鮑奕清，陳思，洪瑞晟，朱儀，高敏，李樂樂，張旭，王新，劉東，石運偉

(南通大學神經(jīng)再生重點實驗室，生命科學學院，醫(yī)學院，江蘇 南通 226001)

伊馬替尼屬于2-苯基氨基嘧啶類化合物，化學名為4-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-N-[4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]苯基]苯甲酰胺，是一種高特異性酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)[1]。 伊馬替尼是目前臨床首選的兒童慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)治療藥物[2]；接受伊馬替尼治療的CML 患者10 年生存率可以達到80%以上[3]。 此外，伊馬替尼也被用于胃腸間質(zhì)瘤治療；其有效治療CML 的藥理機制已被明確證實為靶向抑制BCR-ABL 表達[1]。

伊馬替尼甲磺酸鹽于2002 年以商品名“格列衛(wèi)”在我國上市以來，臨床應(yīng)用持續(xù)增加，也伴隨著不良反應(yīng)逐漸顯現(xiàn)，包括血液學和非血液學不良反應(yīng)。 血液學不良反應(yīng)主要為血紅蛋白、白細胞、血小板等減少，其主要發(fā)生于疾病治療過程中，一般在用藥后6 ～15 d 出現(xiàn)，嚴重程度與用藥劑量和病期相關(guān)，血液學不良反應(yīng)與其他不良反應(yīng)往往在同一病例中均有表現(xiàn)。 非血液學不良反應(yīng)臨床表現(xiàn)主要為：水腫和水鈉潴留，肌痛和肌痙攣，惡心、嘔吐等消化系統(tǒng)異常，肝腎功能異常以及胸悶、竇性心動過速等心臟毒性和心臟功能異常，皮膚及附件系統(tǒng)許多臨床癥狀表現(xiàn)較為嚴重，包括多行紅斑疹、紅色斑丘疹、剝脫性皮炎等[4]。 伊馬替尼在臨床使用中的不良反應(yīng)，促進該類藥物的研發(fā)，其二代藥物目前仍處于臨床實驗階段[5]。 因此，探討其產(chǎn)生不良反應(yīng)的原因?qū)⒂兄谔岣哐邪l(fā)階段藥物的成藥幾率。

伊馬替尼臨床不良反應(yīng)遍及人體多個器官，我們在探討伊馬替尼不良反應(yīng)的研究中重點關(guān)注在人體各個器官分布的血管和神經(jīng)系統(tǒng)。 本研究以胚胎期斑馬魚為動物模型，在整體動物水平上考察伊馬替尼對斑馬魚血管和神經(jīng)發(fā)育的毒副作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

實驗中使用的野生型AB 系和轉(zhuǎn)基因斑馬魚系Tg(kdr1：EGFP)、Tg(kdr1：mCherry)、Tg(fli1a：nEGFP)、Tg(hb9：EGFP)、Tg(huc：mCherry)由南通大學實驗動物中心提供。 轉(zhuǎn)基因斑馬魚系均由野生型AB 魚系構(gòu)建。 斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)為ESEN 水處理系統(tǒng)(北京)，在養(yǎng)殖系統(tǒng)中定時定量喂養(yǎng)。 斑馬魚房間上午08：00 開啟照明，按照14 h/10 h 交替開關(guān)照明，房間溫度為(28 ± 2)℃，相對濕度為(60 ±5)%。 所有斑馬魚實驗操作均在南通大學實驗動物中心完成。 動物實驗符合江蘇省實驗動物管理委員會倫理規(guī)范，所有動物實驗遵循3R 原則，動物實驗倫理審批號為20180510-001。

