEM，荷蘭)，激光共聚焦顯微鏡(Olympus IX 81+Olympus Fluoview FV1000，日本)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥方法

將22 只動物隨機分為7 月齡老年性耳蝸退變對照組(7 月齡對照組)、7 月齡中藥干預組(7 月齡中藥組)各11 只。 7 月齡對照組只喂飼常規(guī)飼料和自來水，中藥組食用相同的常規(guī)飼料同時，飲用中藥溶液以代替日常飲水，具體是中藥粉加適量比例水配兌(一般為0.05 g 藥粉加5 mL 水)，盛于動物自吸喂養(yǎng)瓶內(nèi)供小鼠自動飲用，在沒有其它水源供應的實驗條件下，實驗動物因生理需要而必須每天攝取足夠的飲水，因而也就保證了實驗小鼠每天都能攝取到規(guī)定的藥物劑量，到4 月齡后改用人工灌服中藥溶液至期滿。 月齡期滿終止實驗，取耳蝸切片，進行OHC、SGN 細胞核超微結(jié)構(gòu)觀察，以及SGN中NeuN、BDNF 定位表達研究。

1.2.2 觀察指標及檢測方法

實驗動物期滿后，所有動物用20%烏拉坦全麻，剪開右心房，左心室灌注生理鹽水排出體內(nèi)血液，接著灌注10%福爾馬林磷酸鹽緩沖液，斷頭取耳蝸，在蝸尖鉆孔并摘除鐙骨同時打開園窗，將10%福爾馬林磷酸鹽緩沖液從蝸尖孔灌入耳蝸，然后浸入上述固定液固定24 h 以上，石蠟包埋備用。其中每組5 只動物耳蝸利用透射電鏡，觀察OHC 以及對應部位的SGN 超微結(jié)構(gòu)變化。 每組另外6 只動物耳蝸利用形態(tài)學多重免疫熒光技術(shù)，配合激光共聚焦顯微鏡，觀察SGN 中NeuN、BDNF 定位表達。

1.2.3 透射電鏡觀察OHC、SGN 細胞核超微結(jié)構(gòu)

將制備的耳蝸石蠟包埋標本切片，H&E 染色，在顯微鏡下定位耳蝸底回柯替氏器OHC 和同一部位的SGN，明確區(qū)域，從石蠟塊上取出相同區(qū)域組織，60℃熔化石蠟，梯度乙醇水化，0.1 mol/L 碳酸鈉緩沖液漂洗，4℃下組合固定液(由2.5%戊二醛、2%多聚甲醛、0.1 mol/L 碳酸鈉緩沖液配制)固定24 h，0.1 mol/L PBS 洗，1%鋨酸后固定2 h，0.1 mol/L PBS 漂洗，在樣品組織自動處理器中經(jīng)雙蒸水、1%鞣酸、雙蒸水、梯度乙醇、環(huán)氧丙烷、梯度EPON 處理和包埋(EPON 由tEpon-812、DDSA、NMA-ultrapure、DMP-30 配制而成)，將EPON 塊切割0.5 μm 的半薄切片，甲苯胺藍染色，顯微鏡下檢查染色載玻片，進一步確認薄切片的所要觀察的區(qū)域，將EPON 塊進一步修整成＜2 毫米寬范圍，超薄切片機金剛石刀將EPON 塊切成80 nm 薄片，將薄片加載到透射電鏡金屬網(wǎng)格上，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色網(wǎng)格，透射電鏡觀察，其中重點選擇觀察7 月齡對照組耳蝸底回存留尚未解體的OHC 以及對應部位的SGN 超微結(jié)構(gòu)變化，同時與7 月齡中藥組相同部位的OHC 和SGN 進行對照。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察SGN 中NeuN 與BDNF 定位表達

