張帆，安學(xué)芳，趙赫，李麗，肖宇宙

(中國科學(xué)院武漢病毒研究所，武漢 430071)

干擾素是一類在同種細(xì)胞上具有廣譜抗病毒功能的活性蛋白，其活性的發(fā)揮受細(xì)胞基因的調(diào)節(jié)和控制[1]，分為I 型干擾素和II 型干擾素兩大類。 I型干擾素包括IFN-α 和IFN-β，II 型干擾素又稱IFN-γ。 IFN-α、IFN-β 和IFN-γ 在體內(nèi)分別由白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌，作用于干擾素受體，通過信號途徑的激活，產(chǎn)生抗病毒蛋白，抑制病毒復(fù)制[2]。

I 型干擾素受體缺失小鼠是C57BL/6 背景小鼠通過ES 細(xì)胞基因打靶獲得，該小鼠在被病毒感染后靶組織器官內(nèi)病毒滴度遠(yuǎn)高于野生型小鼠，同時，病毒感染致死量遠(yuǎn)低于野生型小鼠[3]，是理想的病毒易感動物模型，廣泛應(yīng)用于感染性小鼠模型的制備、病毒致病機(jī)制的研究、抗病毒藥物及疫苗的篩選與評價等方面[4-8]。

實際飼養(yǎng)繁育過程中發(fā)現(xiàn)，干擾素受體缺失小鼠妊娠期為21 d 左右，哺乳期為21 d 左右，出生后42 ～56 d 可達(dá)性成熟，以上繁殖性能與背景野生型小鼠無明顯差異。 但在產(chǎn)仔數(shù)量上，干擾素受體缺失小鼠普遍不佳，每胎產(chǎn)仔3 ～6 只，顯著低于背景野生型小鼠每胎產(chǎn)仔數(shù)8 ～12 只。 干擾素受體缺失是否對小鼠體外受精造成影響，目前鮮有報道，本實驗使用體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)，通過配子雜交試驗，探討I 型干擾素受體缺失對小鼠精子和卵細(xì)胞在體外受精中的影響。 同時，通過優(yōu)化體外受精參數(shù)，探索提高體外受精率的方法，為后續(xù)相應(yīng)機(jī)理研究以及快速擴(kuò)繁策略制定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

150 只4 周齡雌性IFN-α R-/-小鼠，體重約14 g；33 只12 周齡雄性，體重約25 g)、IFNα/β R-/-小鼠(150 只4 周齡雌性，體重約14 g；33 只12 周齡雄性，體重約25 g)，ICR 小鼠(9 只8 周齡雌性，體重22～25 g)，由中國科學(xué)院武漢病毒研究所實驗動物中心保存【SYXK(鄂)2019-0034】。 C57BL/6 野生型小鼠(45 只4 周齡雌性，體重約14 g；9 只12 周齡雄性，體重約25 g)購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0006】。 所有動物均滿足SPF 級，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境IVC 籠盒【SYXK(鄂)2019-0034】，自由飲水進(jìn)食。 所有操作均符合中國科學(xué)院武漢病毒研究所動物實驗倫理要求(IACUC 審批號：WIVA30201901)。

1.1.2 主要試劑與儀器

PMSG ( 寧波三生生物科技有限公司，B181205)、HCG(寧波三生生物科技有限公司，S180801)，HTF (Cosmobio，CSR-R-B070)，KSOM(Cosmobio，CSR-R-B074)，2，2，2-三溴乙醇(Sigma，T48402)，叔 戊 醇(Sigma，152463)，M2 培 養(yǎng) 基(Sigma，M7167)，礦物油(Sigma，M5310)。

體視顯微鏡(Motic，中國)、倒置顯微鏡(Leica，德國)、二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，德國)、體溫維持儀(瑞沃德，中國)、超凈工作臺(蘇凈安泰，中國)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

兩種I 型干擾素受體缺失小鼠(IFN-α R-/-、IFN-α/β R-/-)及背景野生型小鼠(C57BL/6)分別進(jìn)行體外受精及胚胎移植，每組超排5 只雌鼠，3 次重復(fù)，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。 同時，分別將兩種I 型干擾素受體小鼠配子與同背景品系小鼠配子進(jìn)行體外受精，每組5 只小鼠，3 次重復(fù)，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。 體外受精條件優(yōu)化實驗每種因素超排5 只小鼠，3 次重復(fù)，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.2.2 麻醉劑的配置與使用