1.1.2 儀器和設(shè)備

Tricaine 購自Sigma-Aldrich 公司(美國)。 低熔點的瓊脂糖購自Life Technologies Corporation(美國)。 原位雜交(ISH)及Q-PCR 實驗材料購自購于Roche 公司(瑞士)。 用NaCl，KCl，CaCl2 和MgSO4制備E3 胚胎培養(yǎng)液。 氯化鈉和其他化學品購自國藥集團化學試劑有限公司(中國)。 體視顯微鏡為奧林巴斯MVX10(日本)。 激光共聚焦顯微鏡型號為Leica TCS-SP5 LSM，購自Leica 公司(德國)。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗

斑馬魚胚胎繁育方法依照ZFIN：The Zebrafish Book (http：/ /zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html)。 收集6 月齡斑馬魚成魚所產(chǎn)胚胎，將胚胎置于28.5℃的E3 溶液中進行培養(yǎng)。 在受精后6 h(hpf)，解剖顯微鏡下篩選狀態(tài)良好的胚胎用于實驗。 將10 個左右的胚胎置于96 孔板中，用E3 溶液培養(yǎng)，依照圖1A所示實驗流程進行后續(xù)處理。

1.2.2 激光共聚焦顯微鏡成像

發(fā)育至48 hpf 的斑馬魚胚胎，用tricaine 麻醉后用0.8%的低熔點瓊脂糖凝膠(UltraPureTMLow Melting Point Agarose，Invitrogen)包埋。 使用Leica TCS-SP5 LSM 激光共聚焦顯微鏡成像。

1.2.3 基因表達分析

取野生型斑馬魚胚胎進行藥物處理至48 hpf，收集胚胎進行固定后保存于-20℃甲醇中。 ISH 實驗過程在本實驗室發(fā)表的工作中已有報道[6-7]。 用來制作vegfr2(ENSDART00000170626.2)探針所用的PCR 引物序列為，正向引物：5′-TCGGTTTTAG GAAGGACGGA-3′；反 向 引 物：5′-CGACTCAATGC GTACCGATG-3′。 用 來 制 作pdgfrα(ENSDART000 00103510.5)探針所用的PCR 引物序列為，正向引物：5′-CATGCTGACACCACATTCCG-3′；反向引物：5′-TGGATGCTGAAGTTCTGGTCT-3′。 利 用 q-PCR技術(shù)進一步分析基因vegfr2 和pdgfrα表達。 q-PCR實驗過程在本實驗室發(fā)表的工作中已有報道[8]。vegfr2 分析所用引物為，正向引物：5′-CCTCAGTC AAAGCCTTCTTCA-3′，反向引物：5′-TGCAAATGAG TGTGAGTGTCC-3′。pdgfra分析所用引物為，正向引 物：5′-CGTGACCATGGGATTCCTGA-3′，反 向 引物：5′-CGACCCAAGTTACTCTCCTCACTCA-3′。

1.3 統(tǒng)計學分析

用GraphPad Prism 5 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，統(tǒng)計結(jié)果表示為平均值±標準差(±s)。 使用Dunnett' s 檢驗的單因素方差分析(One-way ANOVA)用于多組比較，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 伊馬替尼對斑馬魚胚胎發(fā)育安全性評估

按圖1A 所示，將發(fā)育至8 hpf 的野生型斑馬魚胚胎置于96 孔板中，分別用含有不同濃度伊馬替尼的胚胎培養(yǎng)液處理斑馬魚胚胎，胚胎發(fā)育至48 hpf后在顯微鏡下觀察統(tǒng)計。 結(jié)果顯示，100 μg/mL 及以下濃度的伊馬替尼溶液處理40 h 后，斑馬魚胚胎整體上未見明顯的致死、畸形、發(fā)育延遲等毒性(圖1B)。 對三次重復實驗進行計數(shù)，除100 μg/mL 的伊馬替尼溶液處理組有偶然死亡，其他劑量組斑馬魚胚胎整體發(fā)育正常(圖1C)。