實驗方法采用筆者探索和應用的形態(tài)學多重免疫熒光方法[9-12]，將制備的耳蝸石蠟包埋標本切片，Xylene 脫蠟，梯度乙醇水化，PBS 液漂洗，轉(zhuǎn)入10mM、 pH6.0 Citrate 緩沖液，選擇微波爐進行抗原熱修復，溫度199F，PBS 漂洗后，加入2% goat serum，1% BSA，0.1% cold fish gelatin，0.05%sodium azide 封閉孵育，置換5% BSA 配制的NeuN、BDNF 目標抗體液，每個抗體室溫下相繼孵育1 h，置4℃冰箱過夜。 分別以0.1% Triton PBS、PBS 漂洗，以各自對應匹配并耦合488、555 不同熒光素吸收譜的羊抗一抗IgG，室溫孵育50 min。 同樣分別以0.1%Triton PBS、 PBS 漂 洗。 最 后 以 VECTASHIELD HardSet Mouting Medium with DAPI 進行DAPI 細胞核染色，中性樹脂封片，激光共聚焦顯微鏡下，以相應匹配的熒光素吸收譜不同激光發(fā)射，并配以不同顏色標記不同目標基因或蛋白以及DAPI，觀測樣品。 每組耳蝸切片樣本截取同部位各12 張照片，其中重點選擇觀察耳蝸底回SGN，最后應用Image-J分別測算NeuN、BDNF、DAPI 灰度值，按NeuN/DAPI，BDNF/NeuN 灰度值比進行統(tǒng)計并比較。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS16.0 軟件進行統(tǒng)計分析。 計量資料以平均值±標準差(±s) 表示，兩兩比較用LSD-t檢驗法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

透射電鏡下，重點選擇觀察的7 月齡對照組耳蝸底回存留尚未解體的OHC 所見，胞體萎縮，胞核固縮不整，深染，核染色質(zhì)濃集致密，聚集成團，并向核膜內(nèi)側(cè)邊集，紋理結(jié)構(gòu)模糊不清，電子密度高，有的核膜不完整，胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，呈現(xiàn)凋亡態(tài)勢(圖1A)，同樣，對應于OHC 部位的7 月齡對照組耳蝸底回SGN 變化與OHC 相同，但凋亡狀況更為嚴重，大小形態(tài)不一，數(shù)量明顯減少，不少神經(jīng)元變性固縮、核不規(guī)則，核染色質(zhì)聚集成團、邊集，電子密度高，甚至胞核溶解，形成空泡，或解體缺如(圖1C)。 而7 月齡中藥組耳蝸底回OHC 胞體飽滿，胞核圓形完整，核膜完整光滑，雙層結(jié)構(gòu)清晰，核內(nèi)染色質(zhì)均勻，紋理結(jié)構(gòu)清晰可見，電子密度低，胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，呈現(xiàn)較為健康(圖1B)，其耳蝸底回SGN 結(jié)構(gòu)變化與OHC 相同，凋亡狀況較輕，數(shù)量較多，僅個別胞核溶解，形成空泡，但整體較為健康(圖1D)。

激光共聚焦顯微鏡下，耳蝸切片柯替氏器和螺旋神經(jīng)節(jié)(spiral ganglion，SG)清晰顯示不同色彩靶標形態(tài)表達(圖2)，紅色顯示NeuN，其作為神經(jīng)元的特殊標志蛋白，代表著SGN 識別身份，表示存在的SGN；綠色顯示BDNF，代表著BDNF 的識別身份；藍色顯示DAPI，作為細胞核DNA 特異性標記物，代表著各種細胞核。 通過形態(tài)重疊表達，可以精準明確靶向細胞和分布位置，即NeuN+DAPI 重疊表達定位為SGN；NeuN+BDNF+DAPI 重疊表達定位為SGN 所呈現(xiàn)的BDNF 表達，并可根據(jù)顏色多寡和有無比較，即可了解和判斷表達量和分布的差異，或提示神經(jīng)元凋亡現(xiàn)狀，例如1 個細胞中的NeuN 單位面積表達量明顯減少，說明該神經(jīng)元已經(jīng)出現(xiàn)凋亡狀況，若無NeuN 表達，說明非SGN。 通過兩組相同部位圖像直觀比較，耳蝸底回螺旋神經(jīng)節(jié)7 月齡對照組NeuN+DAPI 分布明顯減少，說明SGN 神經(jīng)元凋亡明顯增多(圖2A)，而7 月齡中藥組NeuN+DAPI 分布較多且密集，說明SGN 神經(jīng)元保存較高(圖2B)，與透射電鏡一致，兩組差異具有顯著性(P＜0.05)(表1)。 耳蝸底回螺旋神經(jīng)節(jié)所見，與7 月齡對照組比較，7 月齡中藥組NeuN+BDNF+DAPI 表達量及密度明顯增多(圖2C，D)，兩組差異具有顯著性(P＜0.05)(表1)。