稱取5 g 2，2，2-三溴乙醇，加入3.1 mL 叔戊醇充分溶解，取500 μL 溶液加入39.5 mL 生理鹽水中混勻過濾，小鼠麻醉按照20 μL/g 腹腔注射使用，所有實驗操作均在動物麻醉狀態(tài)下進(jìn)行。

1.2.3 雌鼠超排及取卵

超排雌鼠腹腔注射10 IU PMSG，48 h 后腹腔注射10 IU HCG。 注射HCG 15 h 后將動物安樂死，收集卵子并放入二氧化碳培養(yǎng)箱暫存。

1.2.4 雄鼠精子采集與質(zhì)量測定

將具有成功交配經(jīng)驗且1 周內(nèi)未與雌鼠合籠的可育雄鼠安樂死后，取出附睪，迅速將精子取出至HTF 獲能液中，獲能30 min 后對精子進(jìn)行計數(shù)觀察并統(tǒng)計精子活力，精子活力計算公式為：(總精子數(shù)-非前進(jìn)運(yùn)動精子數(shù))/總精子數(shù)。

1.2.5 體外受精

延獲能滴邊緣吸取適量精子懸濁液，注射入受精滴中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h 后，將受精卵移入KSOM 液滴中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6 受體準(zhǔn)備

將ICR 結(jié)扎雄鼠與受體雌鼠1 ∶1合籠，第2 天驗栓，如發(fā)現(xiàn)陰道栓則可作為胚胎移植的受體。 移植前應(yīng)確定受體動物輸卵管出現(xiàn)膨大部，如無膨大部，則不能作為受體動物。

1.2.7 早期胚胎形態(tài)學(xué)觀察與統(tǒng)計

體外受精24 ～28 h 后，鏡檢受精情況，統(tǒng)計2細(xì)胞胚胎數(shù)、未受精卵數(shù)、異常卵數(shù)。 各類細(xì)胞形態(tài)特點見參考文獻(xiàn)9[9]。

1.2.8 胚胎移植

將鏡檢狀態(tài)良好的2 細(xì)胞胚胎移入提前平衡好的M2 培養(yǎng)基中，漂洗3 次后可用于移植。 受體小鼠麻醉后將40 枚胚胎采用輸卵管移植方法移入雙側(cè)輸卵管中。 移植完成后注意保溫及術(shù)后照料，具體移植方法見參考文獻(xiàn)9[9]。

1.2.9 體外受精條件的優(yōu)化

影響小鼠體外受精因素很多，本實驗主要對以下影響因素進(jìn)行優(yōu)化：A：不同采卵時間對體外受精效果的影響。 B：不同精子密度對體外受精效果的影響。 C：不同精子獲能時間對體外受精效果的影響。 D：在獲能液及受精液加入還原型谷胱甘肽對體外受精的影響。 探索提高I 型干擾素受體缺失小鼠體外受精方法。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，定量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(±s)表示。 組間比較采用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種I 型干擾素受體缺失雄鼠精子參數(shù)分析

由表1 可見，兩種I 型干擾素受體缺失小鼠與背景品系雄鼠精子數(shù)量差異無顯著性(P＞0.05)，而兩種I 型干擾素受體缺失小鼠精子活力低于背景品系雄鼠，差異具有顯著性(P＜0.05)。 兩種I 型干擾素受體缺失小鼠間，精子活力差異無顯著性(P＞0.05)。

2.2 兩種I 型干擾素受體缺失小鼠體外受精率分析

由表2 可見，IFN-α R-/-和IFN-α/β R-/-小鼠體外平均受精率分別為(43.37 ± 1.90)%和(34.41 ±3.18)%，背景品系C57BL/6 小鼠體外平均受精率為(77.09 ± 0.67)%，兩種I 型干擾素受體缺失小鼠與背景品系小鼠平均體外受精率差異具有顯著性(P＜0.05)。 同時，干擾素α 受體缺失小鼠體外受精率高于干擾素α、β 受體雙缺失小鼠體外受精率，兩者差異具有顯著性(P＜0.05)。

