劉季紅，靳 焜，劉 濤

(1.大連理工大學(xué) 分析測(cè)試中心，遼寧 大連 116024； 2.大連理工大學(xué) 精細(xì)化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116024)

脯氨酸(proline，Pro)作為一種天然氨基酸,廣泛存在于動(dòng)、植物中.它不僅可以參與蛋白質(zhì)的合成，還可以作為細(xì)胞內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì).例如，植物在抗鹽脅迫(干旱、鹽漬等)條件下，體內(nèi)會(huì)大量累計(jì)脯氨酸[1].而在動(dòng)物體內(nèi),脯氨酸對(duì)牙釉質(zhì)的修復(fù)具有很重要的作用[2].脯氨酸不同于一般的α-氨基酸，結(jié)構(gòu)非常獨(dú)特，其側(cè)鏈氨基與原子骨架形成了吡咯烷環(huán).基于脯氨酸的重要作用，開展了許多針對(duì)其構(gòu)象的研究，但這些成果主要集中采用紅外和拉曼光譜的表征[3],而如何利用核磁共振技術(shù)對(duì)氨基酸的手性進(jìn)行鑒別卻鮮有報(bào)道.

核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)可以在近似生理環(huán)境下對(duì)樣品進(jìn)行無(wú)損檢測(cè)，檢測(cè)方法具有多樣性，提供豐富的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，反映出大量的結(jié)構(gòu)信息，在分子結(jié)構(gòu)解析的研究方面具有很多優(yōu)點(diǎn).對(duì)于解析結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物，2D NMR 技術(shù)具有簡(jiǎn)單、高效和可靠的特點(diǎn)[4-5]，在確定構(gòu)象異構(gòu)中也具有十分重要的作用.

根據(jù)文獻(xiàn)[6-9]報(bào)道，N-酰腙類化合物存在關(guān)于-CONH-基團(tuán)的R/S構(gòu)象異構(gòu)體，并在極性較大的溶劑，如二甲基亞砜-d6(DMSO-d6)中旋轉(zhuǎn)相互轉(zhuǎn)化，存在著兩種形式的構(gòu)象異構(gòu)體.本文分別對(duì)L-Fmoc-脯氨酸和D-Fmoc-脯氨酸的仲胺引入酰腙骨架，發(fā)現(xiàn)均可生成D型和L型脯氨酸類化合物.已有文獻(xiàn)[10]報(bào)道,此類化合物在2-(7-氮雜苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)作為偶聯(lián)劑的條件下，手性100%保持，通過質(zhì)譜和高效液相色譜法來(lái)確定產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和純度，但未見其結(jié)構(gòu)的解析.

我們利用質(zhì)譜和多種核磁共振技術(shù)[包括1H NMR、13C NMR、、1H-1H同核位移相關(guān)譜(1H-1H COSY)、1H-1H質(zhì)子全相關(guān)譜(1H-1H TOCSY)、1H-1H核Overhauser效應(yīng)譜(1H-1H NOESY)、無(wú)畸變的極化轉(zhuǎn)移增強(qiáng)法(DEPT135°)、1H-13C檢出1H的異核單量子相干(1H-13C HSQC)、1H-13C檢出1H的異核多鍵相關(guān)(1H-13C HMBC)及變溫1H NMR技術(shù)] 確定其結(jié)構(gòu)，對(duì)兩種同分異構(gòu)體的波譜學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了全面詳細(xì)的解析，并將所有的1H和13C NMR信號(hào)進(jìn)行了歸屬，分析了異構(gòu)體所占的比例.本文的研究結(jié)果對(duì)此類脯氨酸類的化合物構(gòu)象異構(gòu)體提供比較全面的參考依據(jù)，也為各種波譜學(xué)方法在結(jié)構(gòu)鑒定中提供應(yīng)用實(shí)例.

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LTQOrbitrap XL型質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；Bruker AVANCE Ⅲ 500 MHz型NMR超導(dǎo)譜儀(瑞士Bruker公司)；Bruker NEO 400 MHz型NMR超導(dǎo)譜儀(瑞士Bruker公司).