3 討論

人類AHL 臨床耳蝸細胞形態(tài)學以及細胞內(nèi)在分子機制研究難于開展甚至無法了解，其防治性研究也就極其困難，因此，動物模型成為目前AHL 研究可行性的重要方式和途徑，目前研究AHL 所選動物一般選擇不同種株近交系小鼠，如C57BL/6J、CBA/CaJ 等小鼠，緣于該類小鼠的生命周期較短和或AHL 相關(guān)基因缺陷小鼠模型的成功建立，研究發(fā)現(xiàn)，不同種株近交系小鼠耳蝸外毛細胞的退變隨著年齡的增長存在著截然不同的病變發(fā)生時間和病理學改變進程，其中C57BL/6J 小鼠在出生后更早出現(xiàn)蝸毛細胞的退變[13-15]，通過對3 個月、6 個月、9個月、12 個月、15 個月和18 個月齡時測量8 kHz、16 kHz 和32 kHz 純音刺激的 ABR 閾值比較，C57BL/6J小鼠32 kHz ABR 閾值在6 月齡時明顯增高，至12 個月齡時，16 kHz 閾值顯著增高[16]。C57BL/6J 小鼠出現(xiàn)AHL 較早，與基因遺傳學密切相關(guān)，通過對小鼠四種基因型ABR 聽力檢測研究發(fā)現(xiàn)，Sod1(+/+)Cdh23(+/+)小鼠在15 個月齡前仍保持正常聽力，其中Sod1(-/-)Cdh23(ahl/ahl)小鼠表現(xiàn)出聽力損失最早而且發(fā)病最嚴重，其次是 Sod1(+/+)Cdh23(ahl/ahl)，Sod1(-/-)Cdh23(+/+)，由此認為，Cdh23(ahl/ahl)基因缺陷型是導致C57BL/6J 小鼠早期出現(xiàn)AHL 病變的主要原因[17-18]。 因此，C57BL/6J小鼠是研究AHL 理想動物模型之一。

但一直以來我們的研究只局限于普通光鏡下的研究，分子機制研究也僅局限于整個耳蝸PCR 等研究，其電鏡下耳蝸HC 和SGN 超微形態(tài)學及中藥細胞靶向分子作用仍不清楚，以往也缺乏有關(guān)文獻報道和參考，這緣于小鼠耳蝸解剖過于細微，觀察范圍極小，如要定位為耳蝸某點用于電鏡觀察，則技術(shù)要求更高，難度更大。 這次我們使用原已備有的耳蝸石蠟包埋標本轉(zhuǎn)用于透射電鏡的研究尚屬首次，國內(nèi)外也均未見報道，以往透射電鏡生物樣品制備采用的是環(huán)氧樹脂包埋切片，通過摸索證明，石蠟包埋切片同樣可以轉(zhuǎn)用于透射電鏡樣生物樣品制備，只是有的地方和步驟不同。 本次研究觀察所見，7 月齡C57BL/6J 小鼠耳蝸底回OHC 和SGN 出現(xiàn)細胞凋亡特征，如胞體萎縮、核固縮，核染色質(zhì)聚集成團、邊集，電子密度高，尤其是SGN 凋亡特征比OHC 更為嚴重，不少甚至溶解消失，形成空泡，或分崩離析，殘缺不全，或解體缺如等，由此還提示，SGN 凋亡要早于HC，這與先前我們通過耳蝸鋪片、普通光鏡下所見結(jié)論一致，即7 月齡則耳蝸同時出現(xiàn)基底部內(nèi)、外毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元凋亡或變性，并顯示同期螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元凋亡比毛細胞相對更重，提示AHL 神經(jīng)元退變早于毛細胞，由此推斷在AHL 中的毛細胞有賴于神經(jīng)元提供營養(yǎng)支持[19]。 而7 月齡中藥組無論HC，還是SGN，出現(xiàn)的凋亡現(xiàn)象則輕得多，從超微細胞形態(tài)學觀察中，進一步證實了中藥復方健耳劑具有對抗耳蝸OHC 和SGN 凋亡的顯著作用。