2.3 移植產(chǎn)仔率分析

將2 細(xì)胞胚胎定數(shù)移植受體小鼠雙側(cè)輸卵管，對小鼠產(chǎn)仔數(shù)、平均產(chǎn)仔率、離乳數(shù)及平均成活率進(jìn)行統(tǒng)計。 由表3 可見，IFN-α R-/-、IFN-α/β R-/-及C57BL/6 小鼠的平均產(chǎn)仔率分別為(20.83 ±1.44)%、(19.17 ± 1.44)%及(20.83 ± 1.44)%，不同品系小鼠組間平均產(chǎn)仔率差異無顯著性(P＞0.05)。 IFN-α R-/-組和IFN-α/β R-/-組出生的仔鼠在離乳前均死亡1 只，C57BL/6 組仔鼠全部成活，均順利離乳。 不同實驗組間平均成活率差異無顯著性(P＞0.05)。

2.4 配子雜交實驗分析

將兩種干擾素受體缺失小鼠雌雄配子分別與背景野生型小鼠雄雌配子進(jìn)行體外受精，對卵母細(xì)胞數(shù)、2 細(xì)胞胚胎數(shù)、未受精卵數(shù)及異常卵數(shù)進(jìn)行記錄并計算平均受精率。 由表4 可見，IFN-α R-/-雌性小鼠卵細(xì)胞與背景野生型C57BL/6 雄性小鼠精子體外受精，平均受精率為(41.20 ± 1.18)%，IFN-α R-/-雄性小鼠精子與背景野生型C57BL/6 雌性小鼠卵細(xì)胞體外受精，平均受精率為(50.30 ± 1.08)%，兩者差異具有顯著性(P＜0.05)。 IFN-α/β R-/-雌性小鼠卵細(xì)胞與背景野生型C57BL/6 雄性小鼠精子體外受精，平均受精率為(33.29 ± 2.44)%，IFNα/β R-/-雄性小鼠精子與背景野生型C57BL/6 雌性小鼠卵細(xì)胞體外受精，平均受精率為(42.82 ±0.35)%，兩者差異具有顯著性(P＜0.05)。

2.5 體外受精條件優(yōu)化結(jié)果分析

2.5.1 不同采卵時間對體外受精效果的影響

雌性小鼠注射HCG 后，不同時間點收集卵子，由表5 可見，IFN-α R-/-小鼠注射HCG 后15 h 收集卵細(xì)胞體外受精，受精效果最好，受精率顯著高于其他時間點取卵的受精率(P＜0.05)。 由表6 可見，IFN-α/β R-/-小鼠注射HCG 后13 h 和15 h 收集卵細(xì)胞體外受精，受精率差異不顯著(P＞0.05)，受精率顯著高于11 h 和17 h 取卵的受精率(P＜0.05)。

2.5.2 不同精子密度對體外受精效果的影響

將不同密度小鼠精子體外受精，由表7 及表8可見，兩種I 型干擾素受體缺失小鼠體外受精中，精子濃度為0.5 ～1×106/mL 受精效果最好，顯著高于其余兩個精子濃度組(P＜0.05)，精子濃度過低或過高均不利于體外受精。

2.5.3 不同獲能時間對體外受精效果的影響

將不同獲能時間的精子與卵細(xì)胞體外受精，由表9 及表10 可見，兩種I 型干擾素受體缺失小鼠精子獲能1 h 平均受精率最高，顯著高于其他獲能時間組(P＜0.05)，獲能時間延長至2 h 時，受精率明顯降低。

2.5.4 獲能液及受精液中加入還原型谷胱甘肽對體外受精的影響

將精子獲能液及受精液中添加1 mmol/L 還原型谷胱甘肽，由表11 及表12 可見，兩種I 型干擾素受體缺失小鼠平均體外受精率與不添加還原型谷胱甘肽比較，均獲得顯著提高(P＜0.05)。

