潘騰飛 陶劍 蔣彩云 趙偉 宋兵魁 齊樹(shù)亭

摘要 脫細(xì)胞支架通常被用于輔助組織再生修復(fù)，然而脫細(xì)胞支架植入后與宿主組織間的相互作用和植入轉(zhuǎn)歸機(jī)制目前尚不清楚。為此本研究制備了牛心包脫細(xì)胞支架（S1）和牛皮脫細(xì)胞支架（S2）兩種材料，通過(guò)體外性能測(cè)定和體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)，研究脫細(xì)胞支架植入后與宿主組織之間的相互作用和其植入轉(zhuǎn)歸過(guò)程。試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種支架材料植入1個(gè)月后均能夠與比格犬自體硬腦膜組織融合生長(zhǎng)，但是S2植入3個(gè)月被完全降解，而硬腦膜缺損位置未見(jiàn)新生硬腦膜組織生成，說(shuō)明脫細(xì)胞支架與宿主組織之間成功整合并不能保證組織再生修復(fù)。脫細(xì)胞支架植入后會(huì)重啟ECM動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，脫細(xì)胞支架恢復(fù)ECM動(dòng)態(tài)平衡是其能否發(fā)揮組織再生/修復(fù)能力的必要條件。

關(guān) 鍵 詞 脫細(xì)胞支架;ECM動(dòng)態(tài)變化;修復(fù);再生;重建

中圖分類(lèi)號(hào) R332 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A

The in situ evolution process of two acellular scaffolds after surgical implantation

PAN Tengfei1，2， TAO Jian 2， JIANG Caiyun2， ZHAO Wei2， SONG Bingkui1， QI Shuting1

（1. School of Chemical Engineering， Hebei University of Technology， Tianjin 300130， China; 2. Tianjin Ouerke Medical Technology Co.， Ltd， Tianjin， 300000， China）

Abstract Acellular scaffold is usually used to assist tissue repair and regeneration. However， many problems remained. For instance， the interactions between acellular scaffolds and host tissues and the mechanism of tissue repairing and regeneration. Therefore， two kinds of acellular scaffolds were prepared， including sample 1 （S1， decellularized bovine pericardium） and sample 2 （S2， decellularized bovine skin）. The in vitro characteristics and in vivo performance in Beagles model were measured. The results showed that both of the two scaffolds were successfully integrated with beagles autologous dura after one month implantation. S1 remained its original shape after 3 months implantation， However， S2 were completely degraded after 3 months implantation. There were no newly regenerated dura tissues. The result indicated that successful integration could not guarantee tissue regeneration. The ECM dynamics would restart after surgical implantation. The ECM dynamics balance in acellular scaffolds should also be established. The restoration of ECM dynamics in acellular scaffold was necessary for tissue repairing/regeneration.

Key words acellular scaffold; ECM dynamics; repairing; regeneration; remodeling

0 引言

哺乳動(dòng)物的基質(zhì)受到嚴(yán)重?fù)p傷后不能再生[1-3]。為了輔助組織再生修復(fù)，臨床上經(jīng)常采用動(dòng)物源性脫細(xì)胞支架材料模擬受損組織的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），輔助組織再生修復(fù)[4-5]。動(dòng)物源性脫細(xì)胞支架已經(jīng)在臨床上得到廣泛應(yīng)用[6]，脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)在臨床的成功應(yīng)用表明脫細(xì)胞支架在組織修復(fù)過(guò)程中的重要潛力[7]。

軟組織修復(fù)過(guò)程通常被分解為連續(xù)又相互重疊的4個(gè)階段，包括凝血階段、炎癥階段、增生階段和重構(gòu)階段[8-10]。脫細(xì)胞支架作為ECM的模擬物，植入后會(huì)被卷入組織修復(fù)過(guò)程中，經(jīng)歷與機(jī)體自身ECM相似的生理過(guò)程。ECM一直處于降解-重構(gòu)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中（ECM動(dòng)態(tài)變化），作為細(xì)胞的主要微環(huán)境，ECM動(dòng)態(tài)過(guò)程參與眾多細(xì)胞行為包括細(xì)胞增殖、黏附、遷移、分化和死亡過(guò)程[11]，理解ECM動(dòng)態(tài)變化及其規(guī)律是組織工程和再生醫(yī)學(xué)的精髓[12]。

作為異種支架材料，脫細(xì)胞支架材料免疫原性去除通常被作為研究的重點(diǎn)，而脫細(xì)胞支架植入后與周?chē)M織的相互作用過(guò)程尚不清楚且常常被忽略。為了研究脫細(xì)胞支架與宿主組織之間相互作用規(guī)律以及影響脫細(xì)胞支架能否發(fā)揮組織修復(fù)作用的主要因素，我們采用體外及體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)，檢測(cè)脫細(xì)胞支架體外性能，觀察脫細(xì)胞支架植入轉(zhuǎn)歸過(guò)程，希望能夠找到影響脫細(xì)胞支架與宿主組織整合的主要因素，評(píng)價(jià)ECM動(dòng)態(tài)變化對(duì)脫細(xì)胞支架輔助組織再生修復(fù)過(guò)程的影響。

1 材料和方法

1.1 樣品制備

本研究制備了兩種脫細(xì)胞支架，一種為牛心包脫細(xì)胞支架（樣品1，S1），另一種為牛皮脫細(xì)胞支架（樣品2，S2）。樣品1制備過(guò)程大致如下：從屠宰場(chǎng)取材牛心包，帶回實(shí)驗(yàn)室，用鑷子去除牛心包糙面脂肪，用生理鹽水沖洗去除牛心包的組織液和血液。然后進(jìn)行脫細(xì)胞處理，牛心包脫細(xì)胞處理過(guò)程由天津歐爾克醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。牛心包脫細(xì)胞處理完成后不進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)或化學(xué)修飾，然后將脫細(xì)胞樣品裁切為6 cm×8 cm矩形，生理鹽水濕態(tài)保存于塑料袋中，最后用25 kGy 鈷60γ射線輻照滅菌。