DMSO-d6(氘代率為99.8%，美國(guó)CIL公司)，含0.03%(v/v) 用于化學(xué)位移定標(biāo)的四甲基硅烷(TMS,δH0.00,δC0.0).其余試劑為分析純，均購(gòu)自科密歐.所有試劑均未經(jīng)進(jìn)一步提純，直接使用.

1.2 采樣參數(shù)

MS譜采集采用LTQ Orbitrap XL型質(zhì)譜儀， 配備ThermoXcalibur 2.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，ESI離子源，采用正模式進(jìn)行檢測(cè)，源噴射電壓為3.5 kV，鞘氣和輔助氣均為氮?dú)?，流速分別為15、5 L/min，加熱毛細(xì)管溫度350 ℃.1H NMR、1H-1H COSY、1H-1H TOCSY、1H-1H NOESY、13C NMR、DEPT135、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC譜均使用配備了5 mm PABBO BB探頭的Bruker AVANCE Ⅲ 500 MHz型NMR超導(dǎo)譜儀， 變溫1H NMR譜試驗(yàn)均使用Bruker NEO 400 MHz型NMR超導(dǎo)譜儀.

1.3 化合物合成路線

化合物合成路線如圖1所示.冰浴條件下，先將Fmoc-脯氨酸(500 mg，1.5 mmol)溶于10 mL二氯甲烷(DCM)中，然后加入O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(HATU，1.14 g，3 mmol)和N,N-二異丙基乙胺(DIPEA,0.5 mL，3 mmol)，保持0 ℃ 反應(yīng)1 h.接下來(lái)，再加入對(duì)氨基苯甲醇(185 mg，1.5 mmol)，繼續(xù)反應(yīng)6 h.最后，將反應(yīng)液減壓蒸餾，殘留物經(jīng)柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯的體積比為4∶1)，得到白色固體576 mg，收率87%.

圖1 化合物的合成路線Fig.1 Synthetic route of compound

1.4 NMR試驗(yàn)方法

1H NMR和13C NMR的工作頻率分別為500.13、125.73 MHz，試驗(yàn)溫度25 ℃，譜寬分別為10 330.58、29 761.9 Hz.1H 90°脈沖寬度為11.90 μs，13C 90°脈沖寬度為9.80 μs.二維譜包括2D梯度場(chǎng)COSY、HMBC、HSQC、TOCSY、NOESY譜，均采用標(biāo)準(zhǔn)脈沖程序.COSY的F2(1H) 和F1(1H) 維的譜寬為5 813.95 Hz，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)陣t2×t1=2 048×256，累積次數(shù)為4.TOCSY的F2(1H) 和F1(1H) 維的譜寬為5 411.26 Hz，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)陣t2×t1=2 048×256，累積次數(shù)為16.NOESY的F2(1H) 和F1(1H) 維的譜寬為5 411.26 Hz，混合時(shí)間為0.8 s, 采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)陣t2×t1=2 048×256，累積次數(shù)為16.HMBC的F2(1H) 和F1(13C) 維的譜寬分別為5 813.95、27 927.39 Hz，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)陣t2×t1=2 048×256，累積次數(shù)為32.HSQC的的F2(1H) 和F1(13C) 維譜寬分別為5 813.95、20 827.81 Hz，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)陣t2×t1=2 048×256，累積次數(shù)為32.

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的質(zhì)譜分析

正離子檢測(cè)模式檢測(cè)到質(zhì)荷比(m/z)為443.196 7[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，化合物的分子式為C27H26N2O4，精確分子量為442.196 2，和化合物的分子量一致.