表1 兩種I 型干擾素受體缺失小鼠精子參數(shù)(n=3)Table 1 Sperm parameters of two type I interferon receptor-deficient mice(n=3)

表2 兩種I 型干擾素受體缺失小鼠體外受精情況(n=15)Table 2 IVF results of two types I interferon receptor-deficient mice(n=15)

表3 移植產(chǎn)仔率與成活率情況(n=3)Table 3 Transplant birth rate and survival rate(n=3)

表4 兩種I 型干擾素受體缺失小鼠與背景野生型小鼠配子雜交實驗情況Table 4 Hybridization test of two types I interferon receptor-deficient mice and background wild-type mice

表5 不同采卵時間對IFN-α R-/-小鼠體外受精的影響Table 5 Effects of different oocyte collection time onin vitro fertilization of IFN-α R-/- mice

表6 不同采卵時間對IFN-α/β R-/-小鼠體外受精的影響Table 6 Effects of different oocyte collection time onin vitro fertilization of IFN-α/β R-/- mice

表7 不同精子濃度對IFN-α R-/-小鼠體外受精的影響Table 7 Effects of different sperm concentrations onin vitro fertilization of IFN-α R-/- mice

表8 不同精子濃度對IFN-α/β R-/-小鼠體外受精的影響Table 8 Effects of different sperm concentrations onin vitro fertilization of IFN-α/β R-/- mice

表9 不同獲能時間對IFN-α R-/-小鼠體外受精的影響Table 9 Effects of different capacitation time onin vitro fertilization of IFN-α R-/- mice

表10 不同獲能時間對IFN-α/β R-/-小鼠體外受精的影響Table 10 Effects of different capacitation time onin vitro fertilization of IFN-α/β R-/-mice

表11 添加還原型谷胱甘肽對IFN-α R-/-小鼠體外受精的影響Table 11 Effects of adding GSH onin vitro fertilization of IFN-α R-/- mice

表12 添加還原型谷胱甘肽對IFN-α/β R-/-小鼠體外受精的影響Table 12 Effects of adding GSH onin vitro fertilization of IFN-α/β R-/- mice

3 討論

I 型干擾素受體缺失小鼠作為一種免疫缺陷動物，通過血液學(xué)分析，4 ～12 周齡的I 型干擾素受體缺失小鼠與正常背景野生型小鼠唯一的異常是末梢血中成熟型單核細(xì)胞及嗜中性細(xì)胞增加2 ～3倍，細(xì)胞表面IgM 稍有減弱[10]，是多種病毒的易感模式動物，目前對其的研究主要集中在通過感染病毒后的機(jī)體各項指標(biāo)的測定，從而確定感染性動物模型的構(gòu)建是否成功，為后續(xù)病毒致病機(jī)理、抗病毒藥物篩選等研究提供動物模型支持。 由于I 型干擾素受體缺失小鼠產(chǎn)仔數(shù)量偏低，為探索原因，筆者通過體外受精-胚胎移植及配子雜交試驗初步探索干擾素受體缺失對體外受精造成的影響，并通過單一變量法對體外受精條件進(jìn)行優(yōu)化，為后續(xù)深入研究提供數(shù)據(jù)支持。

對兩種I 型干擾素受體缺失小鼠IFN-α R-/-和IFN-α/β R-/-及背景野生型小鼠C57BL/6 精子參數(shù)比較發(fā)現(xiàn)，兩種I 型干擾素受體缺失小鼠在精子數(shù)量上與背景品系小鼠并無顯著性差異(P＞0.05)，但精子活力顯著低于背景品系小鼠(P＜0.05)。 體外受精-胚胎移植發(fā)現(xiàn)，兩種I 型干擾素受體缺失小鼠平均體外受精率與背景野生型小鼠比較有顯著差異(P＜0.05)；同時，干擾素α 受體單缺失小鼠平均體外受精率高于干擾素α、β 受體雙缺失小鼠，兩者比較有顯著差異(P＜0.05)(見表2)。 由此初步推斷，I 型干擾素受體缺失導(dǎo)致小鼠體外受精能力明顯降低，并且降低程度隨受體缺失數(shù)量增加而增加。 將體外受精獲得的2 細(xì)胞胚胎定數(shù)移植入受體輸卵管，均得到了較理想的產(chǎn)仔量，I 型干擾素受體缺失小鼠與背景野生型小鼠無明顯差異(見表3)。