樣品2（S2）為脫細(xì)胞牛皮，其制備過(guò)程大致如下：將新鮮牛皮取回實(shí)驗(yàn)室，去除毛發(fā)和脂肪組織，用片皮機(jī)將牛皮切割成薄層，然后進(jìn)行脫細(xì)胞處理，牛皮脫細(xì)胞處理由天津歐爾克醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行，制備完成后將牛皮用冷凍干燥機(jī)凍干，凍干過(guò)程防止塌陷。樣品裝袋后用25 kGy 鈷60γ射線滅菌。

1.2 體外理化性能

1.2.1 DNA殘留

DNA殘留量測(cè)定采用PicoGreen 熒光染色法[13-14]。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)測(cè)定過(guò)程主要包括3個(gè)步驟，分別為蛋白酶K消化、DNA提取和DNA測(cè)定。將S1及其原始組織（3個(gè)重復(fù)）用純化水沖洗3次去除氯化鈉殘留，用凍干機(jī)將樣品凍干。將各試樣剪碎，稱(chēng)取大約10 mg樣品，放入DNA free試管，用蛋白酶K消化至樣品溶解。用PreSEQTM雙鏈DNA檢測(cè)試劑盒提取樣品和DNA標(biāo)準(zhǔn)品的DNA。提取的樣品用熒光燃料染色，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)各個(gè)樣品的熒光強(qiáng)度。DNA標(biāo)準(zhǔn)品的回收率應(yīng)超過(guò)50%，r2應(yīng)大于0.95。DNA殘留量通過(guò)DNA標(biāo)準(zhǔn)品方程和回收率方程測(cè)量得出。

1.2.2 熱皺縮溫度

熱皺縮溫度可用于反映樣品的熱穩(wěn)定性。通常來(lái)說(shuō)，脫細(xì)胞支架的熱穩(wěn)定性越高，其膠原蛋白分子內(nèi)部的交聯(lián)度越高。熱皺縮溫度測(cè)定方法采用JM Lee的方法[15]，測(cè)定方法如下：將樣品裁切為3 mm×30 mm（3個(gè)重復(fù)），然后將樣品兩端連接到熱皺縮測(cè)定儀上，向燒杯中加入適量水，用燒杯將樣品浸沒(méi)，升高燒杯內(nèi)水體的溫度，溫升速率約2 ℃/min，密切觀察指針偏轉(zhuǎn)情況，當(dāng)支架材料熱變性時(shí)，樣品發(fā)生皺縮，帶動(dòng)指針偏轉(zhuǎn)，記錄此時(shí)水體溫度即為該樣品的熱皺縮溫度。

1.2.3 抗膠原酶酶解能力

抗膠原蛋白酶酶解能力采用細(xì)菌膠原蛋白酶（Sigma-Aldrich >125 CDU/mg）酶解樣品，通過(guò)酶解所需時(shí)間反應(yīng)試樣的抗酶解能力。測(cè)定過(guò)程如下，無(wú)菌操作將樣品裁切為1 cm×1 cm 矩形，將樣品（3個(gè)重復(fù)）放于0.1 mg/mL 膠原蛋白酶溶液（0.01 mol/L Tris-HCL，pH 7.2， 50 mmol/L CaCl2）中浸泡0～200 h。膠原酶溶液使用前須用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。每2 h檢查樣品外觀，當(dāng)樣品完全溶解于溶液中時(shí)，記錄樣品完全溶解所需時(shí)間。

1.2.4 體外細(xì)胞毒性

體外細(xì)胞毒性采用ISO10993.5—2009附錄C中MTT方法進(jìn)行測(cè)定[16]。體外細(xì)胞毒性可用來(lái)反映支架材料的可濾瀝物。樣品浸提液制備方法參照ISO10993.12—2012制備[17]，具體來(lái)說(shuō)，按照樣品表面積/萃取液為3 cm2/mL、（ 37±1） ℃浸泡（24±2） h制備檢驗(yàn)液。采用康寧細(xì)胞培養(yǎng)瓶碎片顆粒作為陰性對(duì)照。采用含有5%二甲基亞砜的RPMI 1640培養(yǎng)基作為陽(yáng)性對(duì)照。復(fù)蘇L929小鼠成纖維細(xì)胞，待細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用胰蛋白酶酶解，制備得到1×104 個(gè)/mL細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液加入至96孔板中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，此時(shí)細(xì)胞沉底，貼附于孔板底表面，吸棄培養(yǎng)基更換為樣品浸提液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，加入20 μL、5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL的DMSO，震蕩均勻后于570 nm測(cè)定吸光度。細(xì)胞增殖率（V，%）按照下式計(jì)算：

式中：A570e和A570b為試驗(yàn)品和空白對(duì)照品的吸光度。細(xì)胞增殖率越低，表明樣品的細(xì)胞毒性越強(qiáng)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，細(xì)胞增殖率高于90%時(shí)，認(rèn)為樣品無(wú)細(xì)胞毒性，細(xì)胞毒性為1級(jí)。

1.3 體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)研究

兩種脫細(xì)胞支架材料與硬腦膜組織在結(jié)構(gòu)上相似[18]，且都是由Ⅰ型膠原蛋白組成[19]，因此本研究通過(guò)比格犬硬腦膜修復(fù)試驗(yàn)，研究?jī)煞N脫細(xì)胞支架對(duì)硬腦膜組織缺損的修復(fù)過(guò)程。

動(dòng)物原位植入試驗(yàn)設(shè)置1個(gè)月、2個(gè)月和3個(gè)月3個(gè)植入期，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)植入4只試驗(yàn)動(dòng)物。植入期結(jié)束后處死試驗(yàn)動(dòng)物，通過(guò)大體解剖和病理制片評(píng)價(jià)試樣與比格犬硬腦膜組織之間的相互作用，評(píng)價(jià)脫細(xì)胞支架的整合、降解、再生以及試樣與周?chē)M織的病理反應(yīng)情況。