圖1 透射電鏡下兩組耳蝸底回外毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元比較Note. A and B were the OHC at cochlear base of the 7-month-old control group and the 7-month-old TCM group，respectively. Yellow arrows indicate the nuclei of OHC and green arrows indicate the bodies of OHC. C and D were the SGN at cochlear base of the 7-month-old control group and the 7-month-old TCM group，respectively. Yellow arrows indicate the nuclei of neuron，red arrows indicate the cell bodies of neuron，and blue arrows show the vacuole formed by the dissolution and disappearance of nuclei.(A，B：× 2750. C，D：× 4900)Figure 1 Comparison of OHC or SGN in the cochlear base of two groups under transmission electron microscopy

圖2 激光共聚焦顯微鏡下兩組耳蝸底回螺旋神經(jīng)節(jié)比較Note. A and B were the SG at cochlear base in the 7-month-old control group and the 7-month-old TCM group(× 20)，respectively. Yellow arrows indicate the SG location，and red indicate the NeuN expression，representing neurons present； blue indicates DAPI，representing nuclei of various cells. C and D the SG at cochlear base in the 7-month-old control group and the 7-month-old TCM group(× 40)，respectively. Green arrows are the NeuN + DAPI expression，red arrows are the NeuN + BDNF + DAPI expression，and orange arrows are residual NeuN expression，indicating the apoptotic SGN residues. Red is NeuN，green is BDNF，and blue is DAPI.Figure 2 Comparison of SG in the cochlear base of two groups under confocal laser microscope

表1 兩組動物耳蝸底部附近螺旋神經(jīng)節(jié)NeuN、BDNF 表達量比較(灰度值，±s)Table 1 Comparison of NeuN or BDNF expression in SG near the cochlear base between two groups (gray value，±s)

表1 兩組動物耳蝸底部附近螺旋神經(jīng)節(jié)NeuN、BDNF 表達量比較(灰度值，±s)Table 1 Comparison of NeuN or BDNF expression in SG near the cochlear base between two groups (gray value，±s)

注：與7 月齡對照組比較，△P＜0.05。Note. Compared with the 7-month-old control group，△P＜0.05.

組別Groups只n NeuN/DAPI BDNF/NeuN 7 月齡對照組7-month-old control group 6 0.57 ± 0.12 0.35 ± 0.09 7 月齡中藥組7-month-old TCM group 6 1.19 ± 0.19△ 0.77 ± 0.10△

NeuN 是脊椎動物中一種神經(jīng)元特異性的DNA結(jié)合核蛋白，是神經(jīng)元的極好特殊標記物。 在小鼠的整個神經(jīng)系統(tǒng)中，包括在小腦、大腦皮層、海馬、丘腦和脊髓，以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的背根神經(jīng)節(jié)、交感鏈神經(jīng)節(jié)和腸神經(jīng)節(jié)中均有表達[20-21]。 本次研究在耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)中首次觀測到NeuN 表達，說明NeuN 表達定位于神經(jīng)元，是神經(jīng)元特有標志蛋白，在SGN 的表達，代表了SGN 的分布，具有識別和定位SGN 靶目標作用和意義。 本次實驗通過形態(tài)學多重免疫熒光技術(shù)研究結(jié)果顯示，耳蝸底部螺旋神經(jīng)節(jié)7 月齡對照組對NeuN 表達明顯低于7 月齡中藥組，因此提示SGN 伴隨著年齡增長和老化呈現(xiàn)凋亡的發(fā)展趨勢，復方健耳劑具有保護老年性SGN 的藥效作用，這些研究與前期利用甲苯胺藍染色、普通顯微鏡下觀察結(jié)果和結(jié)論一致[6]。 本次研究還表明，7 月齡中藥組對BDNF 表達明顯高于7月齡對照組，表明中藥對定位于SGN 的BDNF 含量保持較高水平，由此提示，復方健耳劑能夠有效對抗老年性耳蝸OHC、SGN 凋亡，保護聽功能，其關(guān)鍵作用機制之一與其促進SGN 中的BDNF 表達密切相關(guān)。