為研究I 型干擾素受體缺失小鼠的卵細(xì)胞和精子分別對體外受精的影響，筆者設(shè)計了配子雜交試驗，將IFN-α R-/-及IFN-α/β R-/-小鼠卵細(xì)胞和精子分別與背景野生型小鼠精子和卵細(xì)胞進(jìn)行雜交體外受精，記錄卵母細(xì)胞數(shù)、2 細(xì)胞胚胎數(shù)、未受精卵數(shù)及異常卵數(shù)，并計算平均受精率。 分析可知，兩種I 型干擾素受體缺失小鼠精子與背景野生型小鼠卵細(xì)胞體外受精平均受精率(50.30 ± 1.08)%和(42.82 ± 0.35)%和相應(yīng)品系小鼠卵細(xì)胞與背景野生型小鼠精子體外平均受精率(41.20 ± 1.18)%和(33.29 ± 2.44)%均低于背景野生型體外受精率(77.09 ± 0.67)%，推斷I 型干擾素受體缺失對小鼠精子和卵細(xì)胞均產(chǎn)生了影響，導(dǎo)致受精率降低。 同時，兩種I 型干擾素受體缺失小鼠精子與背景野生型小鼠卵細(xì)胞體外受精率均高于相應(yīng)品系小鼠卵細(xì)胞與背景野生型小鼠體外受精率，說明I 型干擾素受體缺失對卵細(xì)胞在體外受精中的影響更為明顯。 當(dāng)I 型干擾素與受體結(jié)合后，將引發(fā)級聯(lián)性的信號放大過程，信號傳遞到細(xì)胞核，對一系列干擾素刺激基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，主要涉及的信號通路包括MAPK (mitogen-activated protein kinase) 通路[11]。 研究發(fā)現(xiàn)在動物繁殖的不同階段均有MAPK 信號通路的參與，對動物生產(chǎn)實踐中的繁殖調(diào)控具有一定作用，主要體現(xiàn)在對于精子的發(fā)生、睪丸的發(fā)育及卵母細(xì)胞的發(fā)育產(chǎn)生影響[12]。 推測I型干擾素受體缺失，使細(xì)胞內(nèi)MAPK 通路受阻，從而導(dǎo)致小鼠生殖功能障礙，相關(guān)具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。 同時，I 型干擾素受體缺失將直接影響動物免疫功能，是否能夠間接導(dǎo)致其繁殖性能下降亦需要后續(xù)探索。

影響小鼠體外受精因素很多，本試驗通過改變影響體外受精的因素，如注射HCG 后的取卵時間、精子濃度、精子獲能時間及改變精子獲能液和受精液成分，探索提高體外受精效率的方法。 通過改變注射HCG 后取卵時間或調(diào)整體外受精精子濃度，并未使兩種I 型干擾素受體缺失小鼠體外受精率獲得提升。 適當(dāng)調(diào)整精子獲能時間，當(dāng)延長獲能時間為1 h 時，發(fā)現(xiàn)兩種I 型干擾素受體缺失小鼠體外受精率與常規(guī)方法相比，具有顯著提高(P＜0.05)。 本試驗以本實驗以Takeo 等[13]前期研究為依據(jù)，將常規(guī)精子獲能液及受精液中加入1 mmol/L 還原型GSH，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入GSH 后，兩種I 型干擾素受體缺失小鼠體外受精率與常規(guī)獲能液及受精液比較均獲得顯著提高(P＜0.05)。

本研究顯示I 型干擾素受體缺失可導(dǎo)致該兩種品系小鼠體外受精率降低，同時，對卵細(xì)胞的影響較精子更為顯著，通過延長精子獲能時間或在精子獲能液及受精也中加入GSH，能夠顯著提高體外受精效果。 筆者后續(xù)將對I 型干擾素受體缺失對小鼠體外受精造成的影響以及繁殖策略進(jìn)行深入研究，并對相應(yīng)影響機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探索。