動(dòng)物原位植入試驗(yàn)植入過(guò)程如下：采用鹽酸氯胺酮（50 mg/kg）和速眠新Ⅱ（50 mg/kg）肌肉注射全麻試驗(yàn)動(dòng)物，麻醉后將比格犬呈俯臥位綁于手術(shù)臺(tái)上，頭皮備皮后用碘伏充分消毒，鋪無(wú)菌巾。沿頭頂正中縱向切開(kāi)頭皮和頭部肌肉組織，雙極電灼止血，用骨膜分離器分離肌肉組織，暴露顱骨。用電動(dòng)高速磨鉆于顱骨中線旁約1 cm處分別磨開(kāi)2個(gè)大小約4 cm × 3 cm的骨窗，骨蠟止血。取下骨組織，暴露比格犬自體硬腦膜（圖1a）），用眼科剪制造硬腦膜缺損（圖1b）），雙極電凝徹底止血，避免腦積水等并發(fā)癥發(fā)生。

將樣品裁剪為對(duì)應(yīng)形狀，光面朝內(nèi)貼附于大腦硬腦膜缺損處（圖1c）），樣品與比格犬硬腦膜缺損邊緣重疊約0.3 cm。手術(shù)結(jié)束后將動(dòng)物放回飼養(yǎng)室，肌肉注射慶大霉素（4 000 U/kg）預(yù)防手術(shù)創(chuàng)口感染。飼養(yǎng)員定期觀察動(dòng)物術(shù)后有無(wú)正常進(jìn)食、飲水及有無(wú)中樞神經(jīng)損傷引起的運(yùn)動(dòng)障礙等。

飼養(yǎng)期到期后，對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物執(zhí)行安樂(lè)死。解剖觀察手術(shù)創(chuàng)口愈合，試樣降解吸收，并發(fā)癥以及黏連情況等。將解剖取下的硬腦膜替代物及周?chē)M織用福爾馬林固定，病理制片，通過(guò)組織病理制片評(píng)價(jià)脫細(xì)胞支架與比格犬自體硬腦膜整合情況，觀察比格犬自體硬腦膜是否有降解或再生，評(píng)價(jià)脫細(xì)胞支架與其周?chē)M織的植入病理狀況。

2 結(jié)果

2.1 DNA殘留量

由于核酸（DNA）具有黏性，最難從組織中去除[20]，因此采用DNA殘留量來(lái)定量反映動(dòng)物組織的脫細(xì)胞處理效率。

動(dòng)物組織及其脫細(xì)胞后DNA殘留量結(jié)果如圖2所示。牛心包組織（脫細(xì)胞處理前）的DNA殘留量為（845.0±144.6） ng/mg干重，牛心包脫細(xì)胞支架（S1）的DNA殘留量為（4.31±0.13） ng/mg。牛皮組織（脫細(xì)胞處理前）的DNA殘留量為（687.8±82.0） ng/mg干重，其脫細(xì)胞支架（S2）的DNA殘留量為（44.04±1.07） ng/mg。據(jù)報(bào)道DNA殘留量小于50 ng/mg時(shí)，機(jī)體對(duì)脫細(xì)胞支架不會(huì)產(chǎn)生明顯細(xì)胞或組織排異反應(yīng)[21]。兩種脫細(xì)胞支架的DNA殘留量均在可接受范圍內(nèi)，所以?xún)煞N脫細(xì)胞支架的抗原成分均已經(jīng)得到有效去除，理論上來(lái)說(shuō)，植入后不會(huì)產(chǎn)生明顯免疫排斥反應(yīng)。

2.2 熱皺縮溫度和抗酶解性能

膠原蛋白的特征性三螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)于其生物活性具有重要影響，S1（牛心包）和S2（牛皮）的熱皺縮溫度分別為（60±1.2） ℃和（61±0.9） ℃，兩種材料的熱皺縮溫度均較高，說(shuō)明2種脫細(xì)胞支架的膠原蛋白均沒(méi)有發(fā)生變性，兩種脫細(xì)胞支架材料均保留著基于膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的生物活性。

本試驗(yàn)采用細(xì)菌膠原蛋白酶浸泡兩種脫細(xì)胞支架，通過(guò)測(cè)量試樣從浸泡開(kāi)始至其完全被酶解的時(shí)間，定量表征試樣的抗酶解能力。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，S1樣品的抗酶解時(shí)間為56 h，S2的抗酶解時(shí)間是24 h，2種樣品的細(xì)菌膠原蛋白酶酶解試驗(yàn)顯示，在體外降解試驗(yàn)中，S2比S1更易于被酶解，根據(jù)體外酶解試驗(yàn)，推測(cè)S2原位植入后比S1更加易于被酶解。

熱皺縮溫度結(jié)果表明兩種脫細(xì)胞支架具有相似的熱穩(wěn)定性，然而它們的抗酶解能力差異較大，樣品2更易于被酶解。

2.3 體外細(xì)胞毒性

體外細(xì)胞毒性結(jié)果顯示S1（牛心包）和S2（牛皮）的細(xì)胞增殖率分別為（93.4±2.5）% 和 （90.2±3.1）%（3個(gè)重復(fù)）。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的細(xì)胞增殖率分別為（95.1±4.1）% 和 （10.9±1.6）%（圖3）。陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照結(jié)果顯示細(xì)胞毒性測(cè)試試驗(yàn)結(jié)果成立，兩種脫細(xì)胞支架的細(xì)胞增殖率都高于90%，細(xì)胞毒性分級(jí)均為1級(jí)，說(shuō)明兩種脫細(xì)胞支架基本無(wú)有毒有害可瀝濾物析出，脫細(xì)胞支架在組織生化處理過(guò)程中無(wú)有毒有害化學(xué)物質(zhì)殘留。