2.2 伊馬替尼抑制斑馬魚胚胎ISV 發(fā)育

在上述安全濃度范圍內(nèi)，按圖1A 所示實驗流程，伊馬替尼溶液處理發(fā)育至8 hpf 的Tg(fli1a：nEGFP)×Tg(kdrl：mCherry)轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎。 結(jié)果顯示，在100 ～0.01 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，伊馬替尼處理40 h 后斑馬魚胚胎ISV 發(fā)育異常。 主要表現(xiàn)為ISV 內(nèi)皮細胞數(shù)量明顯減少：對照組斑馬魚胚胎發(fā)育至48 hpf 時，每條ISV 內(nèi)皮細胞數(shù)量為5 個左右，而伊馬替尼處溶液理組斑馬魚胚胎ISV 內(nèi)皮細胞數(shù)量在4 個以內(nèi)(圖2A、B)。 ISV 內(nèi)皮細胞數(shù)量減少，導致ISV 的部分缺失。 ISV 內(nèi)皮細胞數(shù)量減少同時導致管腔直徑顯著變窄，ISV 腔化異常(圖2A、C)。

2.3 伊馬替尼抑制斑馬魚胚胎ISV 發(fā)育但不影響Cap 運動神經(jīng)元發(fā)育

在100 ～0.01 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，按圖1A 所示實驗流程，用伊馬替尼溶液對Tg(hb9：EGFP) ×Tg(kdrl：mCherry)轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎進行處理。 結(jié)果顯示，伊馬替尼處理40 h 后，顯著抑制斑馬魚ISV的發(fā)育(圖3A)，造成ISV 的部分缺失，能夠重復前述實驗結(jié)果。 同時發(fā)現(xiàn)，伊馬替尼溶液處理斑馬魚胚胎后，Cap 運動神經(jīng)元的軸突長度和分枝數(shù)量無明顯變化(圖3B、C)。

圖1 伊馬替尼對斑馬魚胚胎發(fā)育安全性評估Note. A，Experimental procedures； B，Effect of imatinib on the overall development of zebrafish embryos in the concentration range of 100 μg/mL to 0.01 μg/mL； C，Statistics of zebrafish embryo development treated with imatinib solution showed no significant developmental phenotypes such as lethality，malformation，and delayed development (the number of embryos in each group was 10 or 11).Figure 1 Safety evaluation of imatinib on zebrafish embryo development

圖2 伊馬替尼顯著抑制斑馬魚胚胎ISV 腔化和血管內(nèi)皮細胞的增殖(n=8)Note. A，ISV endothelial cells nuclear and ISV morphology of in 48 hpf zebrafish embryos.In vivo imaging offli1a：nEGFP labeled vascular endothelial cell nuclei and kdrl：mCherry labeled vascular endothelial cell zebrafish embryonic ISV endothelial cell nuclei and endothelial cells was performed by confocal laser scanning microscopy. B，The number of endothelial cells in the ISV of 48 hpf zebrafish embryos was counted and statistically analyzed，and treatment with the imatinib solution significantly reduced the number of endothelial cells in the ISV compared with the control group. C，measurement statistics of ISV diameter in zebrafish embryos at 48 hpf showed that treatment with the imatinib solution significantly reduced ISV diameter compared with the control group.(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)Figure 2 Imatinib significantly inhibited ISV cavitation and proliferation of vascular endothelial cells in zebrafish embryos(n=8)

2.4 伊馬替尼抑制斑馬魚胚胎ISV 發(fā)育但不影響huc 標記神經(jīng)元的發(fā)育

在100 ～0.01 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，用伊馬替尼溶液處理Tg(huc：mCherry)×Tg(kdrl：EGFP)斑馬魚胚胎。 結(jié)果顯示，處理40 h 后，伊馬替尼顯著抑制斑馬魚ISV 發(fā)育(圖4A)，造成ISV 的部分缺失，能夠再次與前述實驗結(jié)果吻合。 同時，伊馬替尼溶液處理斑馬魚胚胎后，huc 標記神經(jīng)元的數(shù)目無顯著改變(圖4B)。