2.2 化合物的NMR數(shù)據(jù)分析

以DMSO-d6作為溶劑測(cè)得化合物的1H和13C-NMR (如圖2所示)，觀察它的譜圖發(fā)現(xiàn)有明顯增多的現(xiàn)象，無(wú)論是在高場(chǎng)區(qū)還是低場(chǎng)區(qū)，質(zhì)子的信號(hào)數(shù)目均大于理論值，并且成對(duì)出現(xiàn)，推斷其化合物可能存在兩種立體構(gòu)象異構(gòu)體L型與D型.為了便于化合物的歸屬，將兩種異構(gòu)體的原子編號(hào)，如圖3所示.

圖2 化合物的1H和13C-NMRFig.2 1H NMR and 13C NMR spectra of compound

圖3 化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.3 Chemical structure of compound

根據(jù)文獻(xiàn)[6-7]，當(dāng)結(jié)構(gòu)中C=O的氧原子與N-H中的氫原子在同側(cè)時(shí)為順式構(gòu)象，絕對(duì)構(gòu)型為R，即為圖3結(jié)構(gòu)中的D型化合物.當(dāng)結(jié)構(gòu)中C=O的氧原子與N-H中的氫原子在異側(cè)時(shí)為反式構(gòu)象，絕對(duì)構(gòu)型為S，即為圖3結(jié)構(gòu)中的L型化合物.因而低場(chǎng)區(qū)δH10.13 (1H, s) 與δH9.98 (1H, s) 分別歸屬L型中的H-7和D型中的H-7’.

A環(huán)的歸屬：由HMBC (圖4)譜可知，H-7 (δH10.13) 和H-7’ (δH9.98) 分別與羰基C=O (δC170.8和δC170.5) 存在交叉峰，那么δC170.8與δC170.5可歸屬為C-6和C-6’.C-6 (δC170.8)又分別和δH2.32(1H, m) 與δH2.00 (1H, m) 存在著遠(yuǎn)程耦合，C-6’ (δC170.5) 也分別和δH2.19 (1H, m) 與δH1.95 (1H, m) 存在著遠(yuǎn)程耦合，可判斷出δH2.32 (1H, m) 與δH2.00 (1H, m) 歸屬于H-4，δH2.19 (1H, m) 與δH1.95 (1H, m) 歸屬于H-4’，質(zhì)子H-4和H-4’在CH2中的兩個(gè)原子由于構(gòu)型的原因，造成化學(xué)環(huán)境的不等價(jià)，分別呈現(xiàn)不同的化學(xué)位移值.再根據(jù)COSY譜(圖5)可知，H-4 (δH2.32) 與δH1.96 (1H, m) 存在交叉峰，因此δH1.96 (1H, m) 歸屬為H-3.H-4’ (δH2.19) 與δH1.89 (1H, m) 存在交叉峰，δH1.89 (1H, m) 歸屬為H-3’.同時(shí)H-4 (δH2.32) 與δH4.51 (1H, m) 存在交叉峰，故δH4.51 (1H, m) 歸屬為H-5.H-4’ (δH2.19) 與δH4.32 (1H, m) 存在交叉峰，δH4.32 (1H, m)歸屬為H-5’.H-3 (δH1.96) 與δH3.53 (1H, m)、δH3.45 (1H, m) 存在交叉峰，歸屬為H-2.H-3’ (δH1.89) 與δH3.47 (1H, m)、δH3.41 (1H, m)存在交叉峰，歸屬為H-2’.然后根據(jù)HSQC (圖6) 譜，可以繼續(xù)推斷出C-2 (δC47.3)、 C-2’ (δC46.5)、C-3 (δC24.0)、C-3’ (δC23.9)、C-4 (δC31.5)、C-4’ (δC30.2)、C-5 (δC59.9)、C-5’ (δC60.3).