2.4 掃描電鏡結(jié)果

兩種樣品的掃描電鏡結(jié)果如圖4所示，從圖4a）與圖4b）、圖4c）與圖4d）的對(duì)比可明顯看出，S1（牛心包）的孔徑較S2（牛皮）致密，S1的平均孔徑大小約為2 μm，低于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞直徑，此外S1的兩面在孔徑和外觀方面有較大差異，光滑面相比粗糙面膠原纖維結(jié)構(gòu)更加規(guī)則和致密。與S1試驗(yàn)結(jié)果相反，S2的孔徑大約有15 μm，略高于細(xì)胞平均直徑，因此大部分細(xì)胞可自由遷移進(jìn)入S2脫細(xì)胞支架內(nèi)部。

2.5 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)動(dòng)物均存活至指定時(shí)間節(jié)點(diǎn)，所有動(dòng)物無(wú)術(shù)中和術(shù)后死亡。動(dòng)物手術(shù)后2 ～ 5 d后恢復(fù)常規(guī)飲食，未見(jiàn)有炎癥、出血、腦脊液滲漏、水腫、癲癇等不良反應(yīng)。

2.5.1 大體解剖

植入1個(gè)月大體解剖結(jié)果顯示，S1（牛心包）和S2（牛皮）均與宿主硬腦膜組織整合生長(zhǎng)（圖5 a）， b））。兩種樣品與比格犬自體硬腦膜整合位置連續(xù)、緊密，無(wú)滲漏。植入物周?chē)鸁o(wú)組織炎癥或壞死，兩種支架與腦組織間有輕微黏連，可用鑷子輕易分離。

植入2個(gè)月，兩種脫細(xì)胞支架的大體解剖結(jié)果與植入1個(gè)月結(jié)果相似，兩種樣品均與比格犬硬腦膜整合生長(zhǎng)，S1（牛心包）植入2個(gè)月外觀呈乳白色，未見(jiàn)降解，此外S1內(nèi)部無(wú)明顯血管化（圖5 c））。從整合效果上來(lái)看，S1與比格犬自體硬腦膜融合生長(zhǎng)位置光滑，連接緊密，鑷子難以撕裂，說(shuō)明S1與比格犬自體硬腦膜融合生長(zhǎng)部位已經(jīng)被較好重構(gòu)，相反S2雖然也顯示與比格犬自體硬腦膜融合生長(zhǎng)，但是其機(jī)械性能大幅度降低，在解剖過(guò)程中，即使非常謹(jǐn)慎，仍然造成樣品撕裂（圖5 d））。

植入3個(gè)月，S1（牛心包）大體外觀無(wú)明顯改變，樣品無(wú)明顯降解，樣品與比格犬自體硬腦膜融合生長(zhǎng)位置連接緊密強(qiáng)度高，難以用鑷子撕裂（圖5 e））。相比S1完整的外形結(jié)構(gòu)和較高的機(jī)械強(qiáng)度，S2（牛皮）植入3個(gè)月已經(jīng)完全不可見(jiàn)，材料已經(jīng)被完全降解。S2降解后留下一個(gè)空洞，植入位置未見(jiàn)新生硬腦膜組織，可見(jiàn)植入時(shí)取下又放回的顱骨瓣（圖5 f）），顱骨瓣與硬腦膜組織之間形成纖維瘢痕組織，難以與比格犬自體硬腦膜分離。

2.5.2 組織病理結(jié)果

與大體解剖結(jié)果相對(duì)應(yīng)，植入1個(gè)月病理結(jié)果顯示，兩種樣品均與比格犬自體硬腦膜融合生長(zhǎng)，兩種樣品均保持原結(jié)構(gòu)，周?chē)鶡o(wú)纖維包裹，無(wú)明顯降解，試樣與周?chē)M織無(wú)明顯炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)（圖6 a），b））。S1（牛心包）較比格犬自體硬腦膜厚度更厚，S1表層可見(jiàn)細(xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)部無(wú)細(xì)胞浸潤(rùn)，也無(wú)血管化。S2全層可見(jiàn)細(xì)胞浸潤(rùn)（圖6b）），整合區(qū)域可見(jiàn)類(lèi)似肉芽組織結(jié)構(gòu)。

植入2個(gè)月病理結(jié)果顯示，S1與周?chē)材X膜組織及大腦組織間無(wú)炎癥反應(yīng)，成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)S1樣品厚度的一半，基本無(wú)毛細(xì)血管（圖6c））。植入2個(gè)月，S2全層可見(jiàn)宿主細(xì)胞浸潤(rùn)，樣品組織病理顯示原始結(jié)構(gòu)被改變，顯示材料被部分降解（圖6d））。S2（牛皮）植入2個(gè)月結(jié)果可見(jiàn)局部鈣化，樣品1中未見(jiàn)。

植入3個(gè)月，S2的H&E病理染色圖（圖6f））結(jié)果中未見(jiàn)其特征性的纖維結(jié)構(gòu)，病理結(jié)果與大體解剖結(jié)果一致，說(shuō)明補(bǔ)片已經(jīng)被降解。S1的全層已經(jīng)被成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)，補(bǔ)片保持原來(lái)形狀，S1未見(jiàn)明顯降解（圖6e）），結(jié)合大體解剖結(jié)果，補(bǔ)片整合生長(zhǎng)部位已經(jīng)被重構(gòu)為光滑的結(jié)締組織，組織周?chē)矡o(wú)炎癥反應(yīng)，說(shuō)明S1已經(jīng)進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)。

3 討論

3.1 體外性能與體內(nèi)植入性能之間的聯(lián)系

脫細(xì)胞支架的體外性能對(duì)其體內(nèi)生物學(xué)相容性、組織再生修復(fù)活性有重要影響，通過(guò)本試驗(yàn)中S1和S2的體外性能能夠推測(cè)的重要的體內(nèi)性能如表1所示。