2.5 伊馬替尼調(diào)控vegfr2 及pdgfrα 信號途徑抑制斑馬魚胚胎ISV 發(fā)育

按照圖5A 所示實驗流程，收集胚胎進行ISH分析，并對胚胎軀干部位進行拍照。 結(jié)果顯示，100、1 μg/mL 濃度的伊馬替尼溶液處理野生型斑馬魚胚胎后，vegfr2 和pdgfrαmRNA 表達水平均明顯降低(圖5B)。 通過q-PCR 實驗進一步驗證伊馬替尼溶液處理后vegfr2 和pdgfrα的表達水平，結(jié)果顯示，100、1 μg/mL 濃度的伊馬替尼溶液處理野生型斑馬魚胚胎后，vegfr2 和pdgfrα的表達水平顯著降低(圖5C、D)。

圖3 伊馬替尼特異性抑制斑馬魚胚胎ISV 發(fā)育而對運動神經(jīng)元形態(tài)無顯著影響(n=8)Note. A，In vivo imaging of Cap motoneurons and ISVs from 48 hpf zebrafish embryos was performed by confocal microscopy to analyze Cap motoneurons and ISV morphology. There was a significant loss of ISV，but no significant change in Cap motoneuron morphology after treatment with imatinib solution. B，The length of Cap motoneuron axons in 48 hpf zebrafish embryos was statistically analyzed，and there was no significant change in Cap motoneuron axon length after treatment with imatinib solution. C，The number of Cap motoneuron processes in 48 hpf zebrafish embryos was counted，and there was no significant change in the number of Cap motoneuron processes after treatment with imatinib solution.Figure 3 Imatinib specifically inhibited ISV development in zebrafish embryos but had no significant effect on motor neuron morphology(n=8)

3 討論

斑馬魚(danio rerio)是藥物篩選及毒理研究的良好模式生物，利用其進化保守、幼魚通體透明、生長周期短、產(chǎn)卵量大、體外受精等特點，可以方便實現(xiàn)活體成像、高通量篩選、遺傳操作等研究目的。本研究利用標記血管內(nèi)皮細胞和神經(jīng)元的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系，通過激光共聚焦活體成像技術(shù)，觀察伊馬替尼對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響。 伊馬替尼是第一個成功用于臨床治療CML 的TKI 類藥物[9]。 自2001 年上市以來，伊馬替尼以良好的治療效果廣泛的應(yīng)用于CML 臨床治療。 新近臨床研究顯示：接受TKI 治療3 年以上并持續(xù)分子響應(yīng)MR4.0 ≥2 年的兒童(包括術(shù)后復發(fā)的患者)可以安全停藥[5]。伊馬替尼通常以甲磺酸鹽的形式成藥，具有良好臨床效果的一個重要因素是其良好的藥代動力學性質(zhì)，口服生物利用度F 為98%，體內(nèi)代謝產(chǎn)物去甲基化合物仍有活性，并且伊馬替尼和代謝物的血漿半衰期分別為18 h 和40 h[1，10-12]。

這些臨床治療優(yōu)勢使得伊馬替尼的臨床用量不斷增加，但多種臨床不良反應(yīng)也逐漸顯現(xiàn)，對伊馬替尼的研究亦不斷深入。 伊馬替尼主要通過抑制BCR-ABL 蛋白酪氨酸磷酸化發(fā)揮對CML 的治療作用[3]。 此外，伊馬替尼也被報道參與多個靶點的抑制，包括c-KIT、v-ABL、TEL/ABL、PDGFR 等活性的抑制[13-14]。 上述伊馬替尼的靶向抑制均通過與酪氨酸激酶活性部位ATP 結(jié)合位點附近相結(jié)合，失活靶蛋白活性，最終導致促進CML 發(fā)生的下游信號通路關(guān)閉[15]。 伊馬替尼靶向治療CML 的分子機制已經(jīng)基本明確，但其臨床不良反應(yīng)的來源仍不清楚。