圖4 化合物的1H-13C HMBC 全圖及部分放大圖Fig.4 Complete and partial expanded 1H-13C HMBC spectra of compound

圖5 化合物的1H-1H COSY 全圖及部分放大圖Fig.5 Complete and partial expanded 1H-1H COSY spectra of compound

B環(huán)的歸屬：δC46.7為C-16，H-7 (δH10.13) 和H-7’ (δH9.98) 還分別與δC119.0、δC118.9存在交叉峰，那么δC119.0與δC118.9可歸屬為C-9和C-9’，然后根據(jù)HSQC (圖6) 譜，得知C-9 (δC119.0)和δH7.62 (2H,d)有相關(guān)點(diǎn)，確定δH7.62為H-9.C-9’(δC118.9)和δH7.54 (2H,d)有相關(guān)點(diǎn)，確定δH7.54為H-9’.由COSY譜(圖5)可知，H-9 (δH7.62)和δH7.25存在著遠(yuǎn)程耦合，H-9’ (δH7.54) 和δH7.23存在著遠(yuǎn)程耦合，分別歸屬為H-10和H-10’.由HSQC (圖6) 譜，可以歸屬δC126.8為C-10和C-10’，兩者化學(xué)位移值相同.由HMBC(圖4)譜看出，H-10 (δH7.25)與H-10’ (δH7.23)和δC137.6存在著遠(yuǎn)程耦合，將其歸屬成C-8.H-9 (δH7.62)和δC137.5存在著遠(yuǎn)程耦合，將其歸屬成C-11, H-9’ (δH7.54)和δC137.3存在著遠(yuǎn)程耦合，將其歸屬成C-11’.

圖6 化合物的1H-13C HSQC全圖及部分放大圖Fig.6 Complete and partial expanded 1H-13C HSQC spectra of compound

C環(huán)的歸屬：根據(jù)13C NMR譜(圖2)可知，δC153.9可以直接歸屬為C-14.由HMBC(圖4)譜看出，C-14 (δC153.9) 與δH4.29 (2H, m)、δH4.23 (1H, m)、δH4.09 (1H, m)存在著遠(yuǎn)程耦合相關(guān)峰，將δH4.29 (2H, m)歸屬為H-15，δH4.23和δH4.09歸屬為H-15’.由HSQC譜(圖6)可知， H-15 (δH4.29)和δC66.5有交叉峰，可將其歸屬是C-15，H-15’ (δH4.23和δH4.09) 和δC67.1有交叉峰，可將其歸屬是C-15’.由TOCSY譜(圖7)可知，δH7.35 (1H, t)、δH7.43 (1H, t) 、

圖7 化合物的1H-1H NOESY全圖及1H-1H TOCSY部分放大圖Fig.7 Complete 1H-1H NOESY and partial expanded1H-1H TOCSY spectra of compound

δH7.68 (1H, t)與δH7.91 (1H, d)相互之間存在交叉峰，可以判斷出這4個(gè)原子處于同一個(gè)自旋系統(tǒng)內(nèi).而δH7.07 (1H, m)、δH7.33 (1H, t)、δH7.58(1H, m)與δH7.82 (1H, d) 相互之間存在交叉峰，可以判斷出這4個(gè)原子處于同一個(gè)自旋系統(tǒng)內(nèi).由NOESY譜(圖7)可知，H-15 (δH4.29)與δH7.68 (1H, t)存在交叉峰，證明H-15與其有空間的耦合，確定δH7.68歸屬為H-18.由COSY譜(圖5)可知，H-18 (δH7.68)與δH7.35 (1H, t)存在遠(yuǎn)程耦合，確定δH7.35為H-19.同理可得，H-19 (δH7.35)與δH7.43 (1H, t)存在遠(yuǎn)程耦合，確定δH7.43為H-20.H-20 (δH7.43)與δH7.91 (1H, d)存在遠(yuǎn)程耦合，確定δH7.91為H-21.

對(duì)于另一個(gè)構(gòu)型中C環(huán)的歸屬，由于沒有直接的相關(guān)點(diǎn)可以依據(jù)，我們從兩種構(gòu)型相似原子的化學(xué)位移值相近的經(jīng)驗(yàn)出發(fā)，確定δH7.82 (1H, d)歸屬是D型中的H-21’.再根據(jù)COSY譜(圖5)可知，依次推斷出δH7.33 (1H, t) 歸屬是D型中的H-20’，δH7.07 (1H, m) 歸屬是D型中的H-19’，δH7.58 (1H, m) 歸屬是D型中的H-18’.然后根據(jù)HSQC (圖6) 譜中各原子對(duì)應(yīng)的相關(guān)點(diǎn)，找出碳原子的歸屬，即δC46.7為C-16、δC46.6為C-16’、δC125.1為C-18、δC125.2為C-18’、δC127.1為C-19、δC127.0為C-19’、δC127.6為C-20、δC127.5為C-20’、δC120.1為C-21、δC120.0為C-21’.