膠原蛋白的生理活性是基于其特征性三螺旋結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的，熱皺縮溫度能夠反映膠原蛋白是否已經(jīng)發(fā)生變性。本試驗(yàn)中，兩種支架材料的熱皺縮溫度高于膠原蛋白分子的變性溫度，說(shuō)明兩種脫細(xì)胞支架均保留了膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)，兩種材料保留了膠原蛋白的生物活性。

抗酶解性能與脫細(xì)胞支架材料的交聯(lián)度有密切的關(guān)系。在生物體內(nèi)，原膠原分子之間的交聯(lián)通過(guò)賴(lài)氨酸氧化酶實(shí)現(xiàn)共價(jià)交聯(lián)[22]。在體外，可以利用化學(xué)交聯(lián)劑如戊二醛、碳化二亞胺（EDC）等實(shí)現(xiàn)膠原蛋白分子內(nèi)交聯(lián)，脫細(xì)胞支架的穩(wěn)定性是由其膠原蛋白分子內(nèi)部交聯(lián)度決定的[23]。一般來(lái)講，交聯(lián)度越高其熱穩(wěn)定性越高，抗酶解性能也越強(qiáng)，另外膠原蛋白交聯(lián)度隨年齡增長(zhǎng)而增高。細(xì)胞外支架的交聯(lián)度越高其抗酶解性能越強(qiáng)，脫細(xì)胞支架的降解速度越慢。

孔徑是另一重要的體外性能指標(biāo)，當(dāng)脫細(xì)胞支架的孔徑大于細(xì)胞平均直徑時(shí)，細(xì)胞能夠自由遷移進(jìn)入脫細(xì)胞支架內(nèi)部。然而脫細(xì)胞支架不具有區(qū)分進(jìn)入其內(nèi)部細(xì)胞類(lèi)型的能力。脫細(xì)胞支架植入后，周?chē)拗鹘M織進(jìn)入組織修復(fù)過(guò)程，組織修復(fù)過(guò)程包括出血、炎癥、增生和重構(gòu)4個(gè)階段，每個(gè)階段參與的細(xì)胞種類(lèi)、數(shù)量和其生理功能各不相同，例如出血階段以血小板和紅細(xì)胞為主，炎癥階段以中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，增生階段和重構(gòu)階段以成纖維細(xì)胞為主[24]。在組織修復(fù)過(guò)程中，炎癥階段的中性粒白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞具有分泌基質(zhì)金屬蛋白酶的能力，能夠酶解脫細(xì)胞支架，對(duì)其輔助組織再生修復(fù)具有較大影響，如果脫細(xì)胞支架孔徑遠(yuǎn)大于宿主組織中炎癥細(xì)胞的直徑，炎癥細(xì)胞可自由進(jìn)入脫細(xì)胞支架內(nèi)部，容易導(dǎo)致脫細(xì)胞支架被過(guò)早酶解，造成其組織再生修復(fù)過(guò)程的失敗。

根據(jù)目前的研究進(jìn)展，脫細(xì)胞支架的一些體外性能對(duì)其體內(nèi)生物學(xué)活性有決定性影響，例如脫細(xì)胞支架中，保持膠原蛋白的特征性三螺旋結(jié)構(gòu)是促凝血性能的重要保證;保留膠原蛋白的自由氨基是保證其與宿主組織整合的必要條件[25];脫細(xì)胞支架中殘留外源DNA含量的高低通常代表了組織脫細(xì)胞效率和材料的免疫原性，過(guò)量DNA殘留會(huì)使材料植入后影響宿主周?chē)M織的修復(fù)過(guò)程，延長(zhǎng)炎癥反應(yīng)階段的時(shí)間;體外細(xì)胞毒性通常代表材料毒性化學(xué)物質(zhì)的殘留，這會(huì)影響脫細(xì)胞支架的生物學(xué)相容性，因此脫細(xì)胞支架的體外性能對(duì)體內(nèi)生物活性、生物學(xué)性能、組織再生修復(fù)活性等有重要影響。因此在制備脫細(xì)胞支架時(shí)，應(yīng)首先對(duì)制備的脫細(xì)胞支架的這些重要的體外性能進(jìn)行表征，脫細(xì)胞支架的體外性能測(cè)試是其體內(nèi)原位輔助組織再生修復(fù)功能的重要前提。

綜上所述，根據(jù)體外性能測(cè)試結(jié)果，兩種脫細(xì)胞支架材料的膠原蛋白均未變性;DNA殘留量結(jié)果顯示兩種材料抗原成分有效去除;體外細(xì)胞毒性通過(guò)測(cè)定浸提液的方法進(jìn)行，測(cè)定結(jié)果表明兩種脫細(xì)胞支架材料中無(wú)有毒有害化學(xué)可濾瀝物釋放。體外測(cè)試結(jié)果表明兩種材料能夠滿(mǎn)足體內(nèi)原位植入基本要求。

3.2 脫細(xì)胞支架整合與輔助組織再生的關(guān)系

根據(jù)組織修復(fù)過(guò)程的特點(diǎn)，軟組織修復(fù)過(guò)程分為4個(gè)連續(xù)而又重疊的階段。脫細(xì)胞支架通過(guò)外科方式植入后，勢(shì)必引起宿主組織損傷，并開(kāi)啟組織修復(fù)過(guò)程。脫細(xì)胞支架將會(huì)被迫融入宿主組織修復(fù)過(guò)程中。