圖4 伊馬替尼特異性抑制斑馬魚胚胎ISV 發(fā)育而對huc 標記神經(jīng)元數(shù)量無顯著影響(n=8)Note. A，In vivo imaging of huc labeled neurons and ISVs from 48 hpf zebrafish embryos was performed by confocal microscopy to analyze huc neurons and ISV morphology. There was a significant loss of ISV，but no significant change in the morphology of huc labeled neurons after treatment with imatinib solution. B，The number of huc labeled neurons in 48 hpf zebrafish embryos was counted，and the number of huc neurons was not significantly changed after treatment with imatinib solution.Figure 4 Imatinib specifically inhibited ISV development in zebrafish embryos but had no significant effect on the number of huc labeled neurons(n=8)

本研究在整體動物水平上，通過活體成像研究伊馬替尼對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響，探討伊馬替尼的毒副作用。 結(jié)果顯示，100 ～0.01 μg/mL 的伊馬替尼處理40 h，發(fā)育至48 hpf 的斑馬魚體型無顯著異常，這與文獻報道符合[16]。 在此濃度范圍內(nèi)，考察伊馬替尼對斑馬魚血管發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)伊馬替尼能夠顯著抑制斑馬魚血管發(fā)育，包括抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖和ISV 的腔化。 進一步考察伊馬替尼對斑馬魚神經(jīng)發(fā)育的影響，結(jié)果顯示伊馬替尼對斑馬魚胚胎血管損傷的同時，對運動神經(jīng)元和huc 標記神經(jīng)元無顯著影響。 這提示伊馬替尼的臨床不良反應(yīng)可能與其對血管內(nèi)皮細胞增殖和ISV 腔化的抑制相關(guān)。 對伊馬替尼的分子機理研究主要集中于CML 的研究，其抑制血管新生的分子機理有待明確。 目前已有多個靶向血管內(nèi)皮細胞的替尼類藥物被批準用于臨床腫瘤治療，如樂伐替尼(lenvatinib)[17]、阿帕替尼(apatinib)[18]等。 這些替尼類藥物均通過調(diào)控VEGF、PDGFR 等介導的信號途徑靶向抑制腫瘤血管新生。 本研究對伊馬替尼調(diào)控VEGF、PDGFR 信號進行了初步探索。 實驗結(jié)果顯示伊馬替尼能夠顯著降低vegfr2 和pdgfrαmRNA 表達，并且隨伊馬替尼處理濃度增高，抑制效果增強。 不同濃度的伊馬替尼對vegfr2 和pdgfrαmRNA 表達水平的下調(diào)程度與對ISV 發(fā)育的抑制程度具有較好的關(guān)聯(lián)。 因此，我們推測伊馬替尼很可能通過調(diào)控VEGF、PDGFR 信號途徑抑制斑馬魚ISV 的發(fā)育。 其確切的分子機理是否與VEGF、PDGFR 信號途徑相關(guān)還有待更多的研究證據(jù)。

圖5 伊馬替尼抑制斑馬魚胚胎vegfr2 和pdgfrα mRNA 表達Note. A，ISH test procedure and photographic site. B，ISH analysis ofvegfr2 andpdgfrα in the trunk position of wild-type zebrafish embryos.Vegfr2 andpdgfrα mRNA expression levels were significantly lower after treatment of wild-type zebrafish embryos with imatinib. C，Vegfr2 mRNA expression was measured by q-PCR assay after treatment of wild-type zebrafish embryos with imatinib(n=3).Vegfr2 mRNA expression levels were significantly lower after treatment of wild-type zebrafish embryos with imatinib. D，Pdgfrα mRNA expression was measured by q-PCR experiments after imatinib treatment of wildtype zebrafish embryos (n = 3).Pdgfrα mRNA expression levels were significantly lower after treatment of wild-type zebrafish embryos with imatinib.(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)Figure 5 Imatinib inhibitedvegfr2 andpdgfrα mRNA expression in zebrafish embryos