由HMBC(圖4)譜可知，H-21 (δH7.91)與δC143.9存在著遠(yuǎn)程耦合，H-21’ (δH7.82) 與δC143.6存在著遠(yuǎn)程耦合，因此將δC143.9歸屬于C-17，δC143.6歸屬于C-17’.H-18 (δH7.68) 與δC140.7存在著遠(yuǎn)程耦合，H-18’ (δH7.58) 與δC140.5存在著遠(yuǎn)程耦合，因此將δC140.7歸屬于C-22,δC140.5歸屬于C-22’.H-18 (δH7.68) 與δC46.7存在遠(yuǎn)程耦合，確定δC46.7為C-7，H-18’ (δH7.58) 與δC46.6存在遠(yuǎn)程耦合，確定δC46.6為C-7’.再根據(jù)HSQC (圖6) 譜，可以確定δH4.29 (1H, m)是H-16,δH4.09(1H, m)是H-16’.

在HSQC (圖6) 譜中，δH5.09 (1H, m) 無(wú)對(duì)應(yīng)13C的相關(guān)峰，且在變溫試驗(yàn) (圖8) 中隨溫度變化化學(xué)位移值變化明顯，說明此質(zhì)子是活潑氫-OH，歸屬為H-13.根據(jù)COSY譜 (圖5)， H-13與δH4.43 (2H, m) 存在交叉峰，歸屬為H-12, 再由HSQC譜 (圖6) 即可確定相應(yīng)的C-12 (δC62.5).

化合物脯氨酸類N-酰腙衍生物的兩種構(gòu)象異構(gòu)體(L型和D型)的1H和13C-NMR 信號(hào)歸屬完成(如表1所列).

在變溫1H NMR譜(圖8)中，當(dāng)隨著溫度的升高(25～80 ℃)時(shí)，H-7與H-7’、H-18與H-18’、H-19與H-19’、H-20與H-20’、H-21與H-21’信號(hào)峰逐漸合并，說明化合物是以兩種構(gòu)象異構(gòu)體(L型和D型)混合物形式存在，高溫時(shí)因?yàn)镃(O)-N單鍵的快速旋轉(zhuǎn)使它們的信號(hào)峰合并.根據(jù)1H NMR譜(圖2)中H-7與H-7’積分峰面積的比值，可以算出化合物中L型和D型的含量分別是50%和50%.由上述討論可以確定化合物的兩種構(gòu)型的結(jié)構(gòu).

圖8 化合物的變溫1H NMRFig.8 1H NMR spectra of compound under various temperature

表1 化合物的1H和13C NMR 歸屬(DMSO-d6, 500 MHz)Table 1 1H and 13C NMR data of compound (DMSO-d6, 500 MHz)

注：括號(hào)內(nèi)表示異構(gòu)體L的信息，括號(hào)外表示異構(gòu)體D的信息.

3 結(jié)論

運(yùn)用1D和2D NMR技術(shù)，對(duì)脯氨酸類N-酰腙衍生物的兩種構(gòu)象異構(gòu)體(L型和D型)的1H NMR和13C NMR信號(hào)峰進(jìn)行了全歸屬，確證了它們立體化學(xué)結(jié)構(gòu)的比例.試驗(yàn)結(jié)果表明，室溫下在DMSO中L型和D型的順反異構(gòu)體以相同的比例同時(shí)存在.本文為脯氨酸類N-酰腙衍生物結(jié)構(gòu)鑒定提供了有效補(bǔ)充，具有很好的參考意義.