脫細(xì)胞支架取材于動(dòng)物源性組織，其生理活性與供體動(dòng)物組織的生理狀態(tài)相一致。通常脫細(xì)胞支架取材于動(dòng)物源性正常成熟組織。脫細(xì)胞支架植入后會(huì)融入宿主組織ECM動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中，被宿主組織的生理狀態(tài)影響和改變。在凝血階段，由于手術(shù)植入損傷，組織觸發(fā)凝血過(guò)程。凝血過(guò)程形成的血栓一方面有利于止血，防止血液過(guò)量流失，另一方面凝血作用形成的血栓能夠通過(guò)物理吸附和共價(jià)交聯(lián)的方式連接脫細(xì)胞支架與宿主組織，脫細(xì)胞支架與宿主之間建立的穩(wěn)定連接有助于后續(xù)多種生理活動(dòng)例如血管形成和整合。

本試驗(yàn)中，植入1個(gè)月的大體解剖和病理染色結(jié)果顯示，兩種樣品均能夠與宿主組織整合生長(zhǎng)。脫細(xì)胞支架與比格犬自體硬腦膜的整合說(shuō)明脫細(xì)胞支架已經(jīng)融入比格犬自體硬腦膜ECM動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中，脫細(xì)胞支架與比格犬自體硬腦膜之間已經(jīng)通過(guò)賴(lài)氨酸氧化酶催化形成共價(jià)交聯(lián)。ECM動(dòng)態(tài)變化過(guò)程包括ECM成分的合成和降解兩部分，ECM支架合成需要成纖維細(xì)胞遷移進(jìn)入脫細(xì)胞支架內(nèi)部，啟動(dòng)膠原蛋白合成和分泌。

脫細(xì)胞支架孔徑的大小對(duì)于其原位重構(gòu)有重要影響。在炎癥反應(yīng)階段，當(dāng)脫細(xì)胞支架的孔徑大于細(xì)胞平均直徑時(shí)，炎癥細(xì)胞例如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等能夠自由進(jìn)入脫細(xì)胞支架內(nèi)部，分泌膠原蛋白酶，加速脫細(xì)胞支架的降解過(guò)程。ECM的體內(nèi)降解是在基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinase， MMP）介導(dǎo)下進(jìn)行的。在炎癥反應(yīng)階段，組織內(nèi)部變化劇烈，凝血階段形成的血栓會(huì)逐步轉(zhuǎn)化為肉芽組織，相應(yīng)地其ECM支架將由血栓的纖維蛋白轉(zhuǎn)化為以I型和III型膠原蛋白為主的肉芽組織。ECM的劇烈變化需要高濃度的MMP[26，27]。剛植入的脫細(xì)胞支架需要承受炎癥反應(yīng)過(guò)程中過(guò)量基質(zhì)金屬蛋白酶的影響，脫細(xì)胞支架中殘留抗原成分、支架膠原損傷、支架內(nèi)膠原蛋白組成差異以及手術(shù)損傷等均會(huì)促使宿主組織細(xì)胞啟動(dòng)MMP的合成和分泌。在眾多種類(lèi)的MMP當(dāng)中，MMP-1、MMP-8和MMP-13能夠?qū)γ摷?xì)胞支架起到直接的酶解作用[28-30]。脫細(xì)胞支架應(yīng)具有一定抗酶解性能，例如膠原蛋白海綿皮膚替代物的半降解周期為（2±1）周[31]，否則膠原蛋白海綿不具有輔助皮膚組織再生修復(fù)的功能。本試驗(yàn)中S1孔徑較小，S1全層被細(xì)胞浸潤(rùn)需要3個(gè)月時(shí)間，S2由于孔徑大于一般細(xì)胞直徑，因此其植入1個(gè)月即可見(jiàn)全層細(xì)胞浸潤(rùn)?？讖捷^大的脫細(xì)胞支架雖然有利于細(xì)胞的遷移進(jìn)入，但是脫細(xì)胞支架不具有區(qū)分進(jìn)入其內(nèi)部細(xì)胞的種類(lèi)的能力，在炎癥階段，大量炎癥細(xì)胞的進(jìn)入容易導(dǎo)致脫細(xì)胞支架被過(guò)早酶解，可能導(dǎo)致脫細(xì)胞支架被過(guò)早酶解失效。

植入1個(gè)月時(shí)，兩種樣品均能與比格犬硬腦膜組織融合生長(zhǎng)，并且脫細(xì)胞支架與比格犬自體硬腦膜組織之間無(wú)明顯炎癥反應(yīng)，說(shuō)明兩種脫細(xì)胞支架周?chē)M織進(jìn)入組織增生階段。在組織增生階段，組織內(nèi)部MMP分泌量降低，能夠合成ECM組分的成纖維細(xì)胞數(shù)量增多，因此在增生階段，脫細(xì)胞支架受到的酶解作用降低，脫細(xì)胞支架不易被酶解，然而S2的原位植入試驗(yàn)結(jié)果顯示，即使在樣品植入2個(gè)月，比格犬硬腦膜組織已經(jīng)進(jìn)入了組織增生和重構(gòu)階段后，S2最終仍然在第3個(gè)月被完全降解，說(shuō)明成功整合并不能保證其組織修復(fù)重建性能，脫細(xì)胞支架內(nèi)部還應(yīng)建立ECM動(dòng)態(tài)平衡，防止其被過(guò)度降解而失效。

3.3 脫細(xì)胞支架恢復(fù)ECM動(dòng)態(tài)平衡的意義

脫細(xì)胞支架植入后，隨著宿主細(xì)胞遷移進(jìn)入脫細(xì)胞支架內(nèi)部，脫細(xì)胞支架重啟ECM動(dòng)態(tài)過(guò)程，此時(shí)ECM動(dòng)態(tài)過(guò)程尚不平衡。ECM動(dòng)態(tài)平衡是由細(xì)胞精確調(diào)控，包括MMP在基因水平以及MMP和TIMP水平的調(diào)控。一般來(lái)講，系統(tǒng)都有自身調(diào)控能力，例如生態(tài)系統(tǒng)具有其自身的調(diào)節(jié)控制能力，但是如果系統(tǒng)內(nèi)或系統(tǒng)外影響過(guò)大時(shí)，整個(gè)系統(tǒng)將失去平衡，例如水體生態(tài)系統(tǒng)具有污染物自?xún)艄δ埽侨绻绊懗^(guò)了系統(tǒng)的自身調(diào)節(jié)能力，系統(tǒng)將失去自我調(diào)節(jié)能力。ECM動(dòng)態(tài)平衡系統(tǒng)也遵循相同的規(guī)律，當(dāng)影響ECM動(dòng)態(tài)平衡的因素超過(guò)其自身修復(fù)能力，例如脫細(xì)胞支架殘留細(xì)胞，導(dǎo)致過(guò)度免疫原性，脫細(xì)胞支架內(nèi)部無(wú)法形成ECM動(dòng)態(tài)平衡，最終會(huì)造成脫細(xì)胞支架的徹底降解。