BDNF 是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的重要成員，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，部分初級感覺神經(jīng)元也可合成BDNF，其最具神經(jīng)元營養(yǎng)活性，對神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化和神經(jīng)形成，以及成熟神經(jīng)元的突觸可塑性起著關(guān)鍵作用，中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病等，與BDNF 營養(yǎng)支持的減少有關(guān)。 由于BDNF 及其高親和力受體遍布整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)，且BDNF 是一種有效的神經(jīng)保護劑，因此認為，該營養(yǎng)因子是治療某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的良好候選因子[22-24]。 然而，BDNF 受何種分子調(diào)控，通過何種途徑，實現(xiàn)對神經(jīng)細胞存活、遷移、生長、發(fā)育和分化，軸突和樹突的生長、突觸發(fā)生、傳遞和突觸重塑等作用目前仍未明了，多數(shù)學者認為，BDNF 與高親和力蛋白激酶受體酪氨酸蛋白激酶B(Trk B)特異性結(jié)合，激活酪氨酸激酶，磷酸化的酪氨酸與信號系統(tǒng)的其它分子結(jié)合，進一步使其它分子磷酸化，導致激酶瀑布效應從而激活整個信號傳遞系統(tǒng)，即主要通過Ras/MAPK 信號轉(zhuǎn)導途徑，或PI3-K/Akt 信號轉(zhuǎn)導通路，發(fā)揮其生物學作用[25-26]。 后來有研究表明，外源性BDNF 能夠通過抑制乙醇神經(jīng)毒性誘導的細胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生，阻止Bax 蛋白向線粒體膜的轉(zhuǎn)運或線粒體膜電位中斷，從而防止新生小鼠發(fā)育過程中的神經(jīng)元凋亡[27]，或BDNF 作為一種蛋白激酶A (protein kinase A，PKA)激活劑，通過PKA/cAMP 通路的磷酸化和脫磷酸化作用，調(diào)節(jié)細胞有氧代謝，阻止乙醇激活的下丘腦神經(jīng)元氧化應激和凋亡過程[28]。 由此提示BDNF 還可通過激活體內(nèi)細胞抗氧化系統(tǒng)，或抑制ROS 產(chǎn)生，阻止caspase 家族介導的細胞程序性死亡即凋亡。 過去普遍認為活性氧ROS 產(chǎn)生和累積損害被認為是AHL 發(fā)生過程的重要因素之一，即老年人耳蝸毛細血管退變，微循環(huán)障礙，血液灌注不足，線粒體能量代謝功能下降，ROS 不斷累積，可損害線粒體，誘導線粒體基因(mtDNA)缺失或突變，引起細胞凋亡[29-31]。 因此認為，中藥復方健耳劑通過促進BDNF 的產(chǎn)生，激活Ras/MAPK，或PI3-K/Akt，或PKA/cAMP 信號轉(zhuǎn)導途徑，發(fā)揮系列生物學效應，其中包括抑制ROS 產(chǎn)生，阻止caspase 家族介導的細胞程序性死亡，是其具有保護老年性耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元凋亡作用重要機制之一。

致謝：本次實驗中透射電鏡樣品處理技術(shù)方案及儀器操作承蒙美國哈佛大學醫(yī)學院馬薩諸塞州總醫(yī)院病理中心主任Jenny Zhao 博士指導，在此表示衷心感謝!