脫細(xì)胞植入后，如果被宿主細(xì)胞認(rèn)為“新ECM成分”，脫細(xì)胞支架將會(huì)在賴(lài)氨酸氧化酶等的介導(dǎo)下，被共價(jià)交聯(lián)于其自身ECM上，完成脫細(xì)胞支架的整合。脫細(xì)胞支架與宿主組織的順利整合能夠保證后續(xù)血管化以及組織重構(gòu)過(guò)程的順利進(jìn)行，所以整合是后續(xù)重構(gòu)過(guò)程的前提。

脫細(xì)胞支架與宿主組織的成功整合，為宿主細(xì)胞遷移進(jìn)入脫細(xì)胞支架內(nèi)部，從而重啟脫細(xì)胞支架的ECM動(dòng)態(tài)平衡提供條件。然而脫細(xì)胞支架的ECM動(dòng)態(tài)變化過(guò)程會(huì)受到炎癥反應(yīng)階段的強(qiáng)烈干擾，炎癥細(xì)胞會(huì)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，對(duì)脫細(xì)胞支架起到強(qiáng)烈的酶解作用，容易導(dǎo)致脫細(xì)胞支架輔助組織再生修復(fù)功能的失效。

脫細(xì)胞支架經(jīng)過(guò)了宿主組織的炎癥反應(yīng)階段，到達(dá)組織增生和重構(gòu)階段后，也不能保證脫細(xì)胞支架ECM動(dòng)態(tài)恢復(fù)平衡，例如本試驗(yàn)中，S2（牛皮）雖然能夠與宿主整合并通過(guò)炎癥反應(yīng)階段，但是其在植入3個(gè)月后仍然被完全降解，而比格犬硬腦膜缺損位置也沒(méi)有新生硬腦膜組織，說(shuō)明S2中始終未能建立起ECM動(dòng)態(tài)平衡，最終導(dǎo)致脫細(xì)胞支架輔助組織再生修復(fù)過(guò)程的失敗。S1能夠與比格犬自體硬腦膜組織成功整合，且其整合位置光滑，脫細(xì)胞支架與比格犬自體硬腦膜之間機(jī)械強(qiáng)度較高，整合位置可見(jiàn)成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)炎癥細(xì)胞，說(shuō)明補(bǔ)片被部分重構(gòu)，并進(jìn)入了穩(wěn)定狀態(tài)。

即使脫細(xì)胞支架能夠與周?chē)M織建立起ECM動(dòng)態(tài)平衡也不能保證組織再生修復(fù)，例如在正常皮膚組織的損傷修復(fù)過(guò)程中，如果皮膚損傷較嚴(yán)重，創(chuàng)傷肉芽組織雖然保證ECM動(dòng)態(tài)平衡，但是其結(jié)局通常為疤痕組織形成，無(wú)法形成功能性組織。脫細(xì)胞支架與宿主組織整合生長(zhǎng)之后，脫細(xì)胞支架的結(jié)局可能為：部分重構(gòu)、組織再生或疤痕組織形成（圖7）。脫細(xì)胞支架植入后，應(yīng)該首先保證脫細(xì)胞支架能夠形成ECM動(dòng)態(tài)平衡，這是保證其能否發(fā)揮組織再生修復(fù)功能的必要條件。

4 結(jié)論

脫細(xì)胞支架植入后隨著宿主細(xì)胞遷移進(jìn)入其內(nèi)部，逐漸恢復(fù)自身ECM動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。脫細(xì)胞支架的ECM動(dòng)態(tài)平衡恢復(fù)過(guò)程中，炎癥反應(yīng)階段的炎癥細(xì)胞和高M(jìn)MP表達(dá)水平容易導(dǎo)致脫細(xì)胞支架的酶解失效。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，脫細(xì)胞支架（S2）雖然能夠與比格犬自體硬腦膜組織整合生長(zhǎng)，但是其最終仍然被機(jī)體降解，因此脫細(xì)胞支架與宿主組織成功整合生長(zhǎng)不能保證脫細(xì)胞支架具有輔助組織再生修復(fù)的能力。脫細(xì)胞支架輔助組織再生修復(fù)功能發(fā)揮還需要在其內(nèi)部建立ECM動(dòng)態(tài)平衡，脫細(xì)胞支架內(nèi)部能否恢復(fù)ECM動(dòng)態(tài)平衡是其能否發(fā)揮組織再生/修復(fù)能力的必要條件。

參考文獻(xiàn)：

[1] ? ?CHAMBERLAIN L J，YANNAS I V，HSU H P，et al. Connective tissue response to tubular implants for peripheral nerve regeneration：The role of myofibroblasts[J]. The Journal of Comparative Neurology，2000，417（4）：415-430.

[2] ? ?YANNAS I V. Regeneration of a peripheral nerve[M]//Tissue and Organ Regeneration in Adults. New York，NY：Springer New York，2014：137-178.

[3] ? ?STEMERMAN M B，SPAET T H，PITLICK F，et al. Intimal healing. The pattern of reendothelialization and intimal thickening[J]. The American Journal of Pathology，1977，87（1）：125-142.

[4] ? ?ZHONG S P，ZHANG Y Z，LIM C T. Tissue scaffolds for skin wound healing and dermal reconstruction[J]. Wiley Interdisciplinary Reviews：Nanomedicine and Nanobiotechnology，2010，2（5）：510-525.

[5] ? ?SCHULTZ G S，WYSOCKI A. Interactions between extracellular matrix and growth factors in wound healing[J]. Wound Repair and Regeneration，2009，17（2）：153-162.

[6] ? ?YU Y L，ALKHAWAJI A，DING Y Q，et al. Decellularized scaffolds in regenerative medicine[J]. Oncotarget，2016，7（36）：DOI：10. 18632/oncotarget. 10945.

[7] ? ?ZHANG M C，LIU X，JIN Y，et al. Lamellar keratoplasty treatment of fungal corneal ulcers with acellular porcine corneal stroma[J]. American Journal of Transplantation，2015，15（4）：1068-1075.

[8] ? ?DIEGELMANN R F. Wound healing：an overview of acute，fibrotic and delayed healing[J]. Frontiers in Bioscience，2004，9（1/2/3）：283.

[9] ? ?H?MMERLE C H F，GIANNOBILE W V，Biology of soft tissue wound healing and regeneration - Consensus Report of Group 1 of the 10th European Workshop on Periodontology[J]. Journal of Clinical Periodontology，2014，41：S1-S5.

[10] ?VELNAR T，BAILEY T，SMRKOLJ V. The wound healing process：an overview of the cellular and molecular mechanisms[J]. Journal of International Medical Research，2009，37（5）：1528-1542.

[11] ?SCHULTZ G S，WYSOCKI A. Interactions between extracellular matrix and growth factors in wound healing[J]. Wound Repair and Regeneration，2009，17（2）：153-162.

[12] ?LU P，TAKAI K，WEAVER V M，et al. Extracellular matrix degradation and remodeling in development and disease[J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology，2011，3（12）：a005058.

[13] ?YY/T 0606. 25-2014，組織工程醫(yī)療產(chǎn)品 第25部分 動(dòng)物源性生物材料DNA殘留量測(cè)定法：熒光染色法[S].

[14] ?徐麗明，邵安良，趙艷紅. 動(dòng)物源性生物材料殘留DNA的定量檢測(cè)法[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2012，29（3）：479-485.

[15] ?LEE J M，EDWARDS H H L，PEREIRA C A，et al. Crosslinking of tissue-derived biomaterials in 1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）-carbodiimide （EDC）[J]. Journal of Materials Science：Materials in Medicine，1996，7（9）：531-541.

[16] ?ISO 10993.5—2009 Biological evaluation of medical devices part 5-Tests for in vitro cytotoxicity[S].

[17] ?ISO 10993.12—2012 Biological evaluation of medical devices part 12-Sample preparation and reference materials[S].

[18] ?SELLARO T L，HILDEBRAND D，LU Q J，et al. Effects of collagen fiber orientation on the response of biologically derived soft tissue biomaterials to cyclic loading[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part A，2007，80A（1）：194-205.

[19] ?KAWAMOTO H，UOZUMI T，KAWAMOTO K，et al. Type IV collagenase activity and cavernous sinus invasion in human pituitary adenomas[J]. Acta Neurochirurgica，1996，138（4）：390-395.

[20] ?LIN X F，F(xiàn)ANG X Q，WANG Q，et al. Decellularized allogeneic intervertebral disc：natural biomaterials for regenerating disc degeneration[J]. Oncotarget，2016，7（11）：DOI：10. 18632/oncotarget. 7735.

[21] ?CRAPO P M，GILBERT T W，BADYLAK S F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes[J]. Biomaterials，2011，32（12）：3233-3243.

[22] ?LUCERO H A，KAGAN H M. Lysyl oxidase：an oxidative enzyme and effector of cell function[J]. Cellular and Molecular Life Sciences，2006，63（19/20）：2304-2316.

[23] ?NYMAN J S，ROY A，ACUNA R L，et al. Age-related effect on the concentration of collagen crosslinks in human osteonal and interstitial bone tissue[J]. Bone，2006，39（6）：1210-1217.

[24] ?VELNAR T，BAILEY T，SMRKOLJ V. The wound healing process：an overview of the cellular and molecular mechanisms[J]. Journal of International Medical Research，2009，37（5）：1528-1542.

[25] ?PAN T F，TAO J，MENG Q Q，et al. Importance of the free amine groups in acellular scaffold during tissue repairing or regeneration process[J]. Journal of Biomaterials Applications，2019，34（1）：25-35.

[26] ?WALL S，MURPHY G. Matrix metalloproteinase expression in impaired wound healing[J]. International Journal of Experimental Pathology，2008，81（1）：A27-A28.

[27] ?LORENZL S，ALBERS D S，RELKIN N，et al. Increased plasma levels of matrix metalloproteinase-9 in patients with Alzheimer's disease[J]. Neurochemistry International，2003，43（3）：191-196.

[28] ?XUE M L，JACKSON C J. Extracellular matrix reorganization during wound healing and its impact on abnormal scarring[J]. Advances in Wound Care，2015，4（3）：119-136.

[29] ?VISSE R，NAGASE H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases[J]. Circulation Research，2003，92（8）：827-839.

[30] ?VINCENTI M P，BRINCKERHOFF C E. Transcriptional regulation of collagenase （MMP-1，MMP-13） genes in arthritis：integration of complex signaling pathways for the recruitment of gene-specific transcription factors[J]. Arthritis Research & Therapy，2001，4（3）：1-8.

[31] ?YANNAS I V，TZERANIS D S，HARLEY B A，et al. Biologically active collagen-based scaffolds：advances in processing and characterization[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society A：Mathematical，Physical and Engineering Sciences，2010，368（1917）：2123-2139.

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